康 東,馬譽(yù)珊,馮鈺迪,游顏杰

肝細(xì)胞癌(HCC)為全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和病死率均居高不下。研究顯示,全世界每年死于HCC的人數(shù)近70萬(wàn),死亡率也在逐年升高[1-2]。HCC是一種復(fù)雜的惡性疾病,涉及多種基因和多種因素。其病因、發(fā)病機(jī)制以及預(yù)后影響因素尚未完全闡明,多種基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3-5]。因此,深入探尋分子標(biāo)志物在早期診斷和治療肝細(xì)胞癌方面的應(yīng)用對(duì)于臨床實(shí)踐具有至關(guān)重要的意義[6]。細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶10(CDK10)是一種絲/蘇氨酸相關(guān)的激酶,為CDK家族中的一員[7-9]。研究表明,CDK10在多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期的G2期到M期參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[10-11]。本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)CDK10在HCC組織中的表達(dá)水平,分析HCC與癌旁組織中CDK10蛋白表達(dá)的差異,探討其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:HCC石蠟組織芯片購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司,收集2007年1月至2009年11月接受治療性外科手術(shù)經(jīng)病理證實(shí)且臨床資料完整的94例原發(fā)性HCC患者資料及其相應(yīng)癌旁肝組織86例。94例原發(fā)性HCC組織中,女性10例,男性84例,年齡25～73歲,平均年齡53.6歲;根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[12],TNM Ⅰ～Ⅱ期43例,TNM Ⅲ～Ⅳ期43例,缺失8例;按照病理Edmondson分級(jí),Ⅰ～Ⅱ級(jí)66例,Ⅲ級(jí)28例。隨訪時(shí)間截至2013年9月,隨訪期內(nèi)66.7%的患者死于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。所有患者無(wú)術(shù)前放療或化療等相關(guān)輔助治療史。該研究經(jīng)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)核準(zhǔn)(2021PYZX008)。

1.2 主要試劑:Abcam公司提供了兔抗人多克隆CDK10抗體,EnVision和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色:采用EnVision二步法對(duì)HCC石蠟切片組織進(jìn)行檢測(cè),具體的步驟遵循實(shí)際說(shuō)明書(shū)的規(guī)定進(jìn)行操作。所有切片的陰性對(duì)照組均使用未免疫兔血清IgG代替一抗。

1.4 結(jié)果判定:CDK10免疫組化染色顯示細(xì)胞質(zhì)中有明顯的黃色至棕黃色顆粒,為陽(yáng)性細(xì)胞信號(hào)。每個(gè)切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(×400),每個(gè)視野下計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。采用半定量(即染色強(qiáng)度評(píng)分結(jié)合細(xì)胞陽(yáng)性率)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)。①染色強(qiáng)度評(píng)分中,0分為未染色細(xì)胞,1分為細(xì)胞染淡黃色,2分為細(xì)胞染棕黃色,3分為細(xì)胞染褐色;②細(xì)胞陽(yáng)性率評(píng)分中,0分為細(xì)胞陽(yáng)性率≤25%,1分為細(xì)胞陽(yáng)性率在25%～50%,2分為細(xì)胞陽(yáng)性率50%～75%,3分為細(xì)胞陽(yáng)性率≥75%。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分和細(xì)胞陽(yáng)性率評(píng)分的乘積結(jié)果,將其分為2組,評(píng)分結(jié)果≤3分為CDK10抗體低表達(dá)組,評(píng)分結(jié)果>3分為CDK10抗體高表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料以n(%)表示;計(jì)數(shù)資料組間差異性分析采用χ2檢驗(yàn),若理論頻數(shù)<1采用Fisher確切概率法,生存期分析采用Kaplan-Meier法;單因素與多因素分析均使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDK10在肝細(xì)胞癌及配對(duì)癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平:CDK10蛋白主要分散于HCC細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈棕黃色顆粒狀。在配對(duì)癌旁組織中陽(yáng)性率為59.30%,而在HCC組織中僅有32.98%的陽(yáng)性率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1(目次后)和表1。

表1 CDK10在肝細(xì)胞癌及配對(duì)癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平[n(%)]

