王成章, 顏洋洋,2, 周 昊, 劉丹陽(yáng), 商士斌, 張華興

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;林木生物質(zhì)低碳高效利用國(guó)家工程研究中心,江蘇 南京 210042; 2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037; 3.凱里小生物科技有限公司,貴州 凱里 556000)

植物靛藍(lán)提取物(新型青黛)由馬藍(lán)、木蘭、蓼藍(lán)或菘藍(lán)的莖葉發(fā)酵后加工制得[1],富含吲哚生物堿類、核苷類、甾醇類和酚類化合物等物質(zhì),主要藥效成分為靛藍(lán)和靛玉紅,具有抗氧化、抗菌、消炎、抗病毒、抗癌等多種生物活性[2-3]。靛藍(lán)提取物近年來常用于調(diào)配復(fù)方中藥和治療疾病,具有清熱解毒、抗炎止血、抗衰老、抗癌等作用[4-6]。由于原料和加工工藝的不同,靛藍(lán)提取物化學(xué)成分種類和含量存在差異[7-8]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》[9-10]中關(guān)于靛藍(lán)含量分析方法有高錳酸鉀法、分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法;靛玉紅含量分析方法有薄層色譜法、高效液相色譜法。此外,文獻(xiàn)[11-16]還報(bào)道了雙波長(zhǎng)紫外分光光度法、磺化-紫外分光光度法、一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法、單掃描極譜法、循環(huán)伏安法等植物靛藍(lán)提取物的分析檢測(cè)方法。因此,為了篩選出合適的測(cè)定靛藍(lán)提取物中靛藍(lán)、靛玉紅含量方法,本研究采用鹽酸酸化、葡萄糖還原和乙酸乙酯提取純化分離得到3種靛藍(lán)提取物,選用高效液相色譜法、紫外可見分光光度法和雙波長(zhǎng)紫外分光光度法3種常用的植物靛藍(lán)提取物的分析檢測(cè)方法對(duì)提取物進(jìn)行測(cè)定,通過方法學(xué)考察與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較3種分析方法對(duì)3種靛藍(lán)提取物測(cè)定的差異性,并確定不同樣品的最佳分析方法,以期為不同靛藍(lán)含量提取物的快速測(cè)定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

靛藍(lán)膏(含水量50%～60%)由貴州小生源有限公司提供,經(jīng)80 ℃烘箱烘干12 h,過0.18 mm篩,制得靛藍(lán)粗提物(含水8.42%,靛藍(lán)2%～5%,靛玉紅0.034%,質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同),備用。靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)、甲醇(色譜純)均購(gòu)于阿拉丁生化試劑有限公司;乙酸乙酯、氫氧化鈉、葡萄糖、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均為分析純,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸(化學(xué)純),購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司。

CBM-10A VP Plus型高效液相色譜儀,日本島津公司;UV-1800型紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)有限公司;QUINTIX35-1CN PC型電子天平,德國(guó)賽多利斯公司;LXJ-IIB型低速離心機(jī),海安亭科學(xué)儀器廠;RE-5LC型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器,河南省予華儀器有限公司;KH5200E型超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 靛藍(lán)提取物的制備

1.2.1靛藍(lán)酸化物的制備 參考文獻(xiàn)[9]制備靛藍(lán)酸化物:取30 g靛藍(lán)粗提物于250 mL錐形瓶?jī)?nèi),加入150 mL水,置于80 ℃的恒溫水浴鍋中攪拌均質(zhì)10 min。然后緩慢分批滴加20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)鹽酸水溶液直到反應(yīng)液pH值為2～3,攪拌反應(yīng)40 min。離心得下層固體用100 ℃水洗滌至中性并于80 ℃下烘干,即得靛藍(lán)酸化物(產(chǎn)率92.31%,含靛藍(lán)20.13%,靛玉紅0.26%)。

