于翱瑞， 曹亞飛， 林文平， 高坤， 張少群， 李偉，覃國(guó)忠， 霍青云， 曾凡宇， 張蕓

[1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳平樂骨傷科醫(yī)院（深圳市坪山區(qū)中醫(yī)院） 正骨科， 廣東 深圳518000； 2.深圳市中醫(yī)院 骨傷科， 廣東 深圳 518118； 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳平樂骨傷科醫(yī)院（深圳市坪山區(qū)中醫(yī)院） 脊柱科， 廣東 深圳 518000； 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳平樂骨傷科醫(yī)院（深圳市坪山區(qū)中醫(yī)院） 質(zhì)控科， 廣東 深圳 518000]

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis, AS）是一種與人類白細(xì)胞抗原B27 基因（human leukocyte antigen B27, HLA-B27）相關(guān)的慢性炎癥性疾病[1-2]。非類固醇抗炎藥是該病的傳統(tǒng)治療方法，但具有并發(fā)癥多的缺點(diǎn)[3-4]。近年來(lái)，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）抑制劑這一新型生物制劑引入臨床，其可以緩解AS 患者臨床癥狀，但是在阻止疾病進(jìn)程方面療效欠佳[5-6]。有研究表明，AS 患者較健康人群具有更高的心血管病風(fēng)險(xiǎn)，且AS 還是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的高危因素[7-8]。

隨著對(duì)AS 認(rèn)識(shí)的不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)AS 的發(fā)生可能與炎性介質(zhì)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān)[9-10]。CD36＋在單核細(xì)胞、血小板等細(xì)胞表面表達(dá)，主要作為一種黏附分子，參與動(dòng)脈粥樣硬化等病理過(guò)程[11-12]。單核巨噬細(xì)胞是非特異性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及免疫過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞CD36＋表達(dá)在單核細(xì)胞激活和調(diào)節(jié)炎癥因子方面發(fā)揮重要作用[13-14]。炎癥因子能夠抑制單核細(xì)胞中CD36＋表達(dá)，而AS 作為一種全身性炎癥疾病，其發(fā)病可能與單核細(xì)胞CD36＋表達(dá)有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響CD206＋、CD68＋單核細(xì)胞水平，緩解AS 病情[15-16]。為更進(jìn)一步探究AS 的發(fā)病機(jī)制，提高臨床療效，本研究將探討AS 患者外周血不同類型單核細(xì)胞極化與患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，旨在為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用病例對(duì)照研究，選取2020 年1 月—2021 年12 月廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳平樂骨傷科醫(yī)院收治的AS 患者71 例（AS 組），以及年齡、性別基本匹配的體檢志愿者80 例作為對(duì)照組。兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index, BMI）、吸煙、飲酒情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性（見表1）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)（No：院倫[2019]-0017-003），所有患者對(duì)本研究知情同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①AS 組患者符合AS 診斷標(biāo)準(zhǔn)[17]，B27 檢查為陽(yáng)性，CT、MRI 檢查顯示患者脊柱結(jié)構(gòu)改變（骶髂關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，可見關(guān)節(jié)邊緣模糊，可以看到非常明確的骨質(zhì)的囊性變）；②年齡19～65 歲；③AS 患者均在廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳平樂骨傷科醫(yī)院接受檢查、治療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并高血壓、糖尿病、代謝性疾病、全身感染性疾??；②合并其他類型免疫系統(tǒng)疾?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等）；③合并血液系統(tǒng)疾病、血液腫瘤等；④近3 個(gè)月有糖皮質(zhì)激素治療史；⑤合并哮喘、支氣管感染等疾??；⑥伴有原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥等。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD36＋、CD68＋和CD206＋

所有患者采集血液前禁食8 h，于清晨采集靜脈血4 mL，離心取血清備用。于單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入5%來(lái)源于AS 患者和健康志愿者的血清。兩組細(xì)胞均放置于37 ℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)48 h。收集單核巨噬細(xì)胞，磷酸緩沖液（phosphate buffer solutions, PBS）清洗后加入100 μL PBS 懸浮，加入抗人PE-CD36、抗人PE-CD68 和抗人Cy7-CD206 的熒光抗體，避光孵育10 min 后加入400 μL PBS 混勻，細(xì)胞液經(jīng)尼龍膜過(guò)濾后用HPC-100 流式細(xì)胞儀（加拿大Handyem 公司）檢測(cè)，計(jì)算CD36＋、CD68＋和CD206＋單核細(xì)胞比例。

