焦婧儀 劉琳 肖康 劉倩 龍琴

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院眼科 協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,北京 100730;2中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085

多項(xiàng)研究表明,大氣污染可能與多種疾病,包括結(jié)膜炎、干眼的發(fā)生密切相關(guān)[1-3]?？諝馕廴究赡芡ㄟ^(guò)影響淚膜不穩(wěn)定性、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激機(jī)制以及污染物自身有毒物質(zhì)直接作用導(dǎo)致眼表?yè)p傷[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,BALB/c小鼠眼表點(diǎn)用大氣污染物顆粒物(air pollutant particulate matter,PM)2.5或PM10滴眼液后淚液分泌量減少,淚膜破裂時(shí)間(tear film break-up time,TBUT)縮短,角膜熒光染色(corneal fluorescein staining,CFS)評(píng)分升高,同時(shí)角膜中炎癥因子水平升高[5-6]。黑碳是PM的組成部分,主要源于不完全燃燒排放,目前被認(rèn)為是重要的短生命氣候脅迫物之一,可能造成公共健康危害[7]。在中國(guó),黑碳在PM中占比較大[8]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明,黑碳顆粒對(duì)體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞(human corneal epithelial cells,HCECs)具有細(xì)胞毒性和促凋亡作用,并可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體通路的活化,而NLRP3炎癥小體已被證實(shí)為影響淚膜功能的重要炎癥相關(guān)通路之一[9-12]。本研究通過(guò)采用不同濃度的黑碳混懸液點(diǎn)眼構(gòu)建BALB/c小鼠黑碳眼表暴露模型,觀察不同作用時(shí)間下小鼠淚液分泌量、TBUT、CFS及眼表充血情況,探討黑碳顆粒對(duì)淚膜功能和眼表炎癥的損傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取6～8周齡SPF級(jí)健康雄性BALB/c小鼠28只[斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010],體質(zhì)量18～22 g,飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)前采用裂隙燈顯微鏡檢查排除眼表相關(guān)疾病,如結(jié)膜炎、角膜炎等。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,小鼠于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中統(tǒng)一飼養(yǎng)。動(dòng)物操作及處理均符合北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)要求,且研究方案經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批文號(hào):XHDW-2022-053)。

1.1.2主要試劑及儀器 黑碳顆粒(中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心劉倩教授團(tuán)隊(duì)提供,從大氣PM2.5中提取,具體制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]);眼科鑷[上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠];酚紅棉線(xiàn)(天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);熒光素鈉(上海邁坤化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠黑碳眼表暴露模型的建立 將28只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)平均分為對(duì)照組、0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組,每組7只,分別采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)、0.5 mg/ml、1 mg/ml和5 mg/ml黑碳PBS混懸液點(diǎn)右眼,每次4 μl,每天3次,于處理前及處理后第4、7、10、14天評(píng)估淚膜功能及結(jié)膜充血情況。