2.2 CDK10蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系:CDK10低表達(dá)與HCC患者病理分級(jí)、腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、腫瘤大小、AFP有相關(guān)性(P<0.05);與年齡、性別、有無(wú)腫瘤血栓形成、有無(wú)肝硬化及一些免疫組化指標(biāo)如CD34、Ki67、TP53、PDL1及CD8均無(wú)相關(guān)性(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 CDK10蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 肝細(xì)胞癌組織中CDK10的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系:對(duì)94例HCC患者的生存時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析,HCC組織中高表達(dá)CDK10組的HCC患者累積生存率明顯高于低表達(dá)CDK10組(P<0.05)。根據(jù)Cox回歸模型的單因素和多因素分析結(jié)果得出結(jié)論,在單因素分析中發(fā)現(xiàn)影響HCC患者預(yù)后的因素包括CDK10表達(dá)、有無(wú)腫瘤血栓形成、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期以及腫瘤大小(P<0.05);經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn),CDK10表達(dá)和組織學(xué)分級(jí)(P<0.05)可作為HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,見(jiàn)表3。

表3 肝細(xì)胞癌患者預(yù)后因素COX回歸模型分析

3 討論

HCC發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)涉及多個(gè)基因和多種因素的復(fù)雜過(guò)程,需要綜合考慮多種因素的作用。HCC發(fā)生率在我國(guó)居第3位,僅次于肺癌和胃癌[13]。HCC的早期篩查主要是通過(guò)影像學(xué)和血清學(xué)聯(lián)合監(jiān)測(cè)[14-16]。盡管近年來(lái)分子靶向、免疫治療等多種手段常應(yīng)用于HCC臨床診治,但總體療效不理想[17-19]。因此尋找新型生物標(biāo)志物對(duì)于改善HCC患者的整體預(yù)后有著十分重要的意義及臨床應(yīng)用價(jià)值。

CDK10是一種與絲/蘇氨酸相關(guān)的激酶,是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族成員之一,在調(diào)控細(xì)胞周期G2期到M期的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。隨著CDK家族成員的生理功能逐漸被發(fā)現(xiàn),我們?cè)絹?lái)越多地認(rèn)識(shí)到CDK在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起著至關(guān)重要的作用。近年來(lái)的研究報(bào)道稱,CDK10作為CDK家族的成員具有相似的生理功能,在許多腫瘤組織及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)均有上調(diào)或下調(diào),在不同的腫瘤組織和細(xì)胞中通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究證實(shí)CDK10表達(dá)在胃癌組織中顯著下調(diào),在胃癌組織中CDK10表達(dá)水平下降與腫瘤分化程度、臨床分期和患者生存時(shí)間密切相關(guān)[20]。根據(jù)本研究免疫組化結(jié)果,在HCC組織中,CDK10的表達(dá)量顯著下調(diào),明顯低于癌旁組織。生存分析結(jié)果也表明CDK10高表達(dá)的患者總生存期較低表達(dá)患者顯著延長(zhǎng),進(jìn)一步提示CDK10高表達(dá)患者具有較高的生存率和較低的復(fù)發(fā)率。此外,COX單因素顯示CDK10表達(dá)水平、有無(wú)腫瘤血栓形成、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及腫瘤大小均為HCC患者存活時(shí)間的相關(guān)影響因素。以上5個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單因素代入COX多因素分析顯示,CDK10表達(dá)水平和組織學(xué)分級(jí)可以成為HCC患者預(yù)后預(yù)測(cè)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示CDK10表達(dá)可能是預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物,在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著抑癌的作用。由于目前只驗(yàn)證了部分臨床標(biāo)本,本研究還未能體現(xiàn)CDK10在HCC中的具體分子及信號(hào)通路,有待擴(kuò)大樣本量在以后的研究中繼續(xù)探索,以期為HCC的診治提供更多參考。

綜上所述,CDK10可能作為抑癌基因在HCC患者的腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài),并與HCC惡性臨床病理特征相關(guān)。對(duì)于CDK10的深入研究,有助于進(jìn)一步闡明HCC的發(fā)病機(jī)制并完善其診療方案。