朱 艷,張金金,潘 薇,田建英

2型糖尿病是一種以胰島素分泌和作用受損為特征的代謝性疾病[1],已成為全球性流行病。長(zhǎng)期慢性高血糖可導(dǎo)致多種微血管及神經(jīng)病變。糖尿病的眼部并發(fā)癥包括糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、糖尿病視神經(jīng)病變、白內(nèi)障和眼表疾病等[2]。目前,糖尿病眼部并發(fā)癥的研究主要集中在眼底病變方面,例如DR已經(jīng)得到了廣泛的研究。有研究指出,糖尿病患者眼表并發(fā)癥發(fā)生率較高,在糖尿病人群中的發(fā)生率為17.5%～65.3%[3],然而,目前對(duì)于糖尿病患者眼表病變的研究相對(duì)較少[3]。糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)角膜神經(jīng)纖維進(jìn)行性丟失和角膜敏感度下降等情況[4]。這可能導(dǎo)致神經(jīng)再生延遲、傷口愈合延遲、干眼癥、持續(xù)上皮缺損和營(yíng)養(yǎng)不良性潰瘍[5],嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而活體角膜共聚焦顯微鏡是一種研究角膜神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的重要方法。本研究通過共聚焦纖維鏡觀察角膜神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)改變來為探究角膜神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)損害的發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料:本研究納入2020年6月至2023年1月于寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院眼科確診的2型糖尿病患者90例(90只眼)及正常人群30例(30只眼)。將2型糖尿病患者分為非增殖期DR(NPDR)組及增殖期DR(PDR)組,無DR的糖尿病患者則納入NDR組。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn):年齡≥18歲且無全身病,除輕度屈光不正外無眼部疾病;NDR組、對(duì)照組人群選右眼為納入眼。如果DR患者雙眼均可入組,則選擇右眼納入。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn):年齡<18歲;屈光不正等效球鏡度數(shù)絕對(duì)值>3[D],無法配合角膜共聚焦顯微鏡檢查的個(gè)體;角膜共聚焦顯微鏡所獲取的圖片質(zhì)量差者;患有特殊類型糖尿病或1型糖尿病者;合并嚴(yán)重糖尿病并發(fā)癥者,包括低血糖、酮癥酸中毒等;長(zhǎng)期佩戴美瞳或隱形眼鏡者;有眼部外傷史、手術(shù)史的患者;患有除糖尿病眼病外的其他眼部病變者,如維生素B12缺乏癥等;患有其他可引起周圍神經(jīng)病變者;嚴(yán)重干眼癥或瞼板腺功能障礙者;屈光介質(zhì)混濁且影響眼底情況評(píng)估的患者。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn):依據(jù)《中國(guó)2型糖尿病防治指南》(2020年版)[6]做出診斷,即糖尿病典型癥狀加上空腹血糖≥7.0 mmol/L或加上隨機(jī)血糖≥11.10 mmol/L或加上口服葡萄糖耐量試驗(yàn)2 h 血糖≥11.10 mmol/L或加上HbA1c≥6.5%。典型糖尿病癥狀有多飲、煩渴、多食、多尿、原因不明的體重下降,對(duì)于無典型糖尿病癥狀的患者則需進(jìn)行復(fù)查后再確認(rèn)[6]。

1.3 DR診斷:依據(jù)國(guó)際臨床糖尿病視網(wǎng)膜病變量表對(duì)NDR和DR患者進(jìn)行診斷和分期[7]。

1.4 方法:收集納入人群的基本信息,包括年齡、性別,有無眼部疾病、外傷史、手術(shù)史、佩戴美瞳、隱形眼鏡史或其他疾病史,對(duì)于糖尿病患者還須記錄其糖尿病病程。所有入組的患者均行基本眼科檢查,包括最佳矯正視力、眼壓、裂隙燈檢查、裂隙燈下眼前節(jié)及眼底檢查、眼底彩照等。