1.2.2靛藍(lán)還原物的制備 參考文獻(xiàn)[11]制備靛藍(lán)還原物:取2 g靛藍(lán)酸化物置于250 mL錐形瓶,加入100 mL水和3 g氫氧化鈉,置于80 ℃恒溫水浴鍋中攪拌30 min。離心后將下層濾渣轉(zhuǎn)入錐形瓶中,再加入100 mL水、 3 g氫氧化鈉和2.5 g葡萄糖,瓶口用封口膜密封后于60 ℃恒溫水浴下攪拌反應(yīng)50 min。反應(yīng)后離心得上層液體,用氣泵通入空氣2 min,再滴加20%鹽酸至pH值為3～4,再次離心分離,下層沉淀用超純水洗滌至中性,沉淀于80 ℃下烘干,即得靛藍(lán)還原物(產(chǎn)率76.88%,含靛藍(lán)85%,靛玉紅0.86%)。

1.2.3乙酸乙酯提取物的制備 參考文獻(xiàn)[11]制備靛藍(lán)還原物:取20 g靛藍(lán)酸化物于500 mL燒杯中,加入200 mL乙酸乙酯超聲波處理30 min。過濾,濾渣用乙酸乙酯重復(fù)萃取2次,合并濾液,蒸發(fā)乙酸乙酯溶劑后,80 ℃烘干即得乙酸乙酯提取物(產(chǎn)率66.45%,含靛藍(lán)35%,靛玉紅23.16%)。

1.3 靛藍(lán)提取物成分及含量分析

1.3.1對(duì)照品溶液的制備 分別精確稱取靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品5 mg、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品3 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,加DMF至刻度線下3～4 cm,超聲波處理使其溶解后定容,作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備 分別精確稱取靛藍(lán)酸化物15 mg、靛藍(lán)還原物5 mg、乙酸乙酯提取物5 mg置于100 mL棕色容量瓶中,加DMF至刻度線下3～4 cm,超聲波處理使其溶解后定容,作為供試品溶液。

1.3.3HPLC方法學(xué)考察 高效液相色譜條件:流動(dòng)相為甲醇/水,體積比7∶3;色譜柱YMC-AC-ODSA(250 mm×4.6 mm,5 μm),5 000塔板數(shù)柱效;檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm;流速1 mL/min。

線性關(guān)系考察:分別精確吸取1、 2、 4、 6、 8 mL靛藍(lán)、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL棕色容量瓶中,加DMF稀釋至刻度搖勻。按色譜條件分別進(jìn)樣,記錄 HPLC 色譜圖。

穩(wěn)定性試驗(yàn):分別取靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物樣品溶液,避光放置。在0、 2、 4、 8、 12、 24 h按色譜條件,分別測(cè)試其靛藍(lán)、靛玉紅含量。精密度試驗(yàn):取20 mg/L靛藍(lán)和18 mg/L靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液中靛藍(lán)、靛玉紅濃度,連續(xù)進(jìn)樣6次。重復(fù)性試驗(yàn):取同一種供試品粉末精確稱量,共6份,制備供試品溶液,分別測(cè)試其靛藍(lán)、靛玉紅含量。加樣回收率試驗(yàn):取已知含量靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物樣品各6份,精確稱取,置于100 mL棕色容量瓶中,分別精確加入0.05 g/L靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL,乙酸乙酯提取物樣品再加入0.05 g/L靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL,加DMF至刻度線下3～4 cm,超聲波處理使其溶解,并用DMF定容。計(jì)算靛藍(lán)、靛玉紅加樣回收率。

