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結(jié)核分枝桿菌H37Rα感染肺泡巨噬細(xì)胞外泌體提取及鑒定

2024-01-13 06:59楊萬忠戈朝暉
寧夏醫(yī)學(xué)雜志 2023年12期
關(guān)鍵詞:泌體磁珠外泌體

馬 榮,楊萬忠,戈朝暉

外泌體是細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)之一,在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色[1-2],近年來,外泌體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究熱度不斷上升。結(jié)核分枝桿菌是一種常見的致病菌,其感染可導(dǎo)致肺部炎癥損害[3-4]。然而,目前對(duì)于結(jié)核分枝桿菌感染對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞外泌體分泌的影響尚不清楚。因此,本研究旨在通過建立結(jié)核分枝桿菌H37Rα菌株刺激的RAW264.7細(xì)胞模型,探討其感染對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞外泌體的影響,并對(duì)外泌體的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分析鑒定。本研究將可能對(duì)外泌體在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器:小鼠單核巨細(xì)胞(RAW264.7,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫),結(jié)核分枝桿菌(H37Rα,上海唯問生物技術(shù)有限公司),蛋白質(zhì)印跡法(WB)專用細(xì)胞裂解液(上海晶諾生物科技有限公司),TSG101 (武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),CD63、CD81[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司],超濾管(Millipore,美國(guó)),T-25 培養(yǎng)瓶(Corning,中國(guó)),96、24 孔培養(yǎng)板(NEST,美國(guó)),透析袋(BLUEBIRD,美國(guó)),DEM-3 型自動(dòng)洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司),酶標(biāo)儀(BIO-RAD 680,美國(guó)),二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO,日本),HD-4 層析工作站(上海滬西儀器廠),胎牛血清、DMEM、HAT(Sigma,美國(guó)),PEG 4000(Merck,德國(guó)),HiTrap protein G、硝酸纖維素膜(Amersham,美國(guó)),蛋白Marker(Fermentas,美國(guó)),外泌體抽提試劑盒(翊圣生物,41201ES25),層析柱(Phamacia,美國(guó)),蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移儀(Bio-Rad,美國(guó)),NanoDrop超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó)),透射式電子顯微鏡 HT-7700 (Hitachi,日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng):取新鮮雞蛋18~20個(gè),清潔外殼,在75%酒精中浸泡1 h,使用無菌鑷子打開雞蛋的一端,將蛋液全部倒入無菌三角燒瓶中,用無菌玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆颉8牧剂_氏培養(yǎng)基制備方法為稱量磷酸二氫鈉1.2 g、硫酸鎂0.12 g、天門冬素1.8 g、枸櫞酸鈉0.3 g、氯化鈉5 g、純甘油6 mL、輔酶A 400 U、三硫酸腺苷40 mg、蒸餾水300 mL,加熱溶解,冷卻后加入15 g新鮮馬鈴薯粉,逐漸加熱至沸騰,不斷攪拌,約20 min后(56 ℃)加入全蛋液500 mL、人血清20 mL以及10 g/L孔雀綠水溶液20 mL,玻璃棒攪拌均勻,按6 mL/管分裝至15×16 mm玻璃試管中,置于血清凝固器中使培養(yǎng)基凝固成斜面(90 ℃,1 h),無菌試驗(yàn)合格后備用。結(jié)核分枝桿菌H37Rα菌株接種于改良羅氏培養(yǎng)基中,生長(zhǎng)20 d后收集菌體。

1.2.2 單核巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng):RAW264.7完全培養(yǎng)90%RPMI1640+10% FBS+100U/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素將RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后,離心,棄去上清液,加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中,在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,定時(shí)觀察并更換新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)24~48 h。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌H37Rα菌株刺激肺泡巨噬細(xì)胞系RAW264.7的實(shí)驗(yàn)分組與設(shè)計(jì):建立結(jié)核分枝桿菌(MTB)刺激的巨噬細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為感染組與非感染組,以感染復(fù)數(shù)(MOI)為 10 的比例將感染組的巨噬細(xì)胞 RAW264.7 用H37Rα菌株進(jìn)行感染刺激。分別配制含有10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(青、鏈霉素)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基與僅含10%胎牛血清(FBS)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。非感染組空白培養(yǎng)基刺激巨噬細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組以H37Rα刺激細(xì)胞。在37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后收集H37Rα菌株感染的巨噬細(xì)胞模型。

1.2.4 外泌體抽提

1.2.4.1 外泌體抽提試劑盒:取10 mL細(xì)胞上清液,加入2.5 mL外泌體抽提試劑(41201-A),采用渦旋震蕩混勻1 min,于4 ℃靜置2 h;10 000 g、4 ℃離心60 min,棄上清液,收集沉淀(盡可能吸盡上清);取100 μL 1×PBS均勻吹打沉淀物,使其充分混勻,并轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中;12 000 g、4 ℃離心2 min,所得外泌體沉淀用100 μL 1×PBS 重懸。BCA法蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度為0.5 mg/mL。

1.2.4.2 電鏡檢測(cè):取10 μL新鮮外泌體溶液,以30 g/L磷鎢酸染色5 min,染色后的外泌體滴于銅網(wǎng)膜上,于65 ℃烤干,在透射電鏡下觀察。

