摘 要 以核桃青皮為原材料，采用氯化膽堿-乳酸形成的低共熔溶劑（DES）提取核桃青皮中的黃酮，通過單因素試驗探究DES摩爾比、含水率、固液比、提取時間和溫度對黃酮提取得率的影響，并在此基礎上利用響應面優(yōu)化其提取工藝。結果表明：氯化膽堿-乳酸（摩爾比1∶3），溶劑含水率30%，固液比0.1∶15 g·mL-1，提取溫度74 ℃，提取時間1.5 h，黃酮類化合物提取得率為57.518 mg·g-1，高于乙醇提取得率，且DES提取物的抗氧化能力比乙醇提取物更好。因此，該DES作為綠色的溶劑體系能高效提取核桃青皮黃酮類化合物，且能夠保持良好的抗氧化活性。

關鍵詞 核桃青皮；低共熔溶劑（DES）；黃酮；響應面優(yōu)化

中圖分類號：S664.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.23.025

核桃（Juglans regia L.），是世界上四大堅果之一。在中國，核桃的栽培歷史可以追溯到幾千年前，種植面積大且產(chǎn)量位居世界第一。核桃青皮中含有豐富的黃酮類、萘醌類、酚酸類和環(huán)二芳基庚烷等生物活性物質，具有多種生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、抑菌和消炎[2-4]。但實際生產(chǎn)加工中，核桃青皮被大量丟棄在田野、地頭或溝壑之間[1]，不僅浪費了資源，而且造成了環(huán)境污染。黃酮是核桃青皮中的主要次級代謝產(chǎn)物之一，黃酮類化合物的功效和作用有抗氧化、抗炎、抗癌等[5-9]。目前，提取植物中的黃酮類物質主要使用甲醇、乙醇和石油醚等有機溶劑。這些有機試劑不僅會造成環(huán)境污染，而且不可再生。因此，學者們一直在尋找可以替代傳統(tǒng)溶劑的新型溶劑，如離子溶劑[10]。離子溶液雖無污染，但黏度較大，回收處理不方便。因此，探索一種簡便、綠色、高效的核桃青皮黃酮提取方法十分有必要。

近年來，低共熔溶劑（DES）作為一種綠色的溶劑體系，被用來提取植物中的生物活性物質。DES是由氫鍵受體（Hydrogen Bond Acceptor，HBA）和氫鍵供體（Hydrogen Bond Donor，HBD）按一定的摩爾比混合形成的均一液相體系[11]。常見HBA有季銨鹽-氯化膽堿、兩性離子-甜菜堿，常見的HBD有乳酸、羧酸、尿素或多元醇。DES不僅具有制備簡單、提取得率高、成本低、環(huán)境友好、可回收、穩(wěn)定性好、無毒、保護活性物質等優(yōu)勢，而且能夠通過調節(jié)DES的組分及物質的量比來調節(jié)溶劑性質。DES體系已經(jīng)廣泛應用于生物和化學等領域，且在綠色提取領域具有廣闊的應用前景。目前DES用于核桃青皮黃酮的提取研究較少，但采用DES提取黃酮類化學物的報道較多[12-18]：王玉等采用四甲基氯化銨-乙二醇提取玉米花粉黃酮類化合物，提取得率為8.912 mg·g-1，是乙醇提取得率的1.57倍[19]；孟悅等采用超聲輔助氯化膽堿-草酸提取黃芪黃酮，提取得率為1.7 mg·g-1，高于傳統(tǒng)的甲醇提取法[20]；羅朝丹等采用超聲輔助氯化膽堿-乙二醇提取番石榴葉黃酮，總黃酮平均提取得率為14.95%[21]。

為給核桃青皮黃酮的提取及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論參考，同時為DES的應用提供新的思路，本文采用氯化膽堿作氫鍵受體（HBA）、乳酸作氫鍵供體（HBD）制備DES，探究其摩爾比、含水率、固液比、提取溫度、提取時間等對核桃青皮黃酮提取得率的影響以確定DES的最佳條件，并與傳統(tǒng)乙醇提取效果及黃酮提取物的抗氧化活性進行了對比。

