甘達(dá)峰，單艷菊，謝兵紅，束婧婷，劉一帆*

（1.國(guó)營(yíng)崇仁縣畜牧良種場(chǎng)，江西撫州 344200；2.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125）

我國(guó)廣袤的疆域和悠久的歷史孕育了豐富的畜禽遺傳資源。根據(jù)2021 年國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)辦公室公布的 《國(guó)家畜禽遺傳資源品種名錄》，我國(guó)現(xiàn)擁有國(guó)家級(jí)地方品種114 個(gè)，其中包括一系列品種性能優(yōu)異、特色鮮明、國(guó)際知名的地方家禽品種，如狼山雞、絲羽烏骨雞、仙居雞、濟(jì)寧百日雞、北京鴨、百子鵝等，為我國(guó)家禽產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展提供了寶貴的資源庫(kù)。

但在數(shù)十年前，受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)，大量引進(jìn)國(guó)外高產(chǎn)品種，地方家禽遺傳資源受到明顯沖擊。一部分品種被盲目雜交形成專門化品種，品種開(kāi)始混雜，一部分沒(méi)有性能優(yōu)勢(shì)的品種群體數(shù)量逐漸下降，甚至瀕臨滅絕或滅絕。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在 “十三五” 期間公布的瀕危地方家禽品種名錄中金陽(yáng)絲毛雞、四川麻鴨、雁鵝等11 個(gè)品種處于瀕?；?yàn)l臨滅絕狀態(tài)，煙臺(tái)糝糠雞、陜北雞、中山麻鴨3 個(gè)品種已經(jīng)滅絕。加大對(duì)地方家禽遺傳資源保護(hù)力度已經(jīng)到了刻不容緩的地步。

目前應(yīng)用在家禽上的保護(hù)方式主要有2 種：活體保存和冷凍保存，其中活體保存是最常用的保護(hù)方式，根據(jù)不同的保種目標(biāo)和保種條件形成了不同的保種方法。隨著國(guó)家和社會(huì)對(duì)保種力度的不斷加大，保種效果監(jiān)測(cè)越來(lái)越受到保種單位的重視，為評(píng)估不同保種方法的保護(hù)效果，為優(yōu)化保種方案提供了關(guān)鍵的技術(shù)支撐。本文從我國(guó)地方家禽活體保種現(xiàn)狀、活體保種效果監(jiān)測(cè)方法的分類、應(yīng)用現(xiàn)狀和新技術(shù)發(fā)展等方面進(jìn)行闡述，以期為開(kāi)展地方家禽品種保護(hù)和相關(guān)研究提供參考。

1 我國(guó)地方家禽活體保種現(xiàn)狀

目前我國(guó)主要采用活體保種場(chǎng)和基因庫(kù)的方式進(jìn)行地方家禽品種保護(hù)。目前已經(jīng)支持建設(shè)了國(guó)家家禽遺傳資源保種場(chǎng)50 個(gè)，保護(hù)品種主要為 《國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》 收錄的地方家禽品種，還建設(shè)了5 個(gè)國(guó)家家禽遺傳資源基因庫(kù)，分別位于江蘇（雞和水禽）、浙江（雞）、福建（水禽）和廣西（雞）。地方雞保種場(chǎng)一般采取原地保種的形式，即保種場(chǎng)主要建立在品種原產(chǎn)地，能維持品種與生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)的性能特征。而基因庫(kù)主要采用異地保種方式，適合于原產(chǎn)地缺乏保種條件的地方品種進(jìn)行搶救性保護(hù)，群體數(shù)量和純度恢復(fù)后可以逐步向原產(chǎn)地回輸。目前部分珍稀瀕危品種通過(guò)原地和異地方式同時(shí)保護(hù)，有效保障了資源安全。

隨著畜禽保種理論的發(fā)展，已逐漸形成了適合家禽活體保種的一系列保種方法，包括家系等量隨機(jī)選配法、家系等量輪回選配法和隨機(jī)留種選配法等[1]。其中家系等量隨機(jī)選配法是基于隨機(jī)保種理論，并結(jié)合我國(guó)保種實(shí)際而誕生的一種方法，已經(jīng)被國(guó)內(nèi)地方家禽保種單位廣泛采用。

2 活體保種效果監(jiān)測(cè)方法

2.1 表型性狀監(jiān)測(cè)