1.2.2淚膜功能和眼表炎癥評(píng)估 分別于處理前及處理后4、7、10、14 d評(píng)估淚膜功能和眼表炎癥情況,所有檢查均在同一地點(diǎn)、濕度、溫度及照明情況下由同一名檢查者在每個(gè)評(píng)估日傍晚完成。淚膜功能及眼表炎癥指標(biāo)檢測(cè):(1)淚液分泌量 用眼科鑷將酚紅棉線(xiàn)輕置于麻醉小鼠右眼結(jié)膜穹隆距外眥約1/3處,20 s后取出酚紅棉線(xiàn),使用游標(biāo)卡尺測(cè)量淚液浸濕棉線(xiàn)的長(zhǎng)度并記錄,棉線(xiàn)浸濕變紅部分的長(zhǎng)度與小鼠淚液分泌量成正比。測(cè)試結(jié)束后,輕柔地使小鼠瞬目3次,以減輕過(guò)度暴露所致的眼表刺激。(2)TBUT 于小鼠結(jié)膜囊內(nèi)滴入1%熒光素鈉溶液2 μl,手動(dòng)瞬目3次后在裂隙燈顯微鏡下應(yīng)用鈷藍(lán)濾光片觀察,記錄從瞬目結(jié)束至角膜染色區(qū)出現(xiàn)點(diǎn)或線(xiàn)狀缺損的時(shí)間即為T(mén)BUT。(3)CFS 于淚膜破裂后30 s,在裂隙燈顯微鏡下應(yīng)用鈷藍(lán)濾光片觀察小鼠角膜CFS情況并評(píng)分;采用NEI指南評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14],將角膜分為中央、上方、下方、鼻側(cè)、顳側(cè)5個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域依據(jù)染色程度記為0～3分,0分為無(wú)染色,3分為廣泛染色,總分為0～15分,CFS評(píng)分與角膜損傷嚴(yán)重程度成正比。測(cè)試結(jié)束后,輕柔地使小鼠瞬目3次,以減輕過(guò)度暴露所致的眼表刺激。(4)結(jié)膜充血評(píng)分 暴露結(jié)膜,在裂隙燈顯微鏡下觀察并評(píng)分;使用中國(guó)健康管理協(xié)會(huì)接觸鏡安全監(jiān)控與視覺(jué)健康專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2021年共識(shí)中結(jié)膜充血分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),評(píng)為0～4級(jí)[15]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)淚液分泌量比較

4個(gè)組不同時(shí)間點(diǎn)淚液分泌量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=83.325,P<0.001;F時(shí)間=86.551,P<0.001;F交互作用=5.181,P<0.001)。其中,0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組處理后各時(shí)間點(diǎn)淚液分泌量較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組處理后4、7、10、14 d淚液分泌量較處理前降低,處理后14 d淚液分泌量較處理后4 d降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

2.2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)TBUT比較

4個(gè)組不同時(shí)間點(diǎn)TBUT總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=75.130,P<0.001;F時(shí)間=56.265,P<0.001;F交互作用=6.103,P<0.001)。其中,處理后7 d,0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組TBUT較對(duì)照組短,5 mg/ml組TBUT較1 mg/ml組短,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);處理后10 d,0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組TBUT較對(duì)照組短,0.5 mg/ml組TBUT較1 mg/ml組和5 mg/ml組長(zhǎng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);處理后14 d,對(duì)照組、0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組TBUT依次縮短,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。