1" 材料與方法

1.1" 儀器與試劑

1.1.1" 儀器

試驗過程中所使用的儀器設備詳見表1。

1.1.2" 材料與試劑

試驗過程中所使用的材料和試劑詳見表2。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 核桃青皮預處理

將清洗過的核桃青皮放入電熱鼓風干燥箱中以40 ℃的溫度干燥48 h，然后使用粉碎機研磨并過200目篩，將其裝入袋中并密封，貼好標簽，存放在室溫下的干燥器內備用。

1.2.2" 低共熔溶劑的制備

采用氯化膽堿（氫鍵受體）和乳酸（氫鍵供體），按照一定摩爾比，于85 ℃水浴，攪拌溶解，形成DES。

1.2.3" 核桃青皮黃酮的提取

精確稱取0.1 g青皮粉末置于15 mL配置好的DES中，一定溫度水浴加熱，反應一定時間，過濾后取濾液測定其黃酮含量。

1.2.4" 繪制蘆丁標準曲線并計算黃酮提取得率

參考文獻方法[22]，以蘆丁為標準品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉方法測定黃酮類化合物的含量。將20 mg的干燥蘆丁對照品精確稱取并放入100 mL的容量瓶中，用60%乙醇溶解后定容，得到含有0.2 g·L-1無水蘆丁的標準對照液。然后準確吸取10 mL蘆丁標準溶液放入25 mL比色管中，加入0.7 mL 5%NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；接著加入0.7 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻后靜置6 min；最后加入5 mL 4%NaOH溶液，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻后靜置10 min，在100～600 nm波長范圍內測定其最大吸收波長，以空白試劑作為參比。再配制一系列濃度的標準蘆丁溶液，在波長505 nm處測定吸光度，以蘆丁質量濃度（mg·mL-1）為橫坐標，以對應的吸光度為縱坐標繪制出標準曲線，計算出回歸方程。采用標準曲線計算核桃青皮中黃酮的濃度，然后用公式（1）計算黃酮的提取得率。

[Y=CVDM]" " （1）

式中：Y代表黃酮提取得率，單位為mg·g-1；C代表提取物溶液的質量濃度，單位為mg·mL-1；V代表提取液體積，單位為mL；D代表稀釋倍數(shù)；M代表所用核桃青皮粉末的體積，單位為g。

1.2.5" 核桃青皮黃酮提取工藝的優(yōu)化

以黃酮的提取得率為評價指標，分別研究DES摩爾比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、DES含水率（20%、30%、40%、50%、60%）、固液比（0.1∶10、0.1∶15、0.1∶20、0.1∶25、0.1∶30 g·mL-1）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對核桃青皮黃酮類化合物提取效果的影響。

1.2.6" 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果，采用Design Expert 8.0.6的Box Behnken設計了三因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，見表3。

1.2.7" DES與乙醇提取得率對比

在最優(yōu)提取條件下，將DES與乙醇分別做溶劑提取核桃青皮中的黃酮，計算其提取得率并進行對比分析。

1.2.8" DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻方法[23]，稱取2.00 mg DPPH溶解于無水乙醇，定容至50 mL，得到濃度為0.04 mg·mL-1 DPPH溶液。吸取4 mL配置好的DPPH溶液添加到4 mL不同質量濃度的DES和乙醇提取黃酮提取物中，混合搖勻，室溫避光下反應30 min，然后在517 nm處測定吸光度值。樣品對DPPH自由基的清除能力用公式（2）計算得到。

[DPPH自由基清除率=（1-Α1-A2A0）×100%] （2）

式中：A1加入4 mL提取物的吸光度，A2代表4 mL提取物和4 mL無水乙醇的吸光度，A0代表空白溶液的吸光度。

1.3" 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Origin 2021軟件對單因素試驗數(shù)據(jù)分析和繪圖，然后利用Design Expert 8.0.6進行響應面優(yōu)化。