1.3.4紫外可見分光光度法方法學(xué)考察 紫外可見分光光度法條件:DMF為空白,在200～800 nm的波段掃描。

線性關(guān)系考察:以DMF為空白, 將不同濃度靛藍(lán)、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)溶液用分光光度計(jì)在200～800 nm的波段進(jìn)行掃描,由圖譜確定靛藍(lán)、靛玉紅最大吸收波長(zhǎng)(610 nm和545 nm)。以靛藍(lán)、靛玉紅溶液的濃度為橫坐標(biāo),靛藍(lán)、靛玉紅在其最大吸收波長(zhǎng)處吸光度為縱坐標(biāo)擬合出回歸方程。以DMF為空白,在200～800 nm的波段測(cè)定待測(cè)樣品溶液的吸收光譜,將兩個(gè)最大吸收波長(zhǎng)處吸光度值代入回歸方程,分別計(jì)算出待測(cè)樣溶液中靛藍(lán)、靛玉紅的含量。

穩(wěn)定性試驗(yàn):以DMF為空白對(duì)照,在0、 2、 4、 8、 12、 24 h用紫外分光光度計(jì)分別于靛藍(lán)、靛玉紅最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物樣品溶液,計(jì)算得其靛藍(lán)、靛玉紅含量。精密度試驗(yàn):以DMF為空白,對(duì)20 mg/L靛藍(lán)和18 mg/L靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液用紫外分光光度計(jì)掃描圖譜,重復(fù)6次。重復(fù)性試驗(yàn):取同一種供試品粉末精確稱量,共6份,制備供試品溶液,分別測(cè)試其靛藍(lán)、靛玉紅含量。加樣回收率試驗(yàn):按1.3.3節(jié)中描述的方法進(jìn)行加樣,用分光光度法測(cè)定紫外圖譜,計(jì)算回收率。

1.3.5雙波長(zhǎng)紫外分光光度法方法學(xué)考察 雙波長(zhǎng)紫外分光光度法條件與紫外可見分光光度法相同。

線性關(guān)系考察:以DMF為空白, 將不同濃度靛藍(lán)、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)溶液用分光光度計(jì)在200～800 nm的波段進(jìn)行掃描,由圖譜確定靛藍(lán)、靛玉紅最大吸收波長(zhǎng)(610 nm和545 nm)。以靛藍(lán)、靛玉紅溶液的濃度(c)為橫坐標(biāo),靛藍(lán)、靛玉紅在波長(zhǎng)610 nm或545 nm處吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)Lambert-beer定律:A=Ec[13],由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到4個(gè)吸光系數(shù)(E)。由于靛藍(lán)、靛玉紅的光譜相互重疊,根據(jù)吸光度加和性原理[17]聯(lián)立方程(見式(1)和式(2)),擬合出二元一次方程。

A1=E1c1+E3c2

(1)

A2=E2c1+E4c2

(2)

式中:A1—溶液在靛藍(lán)最大吸收波長(zhǎng)(610 nm)處的吸光度;c1—靛藍(lán)在待測(cè)溶液中的質(zhì)量濃度,mg/L;c2—靛玉紅在待測(cè)溶液中的質(zhì)量濃度,mg/L;A2—溶液在靛玉紅最大吸收波長(zhǎng)(545 nm)處的吸光度;E1、E3—靛藍(lán)、靛玉紅溶液分別在靛藍(lán)最大吸收波長(zhǎng)處的吸光系數(shù);E2、E4—靛藍(lán)、靛玉紅溶液分別在靛玉紅最大吸收波長(zhǎng)處的吸光系數(shù)。

以DMF為空白,在200～800 nm的波段測(cè)定待測(cè)樣品溶液的吸收光譜,將2個(gè)最大吸收波長(zhǎng)處吸光度值代入上述二元一次方程,計(jì)算出待測(cè)樣溶液中靛藍(lán)、靛玉紅的含量。

穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和加樣回收率試驗(yàn)操作均同1.3.4節(jié)。

1.4 分析方法

1.4.1灰分分析 參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[8]中灰分測(cè)定的方法測(cè)定靛藍(lán)提取物。