0.5 mg/ml組處理后各時(shí)間點(diǎn)TBUT均較處理前短,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);1 mg/ml組處理后各時(shí)間點(diǎn)TBUT較處理前短,處理后14 d TBUT較處理后4、7、10 d短,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);5 mg/ml組處理后7、10、14 d TBUT較處理前短,處理后10 d TBUT較處理后4 d短,處理后14 d TBUT較處理后4、7、10 d短,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠淚液分泌量比較(x±s,mm)Table 1 Comparison of tear secretion in mice among different groups at different time points (x±s,mm)組別眼數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)淚液分泌量處理前處理后4 d處理后7 d處理后10 d處理后14 d對(duì)照組76.12±0.615.41±0.605.36±0.395.11±0.575.31±0.360.5 mg/ml組76.68±0.993.73±0.65ac3.23±0.50ac3.23±0.50ac2.74±0.74abc1 mg/ml組75.69±0.563.83±0.99ac3.19±0.73ac3.22±0.61ac2.73±0.76abc5 mg/ml組75.83±0.413.31±0.32ac2.75±0.66ac3.04±0.33ac2.31±0.67abc 注:F組別=83.325,P<0.001;F時(shí)間=86.551,P<0.001;F交互作用=5.181,P<0.001.與處理前比較,aP<0.05;與處理后4 d比較,bP<0.05;與對(duì)照組比較,cP<0.05(重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩胤讲罘治?Bonferroni校正檢驗(yàn)) Note:Fgroup=83.325,P<0.001;Ftime=86.551,P<0.001;Finteraction=5.181,P<0.001.Compared with before treatment within groups,aP<0.05;compared with 4 days after treatment within groups,bP<0.05;compared with control group,cP<0.05 (Two-way repeated measures ANOVA,Bonferroni correction test)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠TBUT比較(x±s,s)Table 2 Comparison of TBUT in mice among different groups at different time points (x±s,s)組別眼數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)TBUT處理前處理后4 d處理后7 d處理后10 d處理后14 d對(duì)照組76.63±0.646.11±0.576.80±0.346.47±0.556.22±0.220.5 mg/ml組77.01±0.765.72±0.81a5.48±0.36ae5.40±0.26ae4.87±0.28ae1 mg/ml組76.72±0.665.31±0.60a4.96±0.48ae4.74±0.44aef4.00±0.76abcdef5 mg/ml組76.47±0.395.25±0.78a4.50±0.46aef4.24±0.34abef3.23±0.43abcdefg 注:F組別=75.130,P<0.001;F時(shí)間=56.265,P<0.001;F交互作用=6.103,P<0.001.與處理前比較,aP<0.05;與處理后4 d比較,bP<0.05;與處理后7 d比較,cP<0.05;與處理后10 d比較,dP<0.05;與對(duì)照組比較,eP<0.05;與0.5 mg/ml組比較,fP<0.05;與1 mg/ml組比較,gP<0.05(重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩胤讲罘治?Bonferroni校正檢驗(yàn)) TBUT:淚膜破裂時(shí)間 Note:Fgroup=75.130,P<0.001;Ftime=56.265,P<0.001;Finteraction=6.103,P<0.001.Compared with before treatment within groups,aP<0.05;compared with 4 days after treatment within groups,bP<0.05;compared with 7 days after treatment within groups,cP<0.05;compared with 10 days after treatment within groups,dP<0.05;compared with control group,eP<0.05;compared with 0.5 mg/ml group,fP<0.05;compared with 1 mg/ml group,gP<0.05 (Two-way re-peated measures ANOVA,Bonferroni correction test) TBUT:tear film break-up time