1.4 治療方法

口服柳氮磺吡啶（北京市燕京藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H11020475，0.25g），0.75g/次，2 次/d；同時(shí)給予沙利度胺（常州制藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32026130，50 mg）口服治療，初始劑量為50 mg/d，10 d 后調(diào)整劑量至100 mg/d，并維持治療3 個(gè)月。指導(dǎo)患者自發(fā)進(jìn)行漸進(jìn)式腰背功能鍛煉，鍛煉強(qiáng)度以不增加患者疼痛感為主，鍛煉2 次/d。

1.5 觀察指標(biāo)

所有患者采集血液前禁食8 h，于清晨采集空腹靜脈血4 mL。3 000 r/min 離心10 min，取血清采用免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M, IgM）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A, IgA）及C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）水平。采用Monior-100 血沉儀（意大利Vital 公司）枸櫞酸鈉抗凝全血檢測(cè)血沉（erythrocyte sedimentation rate, ESR）。

記錄治療前后患者強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動(dòng)指數(shù)（bath ankylosing spondylitis disease activity index,BASDAI）。BASDAI 包含身體困倦程度，頸部、背部、髖部的疼痛程度，除去頸部、背部、髖部外的其他關(guān)節(jié)的疼痛腫脹程度，早起后腰背部僵硬程度，從起床開始后的腰背部僵硬持續(xù)時(shí)間等7 個(gè)問(wèn)題，每個(gè)問(wèn)題用視覺模擬評(píng)分（visual analogue scale，VAS）進(jìn)行評(píng)價(jià)，總分0～10 分，評(píng)分越高表示病情越嚴(yán)重[18]。

記錄治療前后Bath 強(qiáng)直性脊柱炎功能指數(shù)（bath ankylosing spondylitis functional index, BASFI）。BASFI 主要包含患者是否無(wú)須他人幫助或借助工具穿上襪子或緊身衣，無(wú)須工具幫助可從地上撿起鋼筆或其他物品，無(wú)須工具幫助可觸及高架上的物品，無(wú)須工具和其他人幫助可從無(wú)扶手椅子上站立起來(lái)，躺在地板上可無(wú)須幫助地站立起來(lái)等9 個(gè)問(wèn)題，每個(gè)問(wèn)題采用VAS 評(píng)分，總分0～10 分，評(píng)分越高表示病情越嚴(yán)重[19]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組炎癥指標(biāo)、免疫球蛋白水平比較

AS 組與對(duì)照組CRP、ESR、IgG、IgM、IgA、TNFα、IL-6 水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），AS 組均高于對(duì)照組。見表2。

表2 兩組炎癥指標(biāo)、免疫球蛋白水平比較 （±s）

表2 兩組炎癥指標(biāo)、免疫球蛋白水平比較 （±s）

組別n CRP/（mg/L）ESR/（mm/h）IgG/（g/L）IgM/（g/L）IgA/（g/L）TNF-α/（ng/L）IL-6/（ng/L）AS組對(duì)照組t 值P 值71 80 22.67±5.52 2.84±0.67 31.881 0.000 38.61±7.90 9.64±2.30 31.348 0.000 13.61±2.90 10.73±2.00 7.168 0.000 1.39±0.28 1.22±0.25 3.942 0.000 2.89±0.84 1.80±0.58 9.362 0.000 8.67±2.94 2.60±0.71 17.895 0.000 15.59±4.48 2.92±0.77 24.895 0.000

2.2 兩組不同類型單核細(xì)胞比例比較

AS 組與對(duì)照組外周血CD36＋、CD206＋、CD68＋細(xì)胞比例比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AS 組外周血CD36＋、CD206＋細(xì)胞比例低于對(duì)照組，AS 組外周血CD68＋細(xì)胞比例高于對(duì)照組。見表3。

