王 鶴 周青云 戴關(guān)海 陳 佳#

1 杭州市臨平區(qū)中醫(yī)院 浙江杭州 311106

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江杭州 310053

3 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江杭州 310007

腦出血（ICH）是最常見的腦卒中亞型，是腦血管病中極為危重的病變之一，具有較高的致死率和致殘率，占卒中的10%～15%[1]。血瘀是貫穿ICH 整個過程的特點(diǎn)，活血化瘀是該病的總治法。三七皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）是中藥三七的提取物，多項(xiàng)研究表明其對腦缺血再灌注、腦血腫吸收、腦組織及神經(jīng)損傷修復(fù)均有明顯療效[2，3]。但三七皂苷分子量大，脂溶性低，不易透過血腦屏障（blood brain barrier，BBB），影響其藥效的發(fā)揮[4]。外泌體是一類直徑40～160nm 的納米級囊泡小體，作為信息的載體，可以靶向性傳遞生物學(xué)信息，通過表面粘附蛋白的相互作用轉(zhuǎn)運(yùn)到周圍或者遠(yuǎn)程的受體細(xì)胞從而影響受體細(xì)胞的生物功能[5],在炎癥、損傷、腫瘤、免疫等疾病治療方面的作用已被公認(rèn)，同時，外泌體具有特殊的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，可作為治療藥物的載體，高效地透過血腦屏障，更好地發(fā)揮中藥的療效[6]。本研究采用自體血注射構(gòu)建ICH大鼠模型，給予三七皂苷血清外泌體干預(yù)，觀察其對ICH 大鼠腦組織炎癥的影響，為中藥治療ICH 提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物：雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2021-0006，實(shí)驗(yàn)動物使用合格證號：SCXK（浙）2019-0010。本研究經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院倫理委員會審批，倫理審批號：浙中研動物倫理審字第〔2022〕049號。

1.2 藥物：三七皂苷，購于廣西梧州制藥股份有限公司。

1.3 主要儀器及耗材：全自動立體定向儀（71000，瑞沃德）、超高速離心機(jī)（Optima XPN-100，貝克曼）、透射電子顯微鏡（JE-OL）、納米粒徑檢測儀（ZetaView PMX 110）、Wes 全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)（Protein Simple）、Anti-CD63 抗體、Anti-TSG101 抗體和Anti-Hsp70 抗體（abcom），PrimeScript RT reagent Kit 和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）。Rat IL1β ELISA Assay Kit（Proteintech）、Rat IL-6 ELISA Assay Kit、Rat NF-κB ELISA Assay Kit（CUSABIO）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 三七皂苷血清外泌體制備、提取及鑒定：三七皂苷100mg/kg·day 連續(xù)腹腔注射7 天后，收集血清。采用經(jīng)典差數(shù)超速離心法獲取三七皂苷血清外泌體。離心速度分別為：300×g，4℃，10min 取上清；3000×g，4℃，15min取上清；10000×g，4℃，15min取上清，過0.22μm濾器；繼續(xù)離心100000×g，4℃，120min，取沉淀重懸至50～200μL PBS 中，此為外泌體混懸液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)、納米顆粒跟蹤分析平臺分析外泌體濃度和粒徑、全自動Western Blot分析儀檢測外泌體標(biāo)志性蛋白表達(dá)。