1.4.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用Kolmogorov-Smirnov法[18]檢驗(yàn)樣品的正態(tài)分布,如果符合正態(tài)分布,測(cè)定誤差屬于隨機(jī)誤差,用t檢驗(yàn)[19]考察3種分析方法中兩兩檢測(cè)值的差異是否顯著,并利用Bland-Altman偏差圖[20]比較測(cè)定結(jié)果值的高低,以及通過Spearman法[21]檢驗(yàn)3種分析方法兩兩測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 灰分分析

各樣品含灰分及酸不溶灰分如表1所示。由表1可知,靛藍(lán)粗提物含灰分49.53%,酸不溶灰分10.58%,兩種灰分差值較大,說明靛藍(lán)粗提物中存在大量的CaCO3、Ca(OH)2、石灰等,酸不溶灰分是非石灰類雜質(zhì),如SiO2;靛藍(lán)酸化物含灰分13.35%,酸不溶灰分5.84%,說明靛藍(lán)粗提物經(jīng)酸化處理后仍有較多無機(jī)物雜質(zhì);乙酸乙酯提取物含灰分3.93%,酸不溶灰分2.73%,說明乙酸乙酯提取物中無機(jī)物含量較少,有機(jī)物含量較高。靛藍(lán)還原物含灰分僅為1.7%,且酸不溶灰分為1.59%,說明靛藍(lán)還原物的主要成分為有機(jī)成分,且石灰類雜質(zhì)已基本除盡。以上數(shù)據(jù)說明靛藍(lán)粗提物中大部分成分是灰分,還原法和乙酸乙酯提取法能去除靛藍(lán)提取物中絕大部分灰分,且效果較好。

表1 各樣品灰分及酸不溶灰分測(cè)定結(jié)果

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果分析

2.2.1線性關(guān)系 在HPLC法、紫外可見分光光度法、雙波長(zhǎng)紫外分光光度法下靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2。表2結(jié)果顯示,所有回歸方程的相關(guān)系數(shù)都不小于0.992,表明這3種方法中靛藍(lán)和靛玉紅在所測(cè)濃度范圍內(nèi)進(jìn)樣濃度(X)與峰面積(Y)呈良好的線性關(guān)系。

表2 各成分的線性關(guān)系

由表2可知,靛藍(lán)在610 nm和545 nm處的吸光系數(shù)分別為68.31和24.50,靛玉紅的則為5.90和38.21,依據(jù)式(1)和式(2)得到雙波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)定溶液在610 nm處的吸光度的計(jì)算公式:A610=68.31c1+5.90c2,溶液在545 nm處的吸光度的計(jì)算公式:A545=24.50c1+38.21c2。

2.2.2精密度 HPLC法測(cè)靛藍(lán)含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)平均值為0.49%,靛玉紅含量RSD平均值為0.44%,表明HPLC法儀器精密度良好;紫外分光光度法測(cè)靛藍(lán)含量RSD平均值為0.30%,靛玉紅含量RSD平均值為0.37%,表明紫外可見分光光度法儀器精密度良好;雙波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)靛藍(lán)含量RSD平均值為0.38%,靛玉紅含量RSD平均值為0.32%,表明雙波長(zhǎng)紫外分光光度法儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性 用高效液相色譜法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量時(shí),發(fā)現(xiàn)12 h內(nèi)靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.96%、 0.56%和1.15%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為2.92%。

用紫外可見分光光度法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量時(shí),發(fā)現(xiàn)12 h內(nèi)靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.05%、 0.73%和0.17%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.09%。

用雙波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量時(shí),發(fā)現(xiàn)12 h內(nèi)靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.95%、 0.54%和0.17%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.09%。

以上數(shù)據(jù)表明:樣品溶液在3種分析方法下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4重復(fù)性 用高效液相色譜法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量時(shí),靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.37%、 0.90%和0.53%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.88%。

用紫外可見分光光度法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量時(shí),靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.36%、 1.05%和5.45%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.58%。

用雙波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量時(shí),靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.15%、 1.16%和5.21%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為4.29%。