表3 兩組不同類型單核細(xì)胞比例比較 （%， ±s）

表3 兩組不同類型單核細(xì)胞比例比較 （%， ±s）

組別n CD36＋CD206＋CD68＋AS組對(duì)照組t 值P 值71 80 5.40±1.73 9.84±2.78-11.608 0.000 9.66±2.30 27.51±4.28-31.346 0.000 62.75±9.84 43.02±5.51 15.420 0.000

2.3 不同類型單核細(xì)胞與AS 患者脊柱結(jié)構(gòu)破壞指數(shù)的相關(guān)性

AS 患者BASDAI 評(píng)分為（55.74±10.58）分、BASFI 評(píng)分為（71.62±14.28）分。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD36＋、CD206＋與BASDAI 評(píng)分、BASFI評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），CD68＋與BASDAI 評(píng)分、BASFI 評(píng)分均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 脊柱結(jié)構(gòu)破壞指數(shù)與單核細(xì)胞的相關(guān)性

2.4 治療前后炎癥指標(biāo)、免疫球蛋白水平比較

AS 患者治療前后CRP、ESR、IgG、IgM、IgA、TNFα、IL-6 水平比較，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療后較治療前均降低。見表5。

表5 AS患者治療前后炎癥指標(biāo)、免疫球蛋白水平比較 （n =71， ±s）

表5 AS患者治療前后炎癥指標(biāo)、免疫球蛋白水平比較 （n =71， ±s）

時(shí)間CRP/（mg/L）ESR/（mm/h）IgG/（g/L）IgM/（g/L）IgA/（g/L）TNF-α/（ng/L）IL-6/（ng/L）治療前治療后t 值P 值22.67±5.52 9.66±2.74 17.789 0.000 38.61±7.90 13.20±4.16 23.981 0.000 13.61±2.90 11.75±2.73 3.935 0.000 1.39±0.28 1.30±0.22 2.130 0.035 2.89±0.84 2.13±0.77 5.620 0.000 8.67±2.94 5.51±1.67 7.875 0.000 15.59±4.48 6.34±2.00 15.887 0.000

2.5 AS 患者治療前后不同類型單核細(xì)胞、脊柱結(jié)構(gòu)破壞指數(shù)比較

AS 患者治療前后CD36＋、CD206＋、CD68＋細(xì)胞比例及BASDAI 評(píng)分、BASFI 評(píng)分比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后AS患者CD36＋、CD206＋細(xì)胞比例較治療前升高，CD68＋細(xì)胞比例及BASDAI 評(píng)分、BASFI 評(píng)分較治療前降低。見表6。

表6 AS患者治療前后不同類型單核細(xì)胞、脊柱結(jié)構(gòu)破壞指數(shù)比較 （n =71， ±s）

表6 AS患者治療前后不同類型單核細(xì)胞、脊柱結(jié)構(gòu)破壞指數(shù)比較 （n =71， ±s）

時(shí)間CD36＋/%CD206＋/%CD68＋/%BASDAI評(píng)分BASFI評(píng)分治療前治療后t 值P 值5.40±1.73 7.92±2.44-7.099 0.000 9.66±2.30 20.38±4.91-16.660 0.000 62.75±9.84 49.33±7.86 8.979 0.000 55.74±10.58 33.81±7.71 14.115 0.000 71.62±14.28 41.03±8.83 15.352 0.000

3 討論

AS 發(fā)病涉及遺傳、環(huán)境（細(xì)菌感染）及個(gè)體因素（免疫學(xué)異常），其中遺傳因素起主導(dǎo)作用[20]。臨床上一直在找尋可以評(píng)估AS 疾病活動(dòng)度的方法，但是尚無(wú)“金標(biāo)準(zhǔn)”，仍需進(jìn)一步深入研究。