2" 結果與分析

2.1" 標準曲線

以一系列標準品濃度（mg·mL-1）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制的蘆丁標準曲線，見圖1。使用Origin軟件繪制標曲并計算出回歸方程為y=11.439x+0.002 7，R2=0.999 1，表明線性關系良好。這一標準曲線可用于計算核桃青皮提取液的濃度進而求出黃酮提取得率。

2.2" 單因素試驗結果

2.2.1" DES摩爾比對核桃青皮黃酮提取得率的影響

HBA∶HBD摩爾比影響DES的組成，DES中的氫鍵作用力總會以更穩(wěn)定的混合物形式存在，氫鍵供體或受體的數(shù)量組、空間結構和鍵的位置等會顯著影響DES的形成和穩(wěn)定性，進而會顯著影響生物活性化合物的提取效率。因此，采用不同的氯化膽堿和乳酸的摩爾比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）進行試驗。結果如圖2所示，隨著乳酸物質的量增加，核桃青皮黃酮提取得率先增大，當氯化膽堿∶乳酸=1∶3時，提取得率最高，接著又逐漸降低。這可能是因為額外的羧基的存在，允許形成多個氫鍵，因此增加了液體的穩(wěn)定性，但隨著過多的羧基存在，可能會阻礙氫鍵形成，進而降低了溶劑的穩(wěn)定性[24-25]。因此，在隨后的試驗選取氯化膽堿和乳酸摩爾比1∶3制備的DES來提取核桃青皮中黃酮。

2.2.2" DES含水率對核桃青皮黃酮提取得率的影響

低共熔溶劑是一種黏度較高的溶劑[26]，在DES做有效成分提取溶劑時，黏度高的溶劑會阻礙目標化合物在溶液中的傳質效果，從而影響提取得率。因此，調整DES的黏度至適當水平是提高提取得率的有效方法。DES含水率對黃酮提取效果如圖3所示，隨著DES含水率逐漸的增加，核桃青皮黃酮提取得率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當含水率為30%時，黃酮提取得率最高，繼續(xù)增加DES含水率，黃酮提取得率開始下降。原因可能是過多的水分會破壞DES體系中氫鍵相互作用，同時也降低了DES的濃度，理化性質發(fā)生改變，導致DES提取黃酮的提取得率下降[27]。因此，在隨后的試驗選擇30%含水率。

2.2.3" 固液比對核桃青皮黃酮提取得率的影響

固液比是影響黃酮提取得率的重要因素之一，提取過程中溶劑與溶質的有效接觸是目標產(chǎn)物溶出的必要條件。因此，采用不同的固液比固液比（0.1∶10、0.1∶15、0.1∶20、0.1∶25、0.1∶30 g·mL-1）進行試驗。結果如圖4所示，固液比在0.1∶15 g·mL-1時達到最大值，隨后隨著料液比的增加核桃青皮黃酮提取得率下降。原因可能是DES與核桃青皮接觸面積增加，傳質速率提高，隨著固液比的增大，提取過程可能發(fā)生了稀釋效應，導致黃酮提取得率略有下降。因此，在隨后的試驗選取固液比為0.1∶15 g·mL-1。

2.2.4" 提取溫度對核桃青皮黃酮提取得率的影響

由圖5可知，溫度由40 ℃逐漸升高到80 ℃，黃酮提取得率也在逐漸增大，原因可能是溫度升高會加快分子擴散的速度，增加目標化合物的傳質效果，同時，溫度升高會降低DES的黏度，從而提高黃酮類化合物的提取得率，但溫度持續(xù)上升會使黃酮發(fā)生降解，影響其活性[27]。在70～130 ℃熱處理條件下，蘆丁的提取得率隨著溫度的升高而升高，其抗氧化能力隨著溫度的升高而降低[28]。因此，選取提取溫度為70 ℃。

