劉一凡,林佳靜,林 源,鄧 紅,王欣怡,徐傳皓,王凱博,韓 梅,劉榮清

VEGF為促進(jìn)血管新生的因子,對內(nèi)皮細(xì)胞的間接分裂和增生有促進(jìn)作用,可改善血管通透性,具有推進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[1]。且VEGF-VEGFR信號傳導(dǎo)通路是誘導(dǎo)血管生成的最關(guān)鍵途徑[2],在VEGF的受體中,VEGFR-2(KDR)是主要受體,其表達(dá)水平與血管內(nèi)皮細(xì)胞的更新速率呈正相關(guān)。有研究表明,KDR過度表達(dá)會導(dǎo)致胃癌患者病情惡化[3]。本文比較了胃癌組織與癌旁組織之間、有無轉(zhuǎn)移胃癌組織之間以及不同浸潤深度胃癌組織之間血管生成的差別,分析 VEGF、VEGFR-2表達(dá)情況對胃癌血管生成的影響,為研究胃癌血管生成機(jī)制和胃癌治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院于2007年9月至2009年9月間接受手術(shù)治療的胃腺癌49例患者的胃癌組織樣本和癌旁組織樣本,其中男性39例,女性10例,年齡38～78歲。所有患者已知情、同意,且術(shù)前均未進(jìn)行過放療、化療。將49例病例按TNM分期分為T1T2組(8例)、T3組(20例)和T4組(21例);按有無轉(zhuǎn)移分為有轉(zhuǎn)移40例,無轉(zhuǎn)移9例。手術(shù)中取出的癌癥標(biāo)本和距離手術(shù)殘端僅1 cm的癌旁組織被分成兩部分,其中一部分立即在液氮中冷凍,然后在-80 ℃的冰箱中保存用于Western-blot實驗;另一份固定在10%福爾馬林中并嵌入常規(guī)石蠟中用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.2 主要試劑:采用武漢博士德公司制作的抗CD34兔多克隆抗體;凱基生物公司制作的全蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒;中山金橋公司生產(chǎn)的山羊抗兔二步法免疫組化檢測試劑、山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑;Santa公司制作的VEGF抗體、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院雷和田教授饋贈的VEGFR-2抗體。

1.3 CD34染色檢測胃癌組織的微血管密度:胃癌組織用石蠟包埋后切片,將切片沖洗并干燥、脫蠟、修復(fù)抗原、滴加10%驢血清在室溫下封閉15 min,然后加抗CD34兔多克隆抗體(1∶100稀釋)過夜,二抗為辣根酶標(biāo)記羊抗兔多聚體,孵育30 min后用PBS洗凈,滴加DAB顯色液顯色。在顯微鏡下找到染為棕色的內(nèi)皮細(xì)胞分布最多的視野,在200×視野內(nèi)的任何5個未重疊的視野中計數(shù)陽性血管的數(shù)目,用單位面積(×200)內(nèi)CD34陽性血管的數(shù)量作為微血管密度(MVD)。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測胃癌組織中VEGF:取石蠟包埋的胃癌組織切片,制片步驟與上述步驟相同。加兔抗VEGF多克隆一抗抗體(1∶50稀釋)過夜,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多聚體的二抗在室溫孵育30 min,PBS洗滌,并通過滴加DAB顯色液顯色。顯微鏡下VEGF定位于胞漿中,呈棕黃色片狀或者顆粒狀。每張切片不少于5個隨機(jī)選擇的視野,用400倍光學(xué)顯微鏡觀察拍攝。用Image pro plus 6.0版執(zhí)行圖像分析,以平均光密度來顯示相對表達(dá)量,平均光密度值(AOD)=總體光密度值/陽性面積。

1.5 Western-blot法檢測胃癌組織中VEGF、VEGFR-2水平:根據(jù)全蛋白提取試劑盒的說明提取組織蛋白,并使用BCA試劑盒測定蛋白濃度,調(diào)整最終濃度為10 μg/μL。配膠后,向每個孔中添加20 μL蛋白,電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,并在室溫下用3%牛血清白蛋白封閉90 min。分別加入1∶100稀釋的兔VEGF多克隆抗體、1∶500稀釋的兔VEGFR-2多克隆抗體、1∶1 000稀釋的兔β-actin單克隆抗體,于4 ℃過夜,清洗膜后,分別添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多聚體,在室溫下孵育90 min并使用DAB試劑盒顯色5 min終止反應(yīng)。將膜放于凝膠成像儀中進(jìn)行掃描。測出VEGF、VEGFR-2和內(nèi)參β-actin的表達(dá)強度,按下面公式計算相對表達(dá)量,蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同階段胃癌組織中微血管密度比較:CD34位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中,其陽性顯示為棕黃色,見圖1(封3)。胃癌組織中MVD(11.20±3.66)高于癌旁胃組織(2.87±2.63)(P﹤0.05);有轉(zhuǎn)移的胃癌組織MVD(11.94±3.28)高于無轉(zhuǎn)移的胃癌組織(6.96±2.24)(P﹤0.05);胃癌T4期中的MVD(13.34±3.74)高于胃癌T1T2期(7.93±3.10)(P﹤0.05);胃癌T4期中的MVD高于胃癌T3期(9.83±2.00)(P﹤0.05)。