1.2.5 Western-blot檢測(cè):取50 μL外泌體,加入等體積的WB專用蛋白裂解液,加入上樣緩沖液,將其加熱至100 ℃并保持10 min使蛋白質(zhì)變性,之后冷卻至室溫。配制濃度為12%分離膠和5%的濃縮膠,上樣進(jìn)行電泳,將蛋白質(zhì)根據(jù)大小進(jìn)行分離。通過Trans-blot turbo轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1.5 h,然后加入TGS101、CD63、CD81抗體,并在4 ℃孵育,過夜。將PVDF膜置于保鮮膜上,用TBST溶液洗滌PVDF膜3次,每次10 min。然后加入相應(yīng)的二抗,室溫下反應(yīng)1.5 h。用TBST溶液再次洗滌PVDF膜3次,每次10 min。然后移入凝膠成像分析儀中,用化學(xué)光敏模式曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 外泌體電鏡及NTA檢測(cè):外泌體的電鏡檢測(cè)結(jié)果見圖1(目次后)。透射電鏡下提取的兩組外泌體均呈圓形或類圓形,部分呈鵝卵石樣,粒徑20~140 nm,其具有典型的杯狀形態(tài)和脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。將分離后的外泌體按1∶100比例重懸到1 mL無菌水中,應(yīng)用NTA分析記錄外泌體的直徑和大小分布。NTA檢測(cè)顯示感染組外泌體粒徑峰值124 nm,非感染組外泌體粒徑峰值133 nm。

2.2 Western-blot檢測(cè)外泌體表面蛋白TGS101、CD63、CD81:蛋白免疫印跡驗(yàn)證提取外泌體的特征蛋白,Western-blot技術(shù)對(duì)感染組與非感染組的外泌體表面的標(biāo)志性蛋白TGS101、CD63、CD81進(jìn)行了檢測(cè)。H37Rα感染組和非感染組的外泌體表面標(biāo)志性蛋白檢測(cè)結(jié)果均為陽性,見圖2(目次后)。

3 討論

外泌體是一種由活細(xì)胞分泌、直徑為30~150 nm、由雙層脂質(zhì)膜構(gòu)成的小囊泡[5]。它在機(jī)體內(nèi)廣泛分布,分布于外周血、腹水、大小便、唾液、腦脊液以及各類體液等[6-7]。外泌體所攜帶的各種蛋白質(zhì)、脂肪、DNA和RNA等重要信息,不僅在細(xì)胞與細(xì)胞間的物質(zhì)和信息傳遞中起重要作用,更有望成為多種疾病的早期診斷標(biāo)志物[8-9]。外泌體的提取與分離方法通常包括密度梯度離心、超速離心、體積排阻、免疫磁珠、聚合物沉淀以及試劑盒等方法[10-11]。超速離心法[12]是最早的外泌體分離技術(shù),通過高速離心機(jī)將細(xì)胞上清液中的外泌體分離出來。該方法分離得到的外泌體純度較高,但是產(chǎn)量較低,不適用于大規(guī)模研究;密度梯度離心法通過將細(xì)胞上清液置于不同密度的梯度介質(zhì)中,利用外泌體在不同介質(zhì)中的密度差異而逐漸沉淀,然后收集沉淀物中的外泌體,該方法分離得到的外泌體產(chǎn)量較高,但是純度較低;免疫磁珠法[13]利用外泌體表面抗原與特異性抗體結(jié)合的原理,將外泌體與免疫磁珠特異性結(jié)合,并通過磁場(chǎng)將免疫磁珠與外泌體分離,該方法分離得到的外泌體純度較高,但是需要特殊的設(shè)備和試劑;聚合物沉淀法利用某些聚合物的電荷吸附作用,將細(xì)胞上清液中的外泌體吸附并沉淀下來,然后收集沉淀中的外泌體,該方法分離得到的外泌體產(chǎn)量較高,但是純度較低。選擇合適的方法是進(jìn)行外泌體相關(guān)研究的關(guān)鍵。本研究采用結(jié)核分枝桿菌H37Rα穩(wěn)定減毒株進(jìn)行研究。為確保實(shí)驗(yàn)的安全性和高效性,本研究特別選擇了免疫磁珠法,其原理主要基于外泌體的生物學(xué)特性以及膜蛋白和外泌體特異性標(biāo)記物的相互作用。試劑盒使用了免疫磁珠這一高親和力材料,它具有特異性結(jié)合外泌體膜蛋白的能力,外泌體膜蛋白與試劑盒材料發(fā)生結(jié)合形成復(fù)合物,通過離心后復(fù)合物會(huì)沉降,從而與上清液分離。

本研究中感染組的外泌體均可觀察到典型的杯狀形態(tài)和雙層膜結(jié)構(gòu),且外泌體的粒徑大小分布圖均為單一主峰,無明顯的雜峰,說明提取的外泌體粒徑分布均勻,質(zhì)量穩(wěn)定。此外,外泌體還有一些標(biāo)志性的蛋白質(zhì)組成,為其鑒定提供了更為充足的證據(jù)。通過Western-blot技術(shù)檢測(cè)非感染組和感染組的外泌體的跨膜蛋白CD9和CD81,均為陽性,說明所提取的細(xì)胞外囊泡的表面標(biāo)志蛋白符合外泌體的表征。

本研究采用建立結(jié)核分枝桿菌H37Rα菌株刺激的肺泡巨噬細(xì)胞模型,利用試劑盒法成功分離并提取出外泌體,并對(duì)外泌體的形態(tài)特征進(jìn)行分析和鑒定。通過測(cè)定其生物特異性標(biāo)志蛋白以及形態(tài)學(xué)分析,表明提取的外泌體含量和純度均較高,為今后進(jìn)一步深入研究巨噬細(xì)胞來源的外秘體在結(jié)核病中的免疫應(yīng)答提供了重要依據(jù),以確保今后有關(guān)試驗(yàn)的順利開展。

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