畜禽遺傳資源保護(hù)最主要的目標(biāo)是維持品種的生產(chǎn)性能穩(wěn)定和重要特性不丟失。目前常用于保種效果監(jiān)測(cè)的表型指標(biāo)包括體型外貌、生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)蛋性能、肉蛋品質(zhì)、屠宰性能和飼料利用率等。通過(guò)對(duì)每個(gè)世代保種群體標(biāo)進(jìn)行表型指測(cè)定，并分析各世代之間的變化趨勢(shì)，從而判斷品種的生產(chǎn)性能和關(guān)鍵特性是否被有效保存。

目前已有許多報(bào)道利用表型監(jiān)測(cè)分析了地方家禽品種的保護(hù)效果。王海龍等[2]分析了1979—2019 年北京油雞保種群體的外貌特征記錄，發(fā)現(xiàn)近40 年來(lái)該品種的關(guān)鍵特征如鳳冠、五趾、脛?dòng)鸬染尸F(xiàn)穩(wěn)定變化趨勢(shì)，說(shuō)明該品種活體保種效果較好。張揚(yáng)等[3]通過(guò)對(duì)浙東白鵝異地保種和原產(chǎn)地群體的生產(chǎn)性能指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)群體在體重、體尺等指標(biāo)上均無(wú)顯著差異，說(shuō)明異地小群保種能有效保存品種特性。

通過(guò)表型性狀監(jiān)測(cè)保種效果具有經(jīng)濟(jì)、高效、快捷等優(yōu)勢(shì)。然而畜禽性狀的形成是遺傳和環(huán)境的共同結(jié)果，僅僅通過(guò)表型性狀監(jiān)測(cè)無(wú)法了解真實(shí)的保護(hù)效果，有必要在分子水平對(duì)保種效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

2.2 分子標(biāo)記監(jiān)測(cè)

豐富的遺傳多樣性是開(kāi)展品種選育提高的基礎(chǔ)，因此，維持遺傳多樣性不降低也是活體保種的主要目標(biāo)。隨著多樣性標(biāo)記監(jiān)測(cè)技術(shù)的發(fā)展，可用于保種檢測(cè)的分子標(biāo)記類型逐漸豐富，基于分子標(biāo)記的監(jiān)測(cè)指標(biāo)體系也愈發(fā)完善。

2.2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記

微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellite marker）也稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記或簡(jiǎn)單核苷酸重復(fù)（Simple nucleotide repeat，SNR）標(biāo)記，是一種常用的分子標(biāo)記技術(shù)。微衛(wèi)星標(biāo)記基于DNA 序列中的短重復(fù)序列，通常由2～6 個(gè)堿基組成，如CA、CT、AT 等。微衛(wèi)星標(biāo)記的分析通常通過(guò)PCR 擴(kuò)增目標(biāo)DNA 序列中的微衛(wèi)星位點(diǎn)，并通過(guò)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度變異來(lái)獲得不同個(gè)體之間的遺傳信息。由于微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度的多態(tài)性、遺傳穩(wěn)定性和重復(fù)性，已成為畜禽保種效果評(píng)價(jià)中最常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一。

李惠龍等[4]應(yīng)用5 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估了2 個(gè)壽光雞群體的保種效果，共檢測(cè)到等位基因53個(gè)，2 個(gè)群體的平均多態(tài)信息含量分別為0.543和0.465，雜合度分別為0.601 和0.523，并通過(guò)UPGMA 聚類顯示2 個(gè)群體遺傳相似性較高，說(shuō)明壽光雞保種效果較好。劉雅麗等[5]選擇28 對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)仙居雞第9 和10 世代2 個(gè)保種群體的遺傳結(jié)構(gòu)，通過(guò)世代間的遺傳差異分析仙居雞的保種效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第9 和10 世代各座位平均等位基因數(shù)為5.5 和5.9 個(gè)，平均多態(tài)信息含量分別為0.5828 和0.5856，平均期望雜合度分別為0.6165 和0.6174，2 個(gè)世代間相似性系數(shù)為0.9735，表明仙居雞采用家系等量留種輪回交配法進(jìn)行保種可行。左瑞華[6]采用6 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)皖西白鵝保種群遺傳多樣性進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)與2005 年相比，2011 年皖西白鵝等位基因數(shù)量明顯下降，且雜合度從0.38 降至0.319，說(shuō)明皖西白鵝遺傳多樣性逐年降低，可能與該品種長(zhǎng)期閉鎖選育有關(guān)。綜合以上結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星已經(jīng)廣泛應(yīng)用于地方家禽保種效果評(píng)價(jià)中。但由于多態(tài)性相關(guān)偏低、試驗(yàn)操作繁瑣等原因，微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于地方品種保種效果評(píng)價(jià)具有一定的局限性。