2.2 不同階段胃癌組織VEGF水平比較:采用免疫組化法檢測VEGF的表達(dá)量,胃癌組織(0.35±0.03)高于癌旁組織(0.04±0.02)(P﹤0.05),胃癌組織間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2(封3)。Western-blot結(jié)果顯示,胃癌組織中VEGF相對表達(dá)量(0.35±0.12)高于癌旁組織(0.17±0.09)(P﹤0.05),在有轉(zhuǎn)移的胃癌組織中VEGF相對表達(dá)量(0.37±0.13)高于無轉(zhuǎn)移的胃癌組織(0.25±0.04)(P﹤0.05);T4期胃癌組織中VEGF相對表達(dá)量(0.40±0.10)高于T1T2期(0.10±0.03)(P﹤0.05);T4期胃癌組織中的VEGF相對表達(dá)量高于T3期(0.33±0.14)(P﹤0.05)。

2.3 不同階段胃癌組織中VEGFR-2的比較:VEGFR-2的相對表達(dá)量胃癌組織(0.15±0.06)高于癌旁胃組織(0.13±0.04)(P﹤0.05),有轉(zhuǎn)移的胃癌組織(0.16±0.06)高于無轉(zhuǎn)移的胃癌組織(0.11±0.02)(P﹤0.05)。T1T2期與T3期,T1T2期與T4期,T3期與T4期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。

2.4 胃癌組織中VEGF、VEGFR-2表達(dá)與微血管密度的相關(guān)性分析:胃癌組織中,VEGF與微血管密度呈正相關(guān)(r= 0.510,P<0.05);VEGFR-2與微血管密度呈正相關(guān)(r= 0.297,P<0.05)。

3 討論

胃癌是胃腸道的常見惡性腫瘤之一[4]。血管生成在保持正常人體生理狀態(tài)中起著至關(guān)重要的作用,因為血管能夠?qū)I養(yǎng)物質(zhì)攜帶到組織和器官,并清除分解代謝產(chǎn)物[5]。然而,不受控制的血管生長可以參與多種病理過程,如腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[6]。檢驗組織中血管形成的重要指標(biāo)之一為MVD。本研究中,胃癌組織的MVD顯著高于癌旁胃組織,而轉(zhuǎn)移和浸潤較深的胃癌組織的MVD明顯升高。提示微血管密度與胃癌轉(zhuǎn)移和浸潤有關(guān),較高的MVD可能促進(jìn)胃癌的進(jìn)展,促進(jìn)浸潤轉(zhuǎn)移。

VEGF分子量15～45 kDA對血管內(nèi)皮細(xì)胞起直接作用,是新生血管生理和病理過程中內(nèi)皮細(xì)胞形成的關(guān)鍵生長因子。VEGF家族成員主要通過3個跨膜酪氨酸激酶受體家族發(fā)揮生物學(xué)功能,包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3[7]。VEGF與VEGFR通過旁分泌方式共同調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育,并參與調(diào)節(jié)血管生成,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8]。近年來的一些研究證實,VEGF與其受體(VEGFR-2)通過多種機(jī)制增加癌癥轉(zhuǎn)移,包括刺激腫瘤血管生成,在腫瘤中形成紊亂的原始血管,以及通過重塑腫瘤血管增進(jìn)癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用改變宿主大環(huán)境并促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等[9]。本文通過免疫組化和Western-blot檢測均證實胃癌組織中VEGF呈現(xiàn)高表達(dá),且VEGF與MVD呈正相關(guān)。同時,在對VEGFR-2的檢測中也發(fā)現(xiàn),胃癌組織中VEGFR-2也呈高表達(dá),且VEGFR-2與MVD也呈正相關(guān)。提示在胃癌中,VEGF結(jié)合VEGFR-2可增加腫瘤微血管形成,并通過微血管給腫瘤組織輸送營養(yǎng),進(jìn)而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展、浸潤轉(zhuǎn)移。

綜上所述,本文證實了胃癌微血管生成促進(jìn)其轉(zhuǎn)移和浸潤,且VEGF/VEGFR-2對胃癌血管的生成有促進(jìn)作用。