2.3 各組不同時(shí)間點(diǎn)CFS評(píng)分比較

4個(gè)組CFS評(píng)分總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H組別=59.249,P<0.001),不同時(shí)間點(diǎn)間CFS評(píng)分總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H時(shí)間=49.959,P<0.001)。其中,1 mg/ml組和5 mg/ml組處理后各時(shí)間點(diǎn)CFS評(píng)分明顯高于對(duì)照組和0.5 mg/ml組,0.5 mg/ml組處理后各時(shí)間點(diǎn)CFS評(píng)分明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組處理后4、7、10、14 d CFS評(píng)分較處理前升高,處理后7、10、14 d CFS評(píng)分較處理后4 d升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);組別與時(shí)間的交互作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H交互作用=15.980,P=0.192)(表3)。

2.4 各組小鼠結(jié)膜充血情況比較

4個(gè)組結(jié)膜充血評(píng)級(jí)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H組別=57.622,P<0.001),不同測(cè)量時(shí)間點(diǎn)間結(jié)膜充血評(píng)級(jí)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H時(shí)間=42.062,P<0.001)。其中,0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組結(jié)膜充血評(píng)級(jí)較對(duì)照組升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);0.5 mg/ml組、1 mg/ml組和5 mg/ml組處理后4、7、10、14 d結(jié)膜充血評(píng)級(jí)均較處理前升高,處理后10 d和14 d結(jié)膜充血評(píng)級(jí)均較處理后4 d升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);組別與時(shí)間的交互作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H交互作用=12.566,P=0.401)(表4)。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠CFS評(píng)分比較[M(Q1,Q3),分]Table 3 Comparison of CFS score in mice among different groups at different time points [M(Q1,Q3),score]組別眼數(shù)不同測(cè)量時(shí)間CFS評(píng)分處理前處理后4 d處理后7 d處理后10 d處理后14 d對(duì)照組70(0,0)0(0,0)0(0,0)0(0,1)0(0,1)0.5 mg/ml組70(0,0)0(0,1)ac2(1,3)ac2(2,4)ac4(3,4)ac1 mg/ml組70(0,0)1(1,3)abcd3(3,4)abcd5(4,5)abcd5(5,6)abcd5 mg/ml組70(0,0)3(2,3)abcd4(4,5)abcd5(5,6)abcd7(7,8)abcd 注:H組別=59.249,P<0.001;H時(shí)間=49.959,P<0.001;H交互作用=15.980,P=0.192.與處理前比較,aP<0.05;與處理后4 d比較,bP<0.05;與對(duì)照組比較,cP<0.05;與0.5 mg/ml組比較,dP<0.05(Scheirer-Ray-Hare檢驗(yàn),Kruskal-Wallis檢驗(yàn)) CFS:角膜熒光素染色 Note:Hgroup=59.249,P<0.001;Htime=49.959,P<0.001;Hinteraction=15.980,P=0.192.Compared with before treatment within groups,aP<0.05;compared with 4 days after treatment within groups,bP<0.05;compared with control group,cP<0.05;compared with 0.5 mg/ml group,dP<0.05 (Scheirer-Ray-Hare test,Kruskal-Wallis test) CFS:corneal fluorescein staining

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠結(jié)膜充血評(píng)級(jí)比較[M(Q1,Q3)]Table 4 Comparison of conjunctival congestion grades in mice among different groups at different time points [M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)不同測(cè)量時(shí)間結(jié)膜充血評(píng)級(jí)處理前處理后4 d處理后7 d處理后10 d處理后14 d對(duì)照組70(0,0)0(0,0)0(0,1)0(0,1)0(0,1)0.5 mg/ml組70(0,0)1(0,1)ac1(1,2)ac2(1,2)abc2(2,3)abc1 mg/ml組70(0,0)1(1,2)ac2(1,2)ac2(2,3)abc2(2,3)abc5 mg/ml組70(0,0)1(1,2)ac2(2,2)ac3(2,3)abc3(2,3)abc 注:H組別=57.622,P<0.001;H時(shí)間=42.062,P<0.001;H交互作用=12.566,P=0.401.與處理前比較,aP<0.05;與處理后4 d比較,bP<0.05;與對(duì)照組比較,cP<0.05(Scheirer-Ray-Hare檢驗(yàn),Kruskal-Wallis檢驗(yàn)) Note:Hgroup=57.622,P<0.001;Htime=42.062,P<0.001;Hinteraction=12.565,P=0.401.Compared with before treatment within groups,aP<0.05;compared with 4 days after treatment within groups,bP<0.05;compared with control group,cP<0.05 (Scheirer-Ray-Hare test,Kruskal-Wallis test)

3 討論

淚液分泌量可以反映淚腺、副淚腺等眼表組織的分泌功能及淚液產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)[16]。本研究結(jié)果顯示,0.5、1和5 mg/ml黑碳混懸液眼表暴露4～14 d可對(duì)淚液分泌量產(chǎn)生明顯影響,使淚液分泌量明顯降低。

TBUT可以反映淚膜的穩(wěn)定性,而淚膜穩(wěn)定性降低是產(chǎn)生眼表炎癥及眼表?yè)p傷的核心機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,不同濃度黑碳混懸液點(diǎn)眼可造成小鼠TBUT顯著縮短,且存在暴露時(shí)間和濃度的依賴(lài)性。這一結(jié)果與研究報(bào)道的大氣顆粒物PM2.5、PM10、煙塵顆粒等作用于眼表后淚膜穩(wěn)定性下降的結(jié)論相一致[5-6,17-18]。