2.2 腦出血大鼠模型構(gòu)建及分組：Wistar 大鼠稱重，以0.3mL/100g 的10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后將動物俯臥固定在立體定位儀上：沿頭皮正中作一長10mm 切口，暴露前囟，定位（前囟前0.2mm，中線右旁開3mm，垂直進(jìn)針5.5mm為大鼠右側(cè)尾殼核區(qū)），用小型牙科鉆，鉆透顱骨至硬腦膜處；微量注射器穿刺尾動脈，抽取自體動脈血，采用“兩次注血法”（進(jìn)針至尾狀核，先注入10μL，停針2min，繼續(xù)緩慢均勻注入40μL）；局部用醫(yī)用骨蠟封閉，皮膚逐層縫合；術(shù)后大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察自由活動及進(jìn)食水，根據(jù)Zea Longa 評分方法，以評分大于3 分為造模成功。將造模的大鼠隨機(jī)分成三七皂苷血清外泌體組（三七皂苷血清外泌體，20μg/day）、三七皂苷組（三七皂苷，100mg/kg）、模型組（等體積生理鹽水），另設(shè)正常大鼠（等體積生理鹽水）作為對照組。干預(yù)方式均采用尾靜脈注射，連續(xù)10天。

2.3 指標(biāo)檢測：病理：實(shí)驗(yàn)結(jié)束，麻醉大鼠后解剖取材，標(biāo)本為全腦組織。每組取3只大鼠腦組織在福爾馬林中充分固定、石蠟包埋及切片，蘇木素染色及中性樹膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察，采集圖像并分析。RT-PCR 檢測腦組織中炎癥因子核酸水平：使用Trizol 試劑提取腦組織損傷部位總RNA；采用Prime Scrip RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；通過TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒檢測炎癥基因NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平。引物委托上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成引物，內(nèi)源性參考基因?yàn)棣?actin。基因序列為：NF-κB（FTGTGGTGGAGGACTTGCTGAGG；RAGTGCTGCCTTGCTGTTCTTGAG）NLRP-3（FCTGCTGTGCGTGGGACTGAAG；R-AGAACCAATG CGAGATCCTGACAAC）IL-6（F-ACTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTG；R-TGGTCTGTTGTGGGTGGTATCCTC）TNF-α（FCACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC；RTGGGCTACGGGCTTGTCACTC）β-actin（FGGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA；R-GACTCATCGTA CTCCTGCCTGCTG）。ELISA 檢測腦組織勻漿中NF-κB、IL-6、IL1β水平：取腦出血周圍組織100mg勻漿處理，按照ELISA試劑盒操作方法檢測。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)由SPSS 25 軟件處理。各組間計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異分析比較采用ANOVA單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 外泌體鑒定：采用經(jīng)典的差速超速離心法提取血清外泌體，通過透射電子顯微鏡檢測呈典型的雙層脂膜的類圓形囊泡結(jié)構(gòu)（見圖1A）；納米顆粒追蹤分析（NTA）實(shí)驗(yàn)顯示直徑為113.1nm 外泌體的比例為96.6%，顆粒濃度為2.8×1010個/mL（見圖1B）；全自動Western Blot蛋白表達(dá)分析儀分析結(jié)果顯示外泌體特征性標(biāo)志蛋白TSG101、CD63、Hsp70 均呈陽性表達(dá)（見圖1C）。證實(shí)所提取的微囊泡為血清外泌體。

圖1 外泌體鑒定結(jié)果

4.2 對各組腦組織病理影響：對照組的腦組織結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組出血部位腦組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂，可見大量紅細(xì)胞，炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，水腫明顯；三七皂苷組及三七皂苷外泌體組腦出血部位表現(xiàn)紅細(xì)胞及炎癥細(xì)胞呈不同程度的減少，以三七皂苷血清外泌體組最為顯著。見圖2。

圖2 腦組織病理結(jié)果（HE染色，200×）

4.3 對腦出血損傷周圍組織中炎癥核酸水平表達(dá)影響：RT-PCR 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組腦出血周圍腦組織中炎癥因子NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α mRNA 因子核酸水平表達(dá)明顯上調(diào)，而經(jīng)過三七皂苷及三七皂苷血清外泌體治療后，兩組的炎癥因子NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α mRNA 均有下調(diào)，其中，三七皂苷血清外泌體組的作用效應(yīng)顯著優(yōu)于三七皂苷組。見表1。

表1 三七皂苷血清外泌體對腦組織中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響（±s，2-△△ct）