以上分析表明:靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物中靛藍(lán)和乙酸乙酯提取物中靛玉紅在3種分析方法下重復(fù)性較好(RSD≤2%),乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)在3種分析方法下重復(fù)性較差(RSD>5%)。

2.2.5加樣回收率 用高效液相色譜法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量的加樣回收率,靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)平均加樣回收率及其RSD分別為98.45%、 98.45%、 106.14%和4.64%、 1.04%、 2.73%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率及其RSD分別為95.7%和1.08%。 數(shù)據(jù)表明:靛藍(lán)酸化物中靛藍(lán)平均加樣回收率一般,靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)平均加樣回收率和乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率較好。

用紫外可見分光光度法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量的加樣回收率,靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)平均加樣回收率及其RSD分別為99.03%、 95.44%、 96.93%和2.90%、 2.51%、 2.27%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率及其RSD分別為95.43%和2.51%。數(shù)據(jù)表明: 3種樣品溶液中靛藍(lán)和乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率均較好。

用雙波長(zhǎng)紫外分光光度法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量的加樣回收率,靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)平均加樣回收率及其RSD分別為102.93%、 96.14%、 94.19%和4.09%、 2.12%、 1.71%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率及其RSD分別為98.18%和3.45%。數(shù)據(jù)表明:靛藍(lán)酸化物中靛藍(lán)平均加樣回收率和乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率一般,靛藍(lán)還原物和乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)平均加樣回收率較好。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1靛藍(lán)酸化物數(shù)據(jù)分析 通過3種分析方法分析不同靛藍(lán)酸化物中靛藍(lán)含量,經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn),HPLC法、紫外可見分光光度(UV)法和雙波長(zhǎng)紫外分光光度(dW-UV)法的置信概率(P)分別為0.31、 0.37、 0.11,這3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果為PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs dW-UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01,數(shù)據(jù)表明這3種分析方法兩兩之間存在顯著差別。通過Bland-Altman偏差圖比較兩種分析方法測(cè)定結(jié)果的均值(圖1),結(jié)果顯示:UV法較HPLC法高1.44%(差值的平均值與差值的95%置信區(qū)間(95%CI):-2.83%～-0.045%);dW-UV法較HPLC法高5.73%(95%CI:-13.64%～2.19%);UV法較dW-UV法低4.29%(95%CI:-11.54%～2.96%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c. UV vs dW-UV

Spearman檢驗(yàn)考察兩兩不同方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性:YUV=1.043XHPLC+0.413(R=0.989,P<0.001);YdW-UV=1.26XHPLC-0.519(R=0.899,P<0.001);YdW-UV=1.21XUV-1.509(R=0.890,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman檢驗(yàn)結(jié)果說明:靛藍(lán)酸化物的HPLC法和UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間存在不一致性(不是所有測(cè)量數(shù)據(jù)均介于95%置信區(qū)間范圍內(nèi)),HPLC法和dW-UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間具有一致性,UV法和dW-UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間具有一致性。

2.3.2靛藍(lán)還原物數(shù)據(jù)分析 通過3種分析方法分析不同靛藍(lán)還原物中靛藍(lán)含量,經(jīng)Kolmogorov- Smirnov檢驗(yàn),HPLC法、UV法和dW-UV法的P分別為0.16、 0.20和0.10, 3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果(PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01)表明3種分析方法兩兩之間存在顯著差別。利用Bland-Altman偏差圖比較兩種方法測(cè)定結(jié)果均值的高低(圖2),結(jié)果顯示:UV法較HPLC法低1.17%(95%CI:-3.20%～5.54%);dW-UV法較HPLC法高2.46%(95%CI:-6.74%～2.18%);UV法較dW-UV法低3.63%(95%CI:-6.16%～-1.11%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman檢驗(yàn)考察兩兩不同方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性:YUV=1.053XHPLC-4.919(R=0.907,P<0.001);YdW-UV=1.065XHPLC-2.089(R=0.941,P<0.001);YdW-UV=1.007XUV+3.157(R=0.971,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman檢驗(yàn)結(jié)果說明:靛藍(lán)還原物的HPLC法和UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間存在不一致性,HPLC法和dW-UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間具有良好的一致性,UV法和dW-UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間具有不一致性。