2.2.5" 提取時間對核桃青皮黃酮提取得率的影響

將干燥的核桃青皮細粉浸泡在低共熔溶劑中需要一定時間才能充分溶解出黃酮有效成分。為了獲得更多的黃酮提取量，可以逐漸增加核桃青皮粉末與溶劑接觸的時間[29]。試驗結果如圖6顯示，提取時間為1.5 h，提取得率最高。然而，長時間暴露在高溫下與溶劑接觸會導致黃酮發(fā)生分解、氧化及降低生物活性等反應而變質，同時也會導致其他雜質的溶解，從而降低黃酮的提取率[30]。因此，確定最佳提取時間為1.5 h。

2.3" 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1" 響應面試驗設計與結果

在單因素試驗的基礎上，固定DES摩爾比和固液比，以DES含水率、提取溫度和提取時間為影響因素，黃酮提取得率為響應值，試驗設計與結果見表4。對數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到核桃青皮黃酮提取得率的回歸方程如下。

Y=57.06+1.02×A+2.39×B+0.46×C+0.87×AB-1.5×AC+0.29×BC-3.77×A2-2.92×B2-2.85×C2

2.3.2" 回歸模型擬合及方差分析結果

由表5可知，該模型的F=94.11，p值小于0.000 1，說明該模型極顯著且方法可行。失擬項F值為1.83，p值大于0.05，決定系數(shù)R2=0.991 8，說明該模型擬合度好。校準系數(shù)R2=0.981 3，表明該模型可以說明黃酮提取得率的改變有98.13%來自DES含水率、提取溫度和提取時間，說明此模型能預測其響應值。根據(jù)F值可知含水率（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）這3個單因素對黃酮得率影響：B＞A＞C。由響應面分析可知，C、AB具有顯著影響（p＜0.05），A、B、AC、A2、B2、C2具有極顯著影響（p＜0.01）。

2.3.3" 分析各因素之間的交互作用

采用Design Expert 8.0.6軟件分析了各因素之間的交互作用，生成了3D曲面和等高線圖，具體見圖7。這些圖形直觀地展示了含水率、提取溫度和提取時間之間的交互作用對響應值的影響。響應面圖中曲線越彎曲說明研究因素對結果影響越大，等高線呈橢圓形說明研究因素之間的交互作用顯著，呈圓形則說明交互作用不顯著。從圖中可以看出，含水率（A）與提取溫度（B）之間的交互作用較為顯著，而含水率（A）與提取時間（C）之間的交互作用更為顯著，對核桃青皮黃酮提取得率的影響最為顯著，這與表5中的方差分析結果一致。

2.3.4" 最佳提取工藝驗證

經(jīng)過Design Expert軟件分析，確定了核桃青皮黃酮最佳工藝條件為：含水率為31.750%，提取溫度74.372 ℃，提取時間為1.528 h，在此條件下核桃青皮黃酮提取得率為57.685 mg·g-1。為了方便后續(xù)試驗操作，本研究選擇了DES含水率為30%，提取溫度為74 ℃，提取時間為1.5 h的試驗條件進行驗證試驗。在這個工藝條件下，完成3次提取，平均提取得率為57.518 mg·g-1。模擬預測值與實際驗證值非常接近，這驗證了響應面模型的有效性和回歸模型的準確性。

2.4" DES與乙醇提取得率對比

如圖8可知，在相同條件下，DES與乙醇相比，DES作溶劑黃酮提取得率高于乙醇作溶劑的黃酮提取得率，表明該低共熔溶劑能比較高效地提取核桃青皮黃酮。

2.5" DES和乙醇提取物的抗氧化活性

根據(jù)圖9顯示，不論是使用DES溶液還是乙醇溶液提取黃酮，隨著溶液濃度的增加，對DPPH的清除能力也隨之增強。在相同的提取條件下，DES提取的黃酮類化合物清除能力始終優(yōu)于乙醇提取的。這表明DES提取黃酮類化合物具有較好的抗氧化活性。