2.2.2 線粒體DNA 多樣性

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）指基因組中單個(gè)核苷酸發(fā)生變異，是最為常見(jiàn)的遺傳變異類型。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA（mtDNA）發(fā)生突變概率明顯高于基因組其他區(qū)域，因此，該區(qū)域DNA 序列上的SNP 是開(kāi)展品種遺傳多樣性檢測(cè)的理想標(biāo)記[7]。王榮瓊等[8]通過(guò)線粒體D-loop 區(qū)域直接測(cè)序研究了鹽津?yàn)豕请u的保種效果，發(fā)現(xiàn)群體中核苷酸變異位點(diǎn)由2005 年的40 個(gè)降低至2018 年的24 個(gè)，母系世系由6 個(gè)降低至4 個(gè)，表明該品種保種效果欠佳。莫國(guó)東等[9]利用線粒體DNA D-loop 標(biāo)記對(duì)來(lái)自4 個(gè)保種場(chǎng)的廣西三黃雞保種效果進(jìn)行分析，共鑒定到31 個(gè)變異位點(diǎn)，群體平均核苷酸多樣性和單倍型多態(tài)性分別為0.01379 和0.644，遺傳多樣性較為豐富；進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)中介分析發(fā)現(xiàn)，廣西三黃雞具有5 個(gè)血統(tǒng)來(lái)源，主要為周邊地方雞血統(tǒng)，但也存在少量外來(lái)商業(yè)雞種血統(tǒng)，提示個(gè)別保種場(chǎng)需要提純保種。屠云潔等[10]利用線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I（COI）基因多態(tài)性作為研究工具，分析了狼山雞保種群1～5 世代的保種效果，結(jié)果在狼山雞1 和5 世代均鑒定到相同的6 個(gè)突變位點(diǎn)，2 個(gè)世代單倍型多樣性分別為0.276 和0.333，說(shuō)明該品種保護(hù)效果良好。盡管線粒體SNP 標(biāo)記擁有多態(tài)性高、分析成本低等優(yōu)勢(shì)，也難以完全滿足不斷發(fā)展的地方品種保種評(píng)價(jià)需求。因此，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注基因組水平的SNP 標(biāo)記在地方品種保種評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

2.2.3 基因組水平的SNP 標(biāo)記

單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，而且分布在整個(gè)基因組中。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，低成本、大規(guī)模獲取覆蓋基因組的SNP 標(biāo)記的能力得以實(shí)現(xiàn)，推動(dòng)了相關(guān)技術(shù)在群體遺傳分析、性狀關(guān)聯(lián)分析、個(gè)體識(shí)別鑒定等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。與微衛(wèi)星和線粒體DNA 等其他標(biāo)記相比，基因組水平的SNP 在標(biāo)記多樣性方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，但也存在價(jià)格昂貴和分析耗時(shí)等缺點(diǎn)。

目前，常用于保種效果監(jiān)測(cè)的基因組SNP 檢測(cè)技術(shù)包括全基因組重測(cè)序、簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和SNP 芯片等。全基因組重測(cè)序可以對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，為SNP 標(biāo)記的檢測(cè)提供全面且高分辨率的信息。簡(jiǎn)化基因組測(cè)序是基于限制性內(nèi)切酶隨機(jī)對(duì)基因組片段進(jìn)行測(cè)序，可以降低成本和測(cè)序量。而SNP 芯片是一種基于高通量芯片技術(shù)的分型方法，具有準(zhǔn)確性高和時(shí)效快等優(yōu)點(diǎn)。