1.5 角膜共聚焦顯微鏡檢查及神經(jīng)纖維指標(biāo)的測(cè)量:角膜共聚焦顯微鏡檢查采用德國(guó)海德堡公司的HRT3激光角膜共聚焦顯微鏡。該顯微鏡使用了670 nm波長(zhǎng)的激光作為掃描光源,其具有800倍的高放大倍率和1pm的橫向分辨率,能夠覆蓋每幅圖像400 μm×400 μm大小的角膜面積并可采集大小為384像素×384像素的圖像。所有患者的共聚焦顯微鏡檢查都由同一位技師完成。在進(jìn)行檢查時(shí),受檢者須預(yù)先進(jìn)行充分的眼球表面麻醉,隨后使用開瞼器撐開眼瞼,囑咐受檢者垂直坐立,使頭位和顯微鏡探頭保持垂直。使用手柄調(diào)節(jié)探頭與角膜的距離,使其接觸至中央角膜表面。選定瞳孔區(qū)的中央角膜上皮基底下神經(jīng)叢作為采集區(qū)域,掃描的深度為30～90 μm。調(diào)整焦平面調(diào)節(jié)旋鈕,使圖像清晰顯示,采集入組患眼角膜中央?yún)^(qū)域的正中、左、右、上、下處神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)圖像5張。使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)所采集的圖像進(jìn)行逐一分析計(jì)算并取其平均值。記錄入組個(gè)體角膜的角膜神經(jīng)纖維密度(NFD),即圖像中神經(jīng)纖維主干的數(shù)量除以圖像面積,單位為條/mm2;角膜神經(jīng)纖維長(zhǎng)度(NFL)即圖像中的神經(jīng)纖維主干的長(zhǎng)度加上所有神經(jīng)纖維分支的長(zhǎng)度再除以圖像面積,單位為mm/mm2; 角膜神經(jīng)纖維分支密度(NFB)即圖像中神經(jīng)纖維分支的數(shù)量除以圖像面積[8-9],單位為條/mm2;角膜神經(jīng)纖維彎曲度(NFT)依據(jù)Oliveira-Soto分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[10]。該標(biāo)準(zhǔn)使用角膜神經(jīng)的方向變化幅度和頻率進(jìn)行評(píng)分。0分表示神經(jīng)纖維的走形基本呈直線;1分表示神經(jīng)纖維走形略有彎曲;2分表示神經(jīng)纖維走形呈中度彎曲,出現(xiàn)方向變化頻繁的神經(jīng)纖維但其變化幅度小;3分表示神經(jīng)纖維走形呈明顯彎曲,方向變化的幅度較大;4分表示神經(jīng)纖維方向改變較為突然且頻繁,走形非常彎曲。

2 結(jié)果

2.1 基本資料:本研究共納入正常個(gè)體的30只眼及2型糖尿病患者的90只眼,90只眼包括NDR(30只眼)、NPDR(30只眼)及PDR(30只眼)。各組一般資料特征及比較見表1。正常對(duì)照組、NDR組、NPDR組及PDR組的年齡、性別之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 2組患者基本資料比較

2.2 正常對(duì)照組及糖尿病患者角膜神經(jīng)纖維基本特征:正常對(duì)照組、NDR組、NPDR組及PDR組神經(jīng)纖維比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。各組神經(jīng)纖維共聚焦結(jié)果見圖1(目次后)。

表2 正常對(duì)照組及糖尿病患者角膜神經(jīng)纖維基本特征

2.3 糖尿病患者角膜神經(jīng)纖維參數(shù)與年齡、糖尿病病程的相關(guān)性分析:將所有糖尿病患者的角膜神經(jīng)纖維參數(shù)與年齡、糖尿病病程進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析,見表3。糖尿病患者NFL與糖尿病病程相關(guān)(P<0.05),而與年齡不相關(guān)(P>0.05)。將Pearson相關(guān)系數(shù)分析中與角膜神經(jīng)纖維顯著相關(guān)的參數(shù)輸入多元線性逐步回歸模型中,以最終檢驗(yàn)每個(gè)參數(shù)與角膜神經(jīng)纖維指標(biāo)的獨(dú)立關(guān)聯(lián)。NFL與糖尿病病程呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);NFD與年齡糖尿病病程呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);NFT與年齡、糖尿病病程呈正相關(guān)(P<0.05),見表4至表6。

表3 糖尿病患者角膜神經(jīng)纖維參數(shù)與年齡、糖尿病病程的相關(guān)分析(r值)

