黃 浩

(遼寧鐵研種業(yè)科技有限公司,遼寧 鐵嶺 112616)

藍(lán)莓 (VacciniumSpp.),為杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠灌木植物.我國(guó)于2000年開始了藍(lán)莓的商業(yè)化種植推廣,藍(lán)莓種植主要分布于貴州、遼寧、山東、吉林、四川等省.2023年我國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)量達(dá)34.72萬噸,其中,鮮果上市量達(dá)25.00萬噸.藍(lán)莓中除含有大量多糖、蛋白質(zhì)、維生素、食用纖維等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)素以外,還富含酚酸、花青素、熊果苷、紫檀芪等特殊性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1].藍(lán)莓是一種氧化性強(qiáng)的水果,對(duì)衰老、癌癥和心臟疾病能發(fā)揮抗氧化作用,除此之外,還具有延緩腦神經(jīng)衰老、增強(qiáng)人體記憶力的功效.藍(lán)莓多糖是藍(lán)莓的一種重要活性成分,具有降壓、抗癌、緩解疲勞、清除自由基以及抑制腸道有害菌等功能[2-6].藍(lán)莓鮮果的貨架期不超過半個(gè)月,不利于運(yùn)輸和貯存,由此限制了藍(lán)莓的推廣和食用.因此,將藍(lán)莓用于食品、保健品的加工,不僅利于解決產(chǎn)銷不平衡問題,還可提高藍(lán)莓附加值,促進(jìn)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展.

多糖的提取、分離純化是活性研究的基礎(chǔ),目前,提取藍(lán)莓多糖的方法有熱水浸提法、堿提取法、酶提取法、超聲波輔助法、微波輔助提取法等.國(guó)內(nèi)外研究藍(lán)莓多糖提取的相對(duì)較少.熱水浸提法是提取多糖最傳統(tǒng)的方法,該法簡(jiǎn)單、容易操作且成本低,但存在耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、提取率不高的缺點(diǎn).李穎暢等[7]采用熱水浸提法提取藍(lán)莓葉多糖,提取率為29.2 mg/g.堿提取法適宜于提取酸性多糖,時(shí)間會(huì)縮短但容易含雜質(zhì),使多糖降解.DENG等[8]采用堿法提取貓眼藍(lán)莓多糖,提取率為36.02%;王鵬等[9]采用堿浸提法提取藍(lán)莓多糖,提取率為2.181%.酶法、超聲波法、微波提取法相較其他方法更為高效,酶法對(duì)溫度和pH 要求嚴(yán)格,且酶的價(jià)格高.孫璐等[10]、孫麗娜等[11]分別采用果膠酶和纖維素酶提取藍(lán)莓多糖,提取率分別為2.721%、2.91%.超聲提取高效但有噪聲,超聲強(qiáng)度過高和時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致多糖降解.崔笑傲等[12]采用超聲輔助纖維素酶提取藍(lán)莓多糖,提取率為8.13%;李敬等[13]、郭麗等[14]利用超聲輔助提取藍(lán)莓多糖,提取率達(dá)4.93%、5.83 mg/g;孟憲軍等[15]以響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)微波輔助提取法提取藍(lán)莓多糖,提取率為3.32%.

本文前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究了超聲輔助熱水浸提法、堿法、酶法提取藍(lán)莓多糖,發(fā)現(xiàn)超聲輔助熱水提取效果要優(yōu)于其他方法.而且已報(bào)道的響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取藍(lán)莓多糖大多優(yōu)化的工藝參數(shù)是酶解條件,對(duì)超聲條件的優(yōu)化相對(duì)較少.因此,本文選擇市售藍(lán)莓為原材料,經(jīng)速凍解凍后超聲輔助熱水提取藍(lán)莓多糖,用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量,通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲工藝參數(shù),在保障提取完全的同時(shí),有效節(jié)約資源與成本,以期為藍(lán)莓多糖的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓(市售);無水葡萄糖(分析純,沈陽市試劑三廠);苯酚(分析純,天津化學(xué)試劑有限公司);濃硫酸(優(yōu)級(jí)純,沈陽化學(xué)試劑廠).