表1 三七皂苷血清外泌體對腦組織中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響（±s，2-△△ct）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

分組對照組模型組三七皂苷組三七皂苷血清外泌體組n6 6 6 6 NF-κB 1.33±0.19#4.83±1.62*3.07±1.22*1.55±0.35#NLRP-3 1.56±0.34#3.00±0.94*2.61±0.53*1.95±0.30#IL-6 1.74±0.63#3.16±1.08*2.94±1.16*1.93±0.66#TNF-α 0.59±0.35#1.62±0.19*1.28±0.26*0.73±0.13#

4.4 對腦出血損傷周圍組織中炎癥蛋白水平表達(dá)影響：ELISA 結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組腦出血周圍腦組織中NF-κB、IL-1β及IL-6含量顯著增加。經(jīng)過三七皂苷及三七皂苷血清外泌體治療后，兩組的NF-κB、IL-1β及IL-6含量均明顯降低，其中，以三七皂苷血清外泌體組下降最為顯著。見表2。

表2 三七皂苷血清外泌體對腦組織中炎癥因子蛋白水平影響（±s，pg/mL）

表2 三七皂苷血清外泌體對腦組織中炎癥因子蛋白水平影響（±s，pg/mL）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

分組對照組模型組三七皂苷組三七皂苷血清外泌體組n6 6 6 6 NF-κB 1.41±0.35#3.97±0.67*3.02±0.55*1.97±0.51#IL-1β 31.35± 8.17#102.50±16.15*77.32±15.33*46.15±15.84#IL-6 33.08±5.70#75.53±7.36*55.20±3.88*39.32±3.94#

5 討論

研究顯示ICH 逐年增高的發(fā)病率，高昂的醫(yī)療費(fèi)用，患者勞動及自理能力的缺失，造成了我國嚴(yán)重的社會和家庭負(fù)擔(dān)，早期有效的防治是減少并發(fā)癥的有效手段[7]。ICH 是一種出血性卒中，其特征是血管中的血液破入腦實(shí)質(zhì)，ICH 發(fā)生后，局部中樞系統(tǒng)和全身免疫應(yīng)答相繼被激活，血腫、促炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等造成了腦組織損傷[8]。促炎癥細(xì)胞因子NF-κB、NLRP-3、TNFα和IL-6等增加以及白細(xì)胞浸潤導(dǎo)致內(nèi)皮和細(xì)胞外基質(zhì)的功能障礙，與腦損傷和長期殘疾密切相關(guān)[9，10]。促進(jìn)血腫吸收，減輕炎癥水平對腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)極為重要[11]。

ICH 中醫(yī)上歸屬于中風(fēng)范疇，病位在腦，由于多種因素導(dǎo)致血行滯緩，腦血脈運(yùn)行不暢，血溢出脈外，瘀阻腦絡(luò)而病。故從形態(tài)學(xué)及病理學(xué)上不難得出“瘀血”為該病常見證型[12]。針對血瘀證，要以活血化瘀為其主要治療方法。三七素有“止血不留瘀，活血不傷正”的美名，為傷科用藥之首選。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療血瘀證有著一定的臨床基礎(chǔ)。本研究著眼于腦組織炎癥及病理改善，采用三七有效成分三七皂苷制備血清外泌體，在治療形式上是一種創(chuàng)新。通過研究發(fā)現(xiàn)，三七皂苷血清外泌體可更好地改善腦出血導(dǎo)致的血腫、炎癥、損傷等，這與外泌體在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)研究的結(jié)果一致[5]。這可能與其跨血腦屏障的治療藥物的輸送，更好發(fā)揮腦組織內(nèi)藥效有關(guān)。為中藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新手段。

綜上，本研究表明三七皂苷血清外泌體作為生物活性物質(zhì)可有效改善大鼠腦出血后腦組織炎癥水平，緩解病理損傷，對腦出血損傷具有一定保護(hù)作用。