表4 糖尿病患者NFL的多元線性逐步回歸分析

表5 糖尿病患者NFD的多元線性逐步回歸分析

表6 糖尿病患者NFT的多元線性逐步回歸分析

3 討論

本研究利用活體角膜共聚焦顯微鏡探究糖尿病患者角膜神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDR組、NPDR組及PDR組NFL、NFD、NFB均顯著降低,而NFT顯著升高,提示糖尿病患者在出現(xiàn)明確的眼底病變前,其角膜神經(jīng)纖維就已出現(xiàn)隱匿性的神經(jīng)纖維損害。進(jìn)一步的多元線性回歸分析結(jié)果顯示,NFL與糖尿病病程呈顯著負(fù)相關(guān);NFD與年齡、糖尿病病程呈顯著負(fù)相關(guān);NFT與年齡、糖尿病病程顯著呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示角膜神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)參數(shù)可能受多種因素影響,包括年齡、糖尿病病程。

角膜是人身體中神經(jīng)分布最密集的組織,1 mm2約有7 000個(gè)游離神經(jīng)末梢[11]。其神經(jīng)纖維來源于三叉神經(jīng)的眼支,在進(jìn)入角鞏膜韌帶后約1 mm處失去神經(jīng)鞘和髓鞘。神經(jīng)纖維在角膜層間穿行,于角膜Bowman層和基底上皮層之間形成支配角膜上皮的基底神經(jīng)叢[12]。既往對(duì)角膜神經(jīng)纖維的研究往往利用光學(xué)和電子顯微鏡對(duì)離體角膜組織進(jìn)行觀察[13]。然而,由于離體的角膜神經(jīng)在人死亡后的14 h內(nèi)就已經(jīng)出現(xiàn)進(jìn)行性退化,故利用上述技術(shù)進(jìn)行的研究可能會(huì)產(chǎn)生不可靠的結(jié)果[14]。隨著光學(xué)設(shè)備的進(jìn)步,活體共聚焦顯微鏡可對(duì)活體角膜組織提供800倍的放大倍率,能精確地對(duì)角膜細(xì)胞和神經(jīng)特性進(jìn)行定量評(píng)估[13]。

大量的研究表明,活體角膜共聚焦顯微鏡是一種可靠的觀測(cè)手段,可對(duì)神經(jīng)纖維進(jìn)行觀測(cè)和量化[15]。利用該技術(shù),本研究發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)DR改變前,角膜神經(jīng)纖維就已出現(xiàn)NFL、NFD、NFB的下降及NFT的增高,提示長(zhǎng)期慢性高血糖可導(dǎo)致神經(jīng)的隱匿性損害。這一發(fā)現(xiàn)與既往研究一致,Messmer等發(fā)現(xiàn)角膜感覺正常及震動(dòng)感正常的糖尿病患者已出現(xiàn)顯著的NFL、NFD及NFB損害[16]。糖尿病患者角膜神經(jīng)支配損害可獨(dú)立存在于未出現(xiàn)神經(jīng)病變的患者中,即未出現(xiàn)明確神經(jīng)病變的患者的角膜也可能出現(xiàn)隱匿的角膜神經(jīng)損害[17]。此外,研究表明角膜神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)指標(biāo)與DR的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Nitoda等發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,角膜NFL、NFD、NFB在NDR、NPDR及PDR患者中顯著降低,而PDR患者NFT則顯著升高[18]。此外,與正常對(duì)照組相比,NDR患者已出現(xiàn)NFL的顯著下降,且NPDR和PDR患者NFD、NFL和NFB差異更大,說明角膜神經(jīng)纖維損害隨著DR的進(jìn)展而加深[19]。另有研究表明,PDR患者角膜神經(jīng)損害程度比未患DR者更為明顯[20]。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果類似。因此,長(zhǎng)期高血糖會(huì)導(dǎo)致角膜神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的隱匿性損害,角膜共聚焦顯微鏡可在出現(xiàn)明顯DR改變前甚至在糖尿病前期檢測(cè)出該結(jié)構(gòu)是否損害。

本研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病患者角膜神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)受多種因素影響,可能的因素包括年齡、糖尿病病程。有研究表明,正常人角膜神經(jīng)纖維密度隨著年齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì),平均每年下降0.25%～0.30%[21],其他針對(duì)正常人的研究亦得出類似結(jié)果[22]。在糖尿病患者中,有研究表明1型糖尿病患兒角膜NFL、NFD、NFB與年齡顯著正相關(guān)[23]。本研究顯示糖尿病病程對(duì)NFL、NFD、NFB、NFT的影響大于年齡對(duì)其影響。