CFS可體現(xiàn)角膜上皮屏障功能的破壞和角膜損傷情況[15]。既往研究顯示,大氣顆粒物PM2.5、PM10可以導(dǎo)致角膜上皮損傷[5-6,18]。同時(shí)有研究顯示,PM10可以抑制體外培養(yǎng)的HCECs增生,PM10濃度為0.25、0.5、1、2、5 mg/ml時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨濃度增加其抑制作用更為顯著[5]。本研究結(jié)果也顯示,眼表黑碳暴露后小鼠CFS評(píng)分明顯升高,且隨黑碳濃度和暴露時(shí)間的增加,角膜上皮損傷程度加重,表明黑碳可導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞完整性受損,屏障功能降低。結(jié)膜充血程度是評(píng)估眼表炎癥的常用指標(biāo)[15,19]。本研究結(jié)果顯示,隨著黑碳濃度和暴露時(shí)間的增加,結(jié)膜充血程度加重,眼表炎癥明顯加重。

有研究顯示,在眼表PM2.5暴露后,小鼠角膜、結(jié)膜上皮層數(shù)增加,排列紊亂,淚腺上皮細(xì)胞減少,結(jié)膜杯狀細(xì)胞減少[6];在眼表PM2.5或PM10暴露后,小鼠角膜組織中腫瘤壞死因子α、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65、p-NF-κB p65均明顯升高[5-6];于城市污染空氣中暴露12周以?xún)?nèi),小鼠角膜組織中NADPH氧化酶4水平持續(xù)升高,誘導(dǎo)眼表環(huán)境的氧化應(yīng)激[20]。綜合本研究及既往研究結(jié)果,推測(cè)大氣顆粒物暴露于小鼠眼表后,可能通過(guò)損傷上皮細(xì)胞、破壞結(jié)膜杯狀細(xì)胞、誘導(dǎo)眼表組織的氧化損傷或激活炎癥反應(yīng)以損傷淚膜功能。

本研究選取大氣顆粒物中的主要成分黑碳為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)在暴露后4 d各不同濃度黑碳組指標(biāo)發(fā)生明顯變化,但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),后續(xù)指標(biāo)變化緩慢,推測(cè)其原因可能為眼表暴露于黑碳導(dǎo)致?lián)p傷的最低濃度小于本研究中所用濃度,或造成損傷所需時(shí)間較短,故檢驗(yàn)指標(biāo)的差異在處理后4 d內(nèi)發(fā)生變化最為顯著。同時(shí),在CFS評(píng)分與結(jié)膜充血等級(jí)的分析中,濃度與暴露時(shí)間的交互作用不顯著,分析其可能是由于Scheirer-Ray-Hare檢驗(yàn)較為保守且檢驗(yàn)效率較低,導(dǎo)致對(duì)交互作用的低估,同時(shí)本研究納入的樣本量過(guò)小。

本研究的局限性在于樣本量較小,可能不足以反映群體特征,需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以證實(shí);此外,在觀察指標(biāo)方面僅選取了淚液分泌量、TBUT、CFS評(píng)分和結(jié)膜充血情況作為代表,未納入組織病理或分子生物學(xué)指標(biāo),難以明確黑碳造成淚膜損傷的機(jī)制。在未來(lái)的研究中,需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,增加客觀評(píng)估指標(biāo),以進(jìn)一步探究其機(jī)制。

本研究創(chuàng)新性地使用黑碳懸濁液暴露于小鼠眼表,觀察黑碳眼表暴露與淚膜功能之間的關(guān)系。與此前大氣顆粒物與淚膜功能關(guān)系的研究相比,本研究增加對(duì)結(jié)膜充血情況的評(píng)估,提示在黑碳暴露后小鼠眼表炎癥加重,這為未來(lái)研究黑碳暴露與淚膜功能損傷的機(jī)制提供了新的可能性。黑碳作為PM的重要組成部分,于眼表暴露可以導(dǎo)致小鼠淚膜功能的降低和眼表炎癥增加,其具體作用機(jī)制仍需深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明焦婧儀:參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫(xiě)及修改;劉琳:參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作;肖康:參與實(shí)驗(yàn)選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo);劉倩、龍琴:參與實(shí)驗(yàn)選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、論文修改及定稿