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-190TMPK 冰箱(海爾智家股份有限公司),T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),2200TH 數(shù)控超聲清洗器(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司),SHZ-DⅢ 循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司),DZKW-12-2 電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司),FA1104 型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司),80-2 電動(dòng)離心機(jī)(常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠).

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓多糖的提取 稱取一定量速凍后的藍(lán)莓鮮果,于燒杯中以40 kHz、20 ℃、10 min進(jìn)行超聲波解凍[16],解凍后放于干凈的研缽中,研磨成漿后準(zhǔn)確稱取藍(lán)莓漿3.000 g于250.0 mL燒杯中,按1∶10料液比[9-10]加入30.0 mL蒸餾水,攪拌,在80 kHz、50 ℃、40 min進(jìn)行超聲波提取[17],將藍(lán)莓多糖提取液倒入離心管內(nèi),以3 000 r/min離心15 min得藍(lán)莓多糖提取液.

1.3.2 藍(lán)莓多糖的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[18]測(cè)定藍(lán)莓多糖.精確稱取無水葡萄糖100.000 mg于燒杯中加蒸餾水溶解,定容至100.0 mL容量瓶,用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的葡萄糖溶液.取上述溶液10.0 mL配制成0.1 mg/mL的葡萄糖儲(chǔ)備液,分別量取0.1 mg/mL葡萄糖儲(chǔ)備液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,加蒸餾水至2.0 mL,然后分別加入1.0 mL蒸餾水、1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸,搖勻,放入沸水中加熱20 min,拿出靜置冷卻至室溫,參考文獻(xiàn)[17]中藍(lán)莓多糖最大吸收波長(zhǎng)490 nm,并在該波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值.以葡萄糖含量(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度值(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程為

y=0.013 2x+0.011 9,R2=0.995 7

將測(cè)定樣液的吸光度值代入回歸方程,計(jì)算藍(lán)莓多糖的含量.

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn) 分別設(shè)置超聲溫度30、40、50、60、70 ℃,超聲頻率50、60、70、80、90 kHz,超聲時(shí)間30、40、50、60、70 min,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn);取1.0 mL藍(lán)莓多糖提取液于20.0 mL比色管中,加入1.0 mL蒸餾水、1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸,搖勻,放入沸水浴中加熱20 min,拿出靜置冷卻至室溫,稀釋一定倍數(shù),同時(shí)做空白對(duì)照,在490 nm吸收波長(zhǎng)處測(cè)定藍(lán)莓多糖提取液吸光度值,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計(jì)算樣品中多糖含量.

1.3.4 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用Design-Expert軟件進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì),確定超聲溫度、超聲頻率、超聲時(shí)間3個(gè)因素與多糖含量的回歸關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度的確定 藍(lán)莓多糖經(jīng)超聲溫度30、40、50、60、70 ℃,固定超聲頻率70 kHz和超聲時(shí)間50 min提取離心后得到樣液體積為29.5、29.5、27.0、26.5、19.5 mL.由表1可得,隨著超聲溫度增加,藍(lán)莓多糖含量逐漸增加,當(dāng)超聲溫度為60 ℃時(shí),提取的藍(lán)莓多糖含量出現(xiàn)峰值,為984.957 mg/100 g,即9.850 mg/g.繼續(xù)升高溫度,藍(lán)莓多糖含量呈下降趨勢(shì),溫度過高,氧化劇烈,導(dǎo)致其含量降低,這與徐麗萍等[19]的研究一致.超聲溫度70 ℃所測(cè)定多糖含量低,可能由于溫度高導(dǎo)致離心后樣液體積減小.因此,選擇60 ℃為最佳超聲溫度.

表1 超聲溫度確定

2.1.2 超聲頻率的確定 以 2.1.1得到的最佳超聲溫度進(jìn)行提取,固定超聲時(shí)間50 min,分別以超聲頻率50、60、70、80、90 kHz提取藍(lán)莓多糖,離心后得樣液體積均為24.0 mL.由表2可得,隨著超聲頻率增加,藍(lán)莓多糖的含量先增加后減少,當(dāng)超聲頻率70 kHz時(shí),藍(lán)莓多糖含量出現(xiàn)峰值,為1 066.946 mg/100g,即10.669 mg/g.超聲頻率超過70 kHz時(shí),由于超聲頻率過高引起多糖糖苷鍵斷裂,這與李敬等[13]和孫希云等[17]的研究一致.實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)單因素多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),以頻率60、70 kHz測(cè)定吸光度值、多糖含量均無明顯差異,因此,選擇60 kHz為最佳超聲頻率.