3" 結論與展望

本研究以核桃青皮為研究對象，利用綠色溶劑DES提取其中的黃酮。通過單因素試驗探究DES摩爾比、含水率、固液比、提取溫度和提取時間這五種因素對黃酮提取得率的影響，在此基礎上，再通過響應面法優(yōu)化試驗工藝。研究結果顯示，在最佳工藝條件下，即氯化膽堿-乳酸摩爾比（1∶3）、DES含水率30%、固液比0.1∶15、提取溫度74 ℃，提取時間1.5 h，核桃青皮黃酮的提取得率為57.518 mg·g-1。此外，DES提取得率和抗氧化能力均優(yōu)于同等條件下乙醇提取物。該研究使用新型綠色溶劑DES作為提取溶劑，通過核桃青皮黃酮提取工藝優(yōu)化，提高了核桃青皮黃酮提取得率。通過低共溶劑提取物抗氧化能力研究，提高了核桃青皮的利用率，同時為該類溶劑的應用提供新的思路。

低共熔溶劑作為一種新型的綠色反應介質，其研究和應用在全球可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護的背景下具有重大意義。目前，低共熔溶劑已展現(xiàn)出低蒸汽壓、高溶解性、良好的電化學穩(wěn)定性及可生物降解性等優(yōu)異性質，未來研究將致力于進一步優(yōu)化低共熔溶劑的組成和性質，以滿足不同應用領域的需求。低共熔溶劑的制備成本雖低于傳統(tǒng)離子液體，但在大規(guī)模工業(yè)應用中仍面臨成本問題。因此，未來研究將探索更經(jīng)濟的制備方法和原料來源，以降低低共熔溶劑的生產(chǎn)成本。

參考文獻：

[1]" 孫卉，何志貴，師俊玲.核桃青皮活性成分胡桃醌抗腫瘤作用研究進展[J].農產(chǎn)品加工，2021（14）：86-90.

[2]" 路振康，吳慶智，張建，等.核桃青皮提取物的多酚含量、體外抗氧化和抗菌活性的評價[J].食品科學，2023，44（3）：79-87.

[3]" 丁蕓.核桃青皮的活性成分提取及染色性能研究[D].烏魯木齊：新疆大學，2016.

[4]" 徐蓓蓓.核桃副產(chǎn)物多酚的提取及其對油脂氧化穩(wěn)定性的影響[D].阿拉爾：塔里木大學，2017.

[5]" 許豆豆.新型篩選及微萃取技術在黃芪散黃酮類抗癌活性成分研究中的應用[D].太原：山西醫(yī)科大學，2022.

[6]" 姜立春，張雨潔，蔣道玉，等.響應面優(yōu)化超聲波微波協(xié)同提取獼猴桃莖黃酮工藝及抗氧化活性分析[J].四川大學學報（自然科學版），2024，61（3）：314-322.

[7]" 徐崇，何敬愉，梁爽成.基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接分析甘草黃酮類成分的美白抗炎作用機制[J].香料香精化妝品，2024（3）：52-61.

[8]" 張凱煜，陳文，王湘君，等.基于苦丁茶黃酮類新型抗癌藥物研究進展[J].內江科技，2023，44（6）：123-124.

[9] 王健，張珍珍，梅秀珍，等.黃酮類化合物的抗菌作用及機制研究進展[J].江蘇農業(yè)科學，2023，51（1）：1-8.

[10] 付佳樂，耿直.綠色低共熔溶劑提取黃酮類化合物的研究進展[J].化學與生物工程，2022，39（7）：8-12.

[11] 吳萍萍，宋磊，殷長龍，等.“看見”氫鍵：低共熔溶劑體系的建立與應用綜合型教學實驗設計與實踐[J].化學教育（中英文），2022，43（4）：75-80.