2.3.3乙酸乙酯提取物數(shù)據(jù)分析

2.3.3.1靛藍(lán) 通過3種分析方法分析不同乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)含量,經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn),HPLC法、UV法和dW-UV法的P分別為0.20、 0.20和0.20,3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果(PHPLC vs UV=0.476,PHPLC vs dW-UV=0.215,PUV vs dW-UV=0.699)表明3種分析方法兩兩之間無顯著差別。利用Bland-Altman偏差圖比較兩種方法測(cè)定結(jié)果均值的高低(圖3),結(jié)果顯示:UV法較HPLC法高0.23%(95%CI:-2.94%～2.49%);dW-UV法較HPLC法高0.30%(95%CI:-2.32%～1.73%);UV法較dW-UV法低0.07%(95%CI:-1.65%～1.51%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman檢驗(yàn)考察兩兩不同方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性:YUV=0.973XHPLC+0.541(R=0.967,P<0.001);YdW-UV=1.028XHPLC-0.031(R=0.983,P<0.001);YdW-UV=1.032XUV-0.307(R=0.975,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman檢驗(yàn)結(jié)果說明:乙酸乙酯提取物的HPLC法和UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間、HPLC法和dW-UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間均具有不一致性,UV法和dW-UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間具有良好的一致性。

2.3.3.2靛玉紅 通過3種分析方法分析不同乙酸乙酯提取物中靛玉紅含量,經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)HPLC法、UV法和dW-UV法的P分別為0.20、 0.20和0.20, 3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果(PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs dW-UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01)表明3種分析方法兩兩之間存在顯著差別。利用Bland-Altman偏差圖比較兩種方法測(cè)定結(jié)果均值的高低(圖4),結(jié)果顯示:UV法較HPLC法高7.16%(95%CI:-15.61%～1.28%);dW-UV法較HPLC法高1.98%(95%CI:-4.25%～0.29%);UV法較dW-UV法高5.18%(95%CI:-1.37%～11.73%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman檢驗(yàn)考察兩兩不同方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性:YUV=1.297XHPLC-1.493(R=0.907,P<0.001);YdW-UV=1.078XHPLC-0.281(R=0.941,P<0.001);YdW-UV=0.824XUV+1.195(R=0.971,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman檢驗(yàn)結(jié)果說明:乙酸乙酯提取物的HPLC法和UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間、HPLC法和dW-UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間、UV法和dW-UV法測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩之間均具有不一致性。

2.4 分析方法的準(zhǔn)確性與實(shí)用性評(píng)價(jià)

2.4.1靛藍(lán)酸化物分析方法評(píng)價(jià) 通過方法學(xué)考察與t檢驗(yàn)結(jié)果可知,用于分析靛藍(lán)酸化物的3種方法兩兩之間存在顯著差別,HPLC法測(cè)量靛藍(lán)酸化物重復(fù)性一般,RSD為2.37%,加樣回收率一般,加樣回收率范圍在95.04%～110.14%,RSD為4.64%;dW-UV法測(cè)量靛藍(lán)酸化物,回收率在96.36%～106.08%之間,RSD為4.09%,回收率一般,而UV法測(cè)量靛藍(lán)酸化物樣品,雖然加樣回收率一般,加樣回收率范圍為95.71%～107.64%,RSD為2.90%,但其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好。因此,針對(duì)靛藍(lán)酸化物,由于樣品中含有未中和的碳酸鈣等無機(jī)雜質(zhì),靛藍(lán)含量低,采用UV法比dW-UV法和HPLC法更快捷和穩(wěn)定。