Zhang 等[11]通過(guò)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序分析了國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)（江蘇）保存的白耳黃雞、北京油雞和狼山雞的保種效果，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)品種遺傳多樣性均較高，群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)各個(gè)品種內(nèi)沒(méi)有明顯分化；通過(guò)LD 和ROH 分析也顯示各個(gè)品種均維持較低的近交程度，說(shuō)明該單位采取的保種方案科學(xué)可行。李毅毅[12]采用全基因組重測(cè)序技術(shù)分析了固始雞不同世代和不同保種方式保種群體遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)的變化，共獲得19.3Mb 高質(zhì)量SNP 用于后續(xù)分析，發(fā)現(xiàn)原位保種群的遺傳多樣性高于異位保種群，且隨著世代變化有所降低，通過(guò)進(jìn)化樹(shù)和主成分分析發(fā)現(xiàn)各個(gè)群體均未出現(xiàn)明顯分層，還通過(guò)FST 分析鑒定到了一系列與保種過(guò)程相關(guān)的候選基因。李凱航等[13]采用 “京芯一號(hào)” SNP 芯片對(duì)浦東雞群體進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示群體期望雜合度為0.3786、觀察雜合度為0.3805，說(shuō)明該群體的遺傳多樣性較低，同時(shí)利用聚類分析將300 只公母雞劃分為38 個(gè)家系。Zeng 等[14]通過(guò)全基因組重測(cè)序分析了不同保護(hù)方式下的地方雞種的遺傳變異變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)地方雞種的遺傳多樣性和分化在原產(chǎn)地保護(hù)過(guò)程中升高，而在異地保護(hù)過(guò)程中遺傳多樣性有降低趨勢(shì)，可能是由于在原產(chǎn)地保種歷程中，其保存和持續(xù)收集的品種類群（類型）更為全面，而異地保種群一直未再有品種其他類群（類型）引入。為評(píng)價(jià)高郵鴨原種場(chǎng)的保種效果，劉宏祥等[15]利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序分析了原始群體和保種群體的遺傳多樣性差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與原始群體相比，原種場(chǎng)群體遺傳雜合度保持不變，近交系數(shù)有所下降；原種場(chǎng)群體與環(huán)境應(yīng)激和甲基化調(diào)控相關(guān)的基因受到了一定程度的選擇，表明高郵鴨原種場(chǎng)群體保種效果較好。目前，應(yīng)用基因組測(cè)序或SNP 芯片能夠獲得最為全面科學(xué)的保種效果評(píng)價(jià)結(jié)果，但過(guò)高的成本限制了該技術(shù)的大規(guī)模推廣應(yīng)用。

3 家禽活體保種效果監(jiān)測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)

盡管目前已經(jīng)存在一系列保種效果監(jiān)測(cè)方法，但這些方法在生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用受到一些弊端的限制。如微衛(wèi)星和線粒體DNA 標(biāo)記由于多態(tài)性較低，功能較為單一，難以適應(yīng)日益復(fù)雜的保種需求。重測(cè)序和固相芯片雖然近年來(lái)價(jià)格有所降低，但對(duì)于保種單位來(lái)說(shuō)仍然是一筆不小的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著近年來(lái)國(guó)家對(duì)地方畜禽遺傳資源保護(hù)重視程度的提高，保種單位對(duì)開(kāi)展保種效果監(jiān)測(cè)的需求越來(lái)越大，因此，建立一種科學(xué)、高效、低廉的保種效果監(jiān)測(cè)技術(shù)成為當(dāng)前保種研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)方向。

靶向測(cè)序基因型檢測(cè)（Genotyping by target sequencing，GBTS）技術(shù)是一種結(jié)合了簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和固相芯片特點(diǎn)的基因組SNP 檢測(cè)技術(shù)[16]。該技術(shù)通過(guò)針對(duì)性設(shè)計(jì)能夠特異性捕獲目標(biāo)區(qū)域的引物或探針，并以此對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行高深度測(cè)序（100～300×）獲得基因型結(jié)果，具有準(zhǔn)確度高、成本低廉、定制性強(qiáng)的明顯優(yōu)勢(shì)。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用豬、雞、羊等畜種中，用于保種和選育相關(guān)芯片的開(kāi)發(fā)。江蘇省家禽科學(xué)研究所的研究人員已經(jīng)利用GBTS 技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種適合中國(guó)地方雞種保種監(jiān)測(cè)的液相SNP 芯片，共收錄了5847 個(gè)在基因組分布均勻的SNP 位點(diǎn)，已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)（ZL202210206840.8）。芯片位點(diǎn)來(lái)源于33 個(gè)地方雞品種全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果，保證了位點(diǎn)在地方雞群體中擁有較高的檢出率和遺傳多樣性。在多個(gè)群體中的應(yīng)用結(jié)果表明，該芯片在遺傳多樣性評(píng)估方面的性能與微衛(wèi)星標(biāo)記相當(dāng)，同時(shí)還能滿足系譜校準(zhǔn)、群體結(jié)構(gòu)分析等保種需求，可以為地方雞保種單位優(yōu)化保種方案、提高保種效果提供技術(shù)支撐。

4 展望

地方家禽遺傳資源的生物多樣性是滿足產(chǎn)業(yè)需求日益發(fā)展的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)，也是開(kāi)展相關(guān)科學(xué)研究的寶貴資源。保種效果監(jiān)測(cè)作為家禽保種工作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，隨著活體保種方法以及生物保種技術(shù)的不斷發(fā)展，保種效果監(jiān)測(cè)在今后必將發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。為進(jìn)一步完善保種效果監(jiān)測(cè)方法體系，有必要開(kāi)展適合活體監(jiān)測(cè)的新多樣性標(biāo)記的篩選，同時(shí)應(yīng)加快建立技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，用于大規(guī)模的推廣應(yīng)用。