表2 超聲頻率確定

2.1.3 超聲時(shí)間的確定 以2.1.1和2.1.2確定的最佳超聲溫度和超聲頻率,超聲時(shí)間30、40、50、60、70 min后提取藍(lán)莓多糖,離心后得樣液體積為27.0、25.0、24.5、23.0、19.5 mL.由表3可得,隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng),藍(lán)莓多糖含量先升后降,當(dāng)超聲時(shí)間為 50 min時(shí),提取藍(lán)莓多糖含量出現(xiàn)峰值,為1 058.610 mg/100 g,即10.586 mg/g.繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間,藍(lán)莓多糖在超聲作用下發(fā)生降解,藍(lán)莓多糖含量逐漸減少,這與李敬等[13]和孫希云等[17]研究一致.根據(jù)單因素多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,測(cè)定吸光度值在50、60 min時(shí)有差異,吸光度值高可能由于時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致提取樣液體積變小,但多糖含量在50、60 min時(shí)無明顯差異,因此,綜合考慮選擇50 min為最佳超聲時(shí)間.

表3 超聲時(shí)間確定

2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果

為了優(yōu)化提取結(jié)果,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)方案見表4.

表4 三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素水平編碼

由表5可知,回歸系數(shù)為b0、bj、bij、bjj,得初步回歸方程

表5 三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

y=945.80+29.92x1-16.40x2+22.45x3-16.71x1x2+51.86x1x3+0.15x2x3+37.61(x12-

0.594)-21.68(x22-0.594)-22.42(x32-0.594)

當(dāng)x1=1,x2=-1,x3=1時(shí),即超聲溫度為60 ℃、超聲頻率為60 kHz、超聲時(shí)間為60 min時(shí),回歸方程算出的預(yù)測(cè)值為1 080.355 mg/100 g,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的值為1 036.080 mg/100 g,求得的變異系數(shù)為2.96%.

表6 方差分析

由表7可知,剔除不顯著因素后,回歸方程高度顯著,新的優(yōu)化回歸方程為

表7 簡(jiǎn)化后回歸方程的方差分析

y=975.72+51.86x1x3+37.61(x12-0.594)=953.38+51.86x1x3+37.61x12

該模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為超聲溫度70 ℃、超聲頻率50 kHz、超聲時(shí)間70 min.結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果,溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)造成多糖破壞.確定所對(duì)應(yīng)驗(yàn)證條件是超聲溫度60 ℃、超聲頻率50 kHz、超聲時(shí)間60 min.

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將回歸正交分析中接近于最大值的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組合、單因素最佳條件、三因素二次回歸正交分析結(jié)果中的最佳條件一起進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8.由表8可知,當(dāng)x1=1,x2=-1,x3=1時(shí),即超聲溫度60 ℃、超聲頻率60 kHz、超聲時(shí)間60 min,回歸方程算出的預(yù)測(cè)值為1 042.256 mg/100 g,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的值為1 036.080 mg/100 g,變異系數(shù)為0.42%,其他組合變異系數(shù)都大于該值.這5組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,只有第5組超聲頻率50 kHz變異系數(shù)大于5%,提取率偏低,影響顯著;第2、3、4組超聲頻率為70、80 kHz時(shí),雖變異系數(shù)較第1組大,但均不顯著,因此,綜合考慮選擇藍(lán)莓多糖提取的最佳超聲溫度為60 ℃、超聲頻率為60 kHz、超聲時(shí)間為60 min.

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

通過單因素及三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)最終確定藍(lán)莓多糖提取條件為超聲溫度60 ℃、超聲頻率60 kHz、超聲時(shí)間60 min,在此條件下,提取得多糖含量預(yù)測(cè)值為 1 042.256 mg/100 g,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值為1 036.080 mg/100 g.通過三因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得到結(jié)論,影響藍(lán)莓多糖提取條件因素的主次順序依次為超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲頻率.回歸方程y=953.38+51.86x1x3+37.61x12,具有可預(yù)測(cè)性,擬合性好.