[12] 高敏，王晴，王欣蘭，等.低共熔溶劑提取黃酮類化合物的研究進展[J].化學工程師，2024，38（2）：55-58.

[13] 楊枝中，張文平，張磊，等.超聲輔助低共熔溶劑提取腎茶黃酮和多酚的工藝及其抗氧化活性[J].云南農業(yè)大學學報（自然科學），2024，39（3）：99-106.

[14] 張潤紅，謝簡珺，趙麗.超聲波輔助復合酶法提取核桃青皮總黃酮工藝研究[J].廣東蠶業(yè)，2022，56（10）：49-54.

[15] 蘇學軍，徐穎，宗春燕.超聲波輔助低共熔溶劑提取蕎麥殼中總黃酮的工藝研究[J].化學工程師，2024，38（6）：96-99.

[16] DU H， WU W， WANG Y， et al. Natural deep eutectic solvent-ultrasound for the extraction of flavonoids from fructus aurantii： theoretical screening， experimental and mechanism[J]. Arabian Journal of Chemistry， 2024，17（9）：105886-105886.

[17] ?ALI? A， BAJO M， BUBALO M C， et al. Extraction of polyphenolic compounds from ginkgo leaves using deep eutectic solvents： a potential solution for the sustainable and environmentally friendly isolation of biflavonoids[J]. Industrial Crops amp; Products， 2024，219：119068-119068.

[18] ZHANG Y， LI H， HAI X， et al. Designing green and recyclable switchable supramolecular deep eutectic solvents for efficient extraction of flavonoids from scutellariae radix and mechanism exploration[J]. Journal of chromatography. A， 2024，1730：465084-465084.

[19] 王玉，程超，張紅妮，等.低共熔溶劑提取玉米花粉黃酮類化合物及其抗氧化性分析[J].食品科技，2023，48（6）：195-201.

[20] 孟悅，潘旭，張鑫藝，等.超聲輔助高凝固點低共熔溶劑提取黃芪黃酮[J].中國飼料，2024（1）：58-65.

[21] 羅朝丹，任二芳，黃燕婷，等.番石榴葉黃酮超聲輔助低共熔溶劑提取工藝及品種差異[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（14）：147-154.

[22] 謝茜，劉合智，王開銀.低共熔溶劑提取龍眼參黃酮的工藝優(yōu)化及其抗運動疲勞研究[J].中國食品添加劑，2023，34（9）：210-217.

[23] 盧俊.響應面優(yōu)化核桃青皮總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J].飼料研究，2023，46（9）：97-102.

[24] 李成林，褚秀玲，蘇建青.天然低共熔溶劑在植物提取物中的應用研究進展[J].飼料工業(yè)，2024，45（6）：134-140.

[25] 柳靜，王昌梅，趙興玲，等.氯化膽堿類低共熔溶劑對木質纖維素分離及其利用的研究進展[J].中國農學通報，2023，39（33）：156-164.

[26] 于德涵，黎莉，蘇適.天然低共熔溶劑提取黃酮類化合物的研究進展[J].食品工業(yè)科技，2023，44（24）：367-375.

[27] 雷永偉，劉欣，安艷霞，等.低共熔溶劑提取蕎麥殼黃酮的工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2023，44（13）：160-166.

[28] IRINA I， LEILA C， MOHAMED G. Effect of heat treatment and light exposure on the antioxidant activity of flavonoids [J]. Processes， 2020，8（9）：1078-1078.

[29] 辛瑩娟，李禎.超聲波輔助黃芩總黃酮提取及抗氧化性能研究[J].陜西農業(yè)科學，2021，67（9）：73-75，95.

[30] 甘洋縈，樊文研，羅玲，等.響應面法優(yōu)化小槐花總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].中南農業(yè)科技，2024，45（6）：55-60.

（責任編輯：敬廷桃）