炎癥反應(yīng)是AS 起病及病情發(fā)展過(guò)程中的重要特征，AS 早期病理特征常伴有關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜的增生、淋巴樣浸潤(rùn)，后期可造成骨骼的侵蝕、軟骨的破壞及新骨形成，最終發(fā)生骨性強(qiáng)直[21-22]。本研究結(jié)果顯示，AS 組TNF-α、IL-6 水平均顯著高于對(duì)照組。分析其原因?yàn)镮L-6 可促進(jìn)Th17 細(xì)胞分泌，激活其功能，抑制Treg 細(xì)胞功能，從而間接促進(jìn)AS 的發(fā)生、發(fā)展。ESR、CRP 常用于評(píng)估風(fēng)濕性疾病活動(dòng)，其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[23-24]。本研究中AS 患者CRP 水平升高，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[25]。ESR 增加程度與組織損傷程度呈正相關(guān)，對(duì)于AS 具有一定的篩查價(jià)值。本研究結(jié)果表明，AS患者ESR 水平升高，與以往研究一致[26]。從本研究治療后反應(yīng)上看，TNF-α、IL-6、ESR、CRP 水平降低，說(shuō)明炎癥反應(yīng)控制后也會(huì)相應(yīng)地減輕結(jié)構(gòu)性損傷。也有研究提示，炎癥控制后，可能還會(huì)促進(jìn)AS患者病理性新骨形成進(jìn)程[27]。炎癥在消退的同時(shí)可能參與了組織修復(fù)、新骨形成的過(guò)程。免疫球蛋白是機(jī)體重要免疫系統(tǒng)，AS 作為一種慢性自身免疫性疾病，在活動(dòng)期常伴有免疫球蛋白水平異常[28]。本研究結(jié)果表明，AS 組IgG、IgM、IgA 水平均顯著高于對(duì)照組；治療后，AS 患者IgG、IgM、IgA 水平較治療前均顯著降低，提示上述指標(biāo)變化可作為AS 診斷、病情評(píng)估、療效觀察的重要佐證。

眾多研究表明，CD36+表達(dá)參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成，且其高表達(dá)與糖尿病、心血管疾病及中風(fēng)有關(guān)[29-30]。然而，CD36＋表達(dá)與AS 關(guān)系的研究較少，因此，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析AS 患者CD36＋的表達(dá)。結(jié)果顯示，AS 患者外周血CD36+細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組；且CD36＋與BASDAI 評(píng)分、BASFI 評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明CD36＋的表達(dá)在AS 患者中下調(diào)，下降程度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。眾所周知，AS與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎類似，屬于全身炎癥反應(yīng)的自身免疫性疾病，CD36＋細(xì)胞比例降低意味著機(jī)體炎癥反應(yīng)加劇，對(duì)骶髂關(guān)節(jié)及周圍關(guān)節(jié)組織造成損傷，這對(duì)評(píng)估AS 病情程度具有重要意義。

除探究外周血CD36＋細(xì)胞比例外，本研究還納入其他2 種單核細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，AS 組外周血CD206＋細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，而CD68＋細(xì)胞比例則高于對(duì)照組；前者與BASDAI 評(píng)分、BASFI 評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，后者則與BASDAI 評(píng)分、BASFI 評(píng)分均呈正相關(guān)。治療后AS 患者CD206＋、CD68＋細(xì)胞比例得到改善，提示上述指標(biāo)變化與AS 病情嚴(yán)重程度相關(guān)，且可以治療指導(dǎo)。分析AS 患者CD206＋、CD68＋細(xì)胞變化的機(jī)制可能是金屬蛋白酶通過(guò)影響巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的攝取，影響CD206＋、CD68＋；另一方面，炎癥因子可通過(guò)調(diào)節(jié)CD206＋、CD68＋啟動(dòng)子來(lái)影響其表達(dá)。推測(cè)單核細(xì)胞CD206＋、CD68＋的表達(dá)可能受機(jī)體炎癥的影響。治療方案如果改善了炎癥因子水平可能就會(huì)改善CD206＋、CD68＋水平。

有研究探究了AS 患者CD36＋在炎癥環(huán)境下的改變，但是沒有監(jiān)測(cè)其藥物治療前后的改變[31]。本研究則在既往研究的基礎(chǔ)上又納入2 種單核細(xì)胞，一并探究其對(duì)AS 的評(píng)估價(jià)值及治療前后的變化，取得了理想的研究成果，因此考慮檢測(cè)CD36＋、CD206＋、CD68＋可以作為判斷AS 患者疾病活動(dòng)度及療效的指標(biāo)。

綜上所述，AS 患者外周血CD36＋、CD206＋細(xì)胞比例降低，CD68＋細(xì)胞比例升高，與疾病嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系。