2.4.2靛藍(lán)還原物分析方法評(píng)價(jià) 通過方法學(xué)考察與t檢驗(yàn)結(jié)果可知,3種方法測(cè)量靛藍(lán)還原物,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好。HPLC法加樣回收率良好,靛藍(lán)加樣回收率在96.88%～99.76%,RSD為1.04%;UV法加樣回收率一般,加樣回收率范圍為:95.71%～107.64%,RSD為2.51%;dW-UV法加樣回收率一般,加樣回收率范圍為:93.51%～99.78%,RSD為2.12%;靛藍(lán)還原物中靛藍(lán)含量明顯高于靛藍(lán)酸化物,碳酸鈣等無機(jī)雜質(zhì)減少,因此,采用HPLC法分析最精準(zhǔn);采用UV法、dW-UV法較為準(zhǔn)確,3種方法均可用于分析靛藍(lán)還原物中靛藍(lán)含量。由于UV法更加便捷快速,所以分析靛藍(lán)還原物中靛藍(lán)最佳方法為UV法。

2.4.3乙酸乙酯提取物分析方法評(píng)價(jià) 通過方法學(xué)考察與t檢驗(yàn)結(jié)果可知,用于分析乙酸乙酯提取物的3種方法兩兩之間存在顯著差別,HPLC法測(cè)量乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)含量,其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好,加樣回收率一般,加樣回收率范圍為101.20%～109.74%,RSD為2.73%;UV法、dW-UV法精密度、穩(wěn)定性良好,但重復(fù)性較差,其RSD分別為5.45%、 5.21%。很明顯,乙酸乙酯提取物中碳酸鈣等無機(jī)雜質(zhì)更少,有機(jī)物增多,靛藍(lán)含量高。因此,采用HPLC法較好,而UV法、dW-UV法重復(fù)性差、不適用。

HPLC法測(cè)量乙酸乙酯提取物中靛玉紅含量,其精密度、重復(fù)性、加樣回收率均良好。穩(wěn)定性一般,RSD為2.92%;UV法、dW-UV法精密度、穩(wěn)定性均良好,但dW-UV法的重復(fù)性較差,其RSD為4.29%,UV法的加樣回收率一般,加樣回收率范圍為90.78%～99.15%,RSD為2.51%。

乙酸乙酯提取物中靛玉紅含量分析適合用HPLC法和UV法。綜合結(jié)果可知,分析乙酸乙酯提取物中靛藍(lán)、靛玉紅含量的最佳方法為HPLC法。

3 結(jié) 論

3.1建立了靛藍(lán)酸化物、靛藍(lán)還原物以及乙酸乙酯提取物中成分含量的HPLC法、紫外可見分光光度法、雙波長(zhǎng)紫外分光光度法3種分析方法,方法學(xué)考察結(jié)果表明:所建立的3種分析方法的線性關(guān)系良好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度好,是3種可靠的靛藍(lán)提取物成分含量分析方法。

3.2通過經(jīng)Kolmogorov-Smirnov法、t檢驗(yàn)、Bland-Altman偏差圖和Spearman法等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)3種靛藍(lán)提取物分析方法進(jìn)行分析,結(jié)果表明:HPLC法準(zhǔn)確性更高,但是相較于紫外可見分光光度法與雙波長(zhǎng)紫外分光光度法耗時(shí)更長(zhǎng),更繁瑣;靛藍(lán)酸化物中靛藍(lán)含量不高,含有較多的碳酸鈣等無機(jī)雜質(zhì),采用紫外可見分光光度法比雙波長(zhǎng)紫外分光光度法和HPLC法更加快捷和穩(wěn)定;3種分析方法均可用于靛藍(lán)還原物中靛藍(lán)含量的分析,由于靛藍(lán)還原物中靛藍(lán)含量較高,雜質(zhì)對(duì)靛藍(lán)含量分析影響較小,故紫外可見分光光度法更便捷快速;乙酸乙酯提取物中碳酸鈣等無機(jī)雜質(zhì)少,有機(jī)物增多,靛玉紅含量高,采用HPLC法較好。