肖燕然,周爽姿,李 爽,張思宇,李 雪,孟珈同,付永平,韓雪容,

(1. 長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130000;2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 食藥用菌教育部工程研究中心,吉林 長(zhǎng)春 130000)

生物表面活性劑是微生物在代謝過程中產(chǎn)生的,具有親水端和疏水端的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物。根據(jù)親水端的結(jié)構(gòu)不同,可分為糖脂類、氨基酸類和磷脂類生物表面活性劑等[1-3]。其中,糖脂類表面活性劑由糖(親水端)和脂肪酸(疏水端)構(gòu)成。按糖的結(jié)構(gòu)不同,又可分為4類:鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂和甘露糖赤蘚糖醇酯[4]。Pseudomonasaeruginosa、Bacillussubtilis、Aspergillussp.MSF1和BacillussubtilisTU2等不同菌屬的細(xì)菌都具有合成鼠李糖脂的能力[5-8]。其中,由Pseudomonasaeruginosa代謝產(chǎn)生的一種含有五碳糖基的鼠李糖脂可以作為化學(xué)合成表面活性劑的替代品,是近年來最有希望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化量產(chǎn)的生物表面活性劑[9-10]。

生物表面活性劑在石油開采、環(huán)境、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都發(fā)揮著重要作用[11]。鼠李糖脂不僅可作為助劑,提高石油的開采量;而且可以促進(jìn)甲烷水合物的形成,提高能源利用效率[12]。鼠李糖脂和槐糖脂都具有廣普的抗菌活性,可作為食品添加劑在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[13]。在醫(yī)療領(lǐng)域,雙鼠李糖脂具有殺死肌成纖維細(xì)胞的能力;槐糖脂能減弱乳腺癌細(xì)胞的遷移;海藻糖則具有調(diào)節(jié)免疫的作用,可用于瘢痕的治療、抗腫瘤藥物的開發(fā)和免疫保健品的研制[14]。甘露糖赤蘚糖醇酯可以促進(jìn)微生物細(xì)胞在葉片表面的分散和固定,因而可以被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[15]。

隨著生物表面活性劑在不同領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,其市場(chǎng)需求也在不斷增加。然而,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑面臨著生產(chǎn)菌株有限、菌株生產(chǎn)力低、合成成本高以及合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣等問題[16]。本研究以污水廠底泥為篩選源,使用含糖培養(yǎng)基,篩選出一株具有生產(chǎn)生物表面活性劑的純菌株。利用鏡檢、革蘭氏染色,以確定菌株形態(tài)及陰陽(yáng)性,并根據(jù)16S rDNA序列分析鑒定菌株的種屬分類,進(jìn)一步對(duì)菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。然后利用薄層層析(TLC)和含糖量測(cè)定,初步對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。最后對(duì)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物的乳化性能及表面張力等性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為豐富生物表面活性劑生產(chǎn)菌,開發(fā)發(fā)酵生產(chǎn)流程及表面活性劑的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L,純水1 000 mL,pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基:每100 mL LB培養(yǎng)基中加入瓊脂粉1.5 g。

1.1.1.1 無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基

母液(g/L):Na2HPO4·12H2O 9.0、KH2PO41.5、NH4Cl 0.5、MgSO4·7H2O 0.2。

1.1.1.2 微量元素(g/L)

FeCl39.7×10-3、CaCl27.8×10-3、CoCl2·6H2O 0.13×10-3、CuSO4·5H2O 0.16×10-3、NiCl3·6H2O 0.12×10-3、CrCl3·6H2O 0.11×10-3。

1.1.1.3 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)固體平板

基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基100 mL中加入瓊脂粉1.5 g、亞甲基藍(lán)0.005 g和CTAB 0.02 g。

1.1.2 儀器和試劑

1.1.2.1 主要儀器

SPX-250型搖床培養(yǎng)箱,上海市博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;5424R型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)eppendorf公司;P-1型層析缸,廣州市三合化玻儀器部;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海市亞榮生化儀器廠;FD-1D-80型凍干機(jī),北京市博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;JYW-200A型自動(dòng)界面張力儀,承德市精密試驗(yàn)機(jī)有限公司。

1.1.2.2 主要試劑

葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、辛酸鈉、月桂酸鈉、淀粉、石蠟和CTAB,上海市源葉生物科技有限公司;辛酸乙酯、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、苯酚、HCl、H2SO4、NH4Cl、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4和CH3COONH4,天津市光復(fù)精細(xì)化工;鼠李糖脂標(biāo)品,西安市瑞捷生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選

1.2.1.1 樣品的采集

用50 mL滅菌管,取長(zhǎng)春市西郊污水廠底泥6份,分別編號(hào)后保存于4 ℃冰箱。

1.2.1.2 富集培養(yǎng)

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法,在無菌條件下,將采集到的樣品分別加入30 mL無菌水,180 r/min搖床振蕩混合12 h,于30 ℃靜置30 min后,取上清液5 mL接種到裝有100 mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中,放在搖床中以180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)14 h,即得富集液。

1.2.1.3 菌株的初篩

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法,取富集液,用無菌水進(jìn)行10-4、10-6和10-8倍的梯度稀釋后,涂布于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%植物油的LB平板培養(yǎng)基上,于30 ℃培養(yǎng)36 h。挑取有較大排油圈的單菌落,在LB固體平板上得到初篩菌株。

1.2.1.4 菌株的復(fù)篩

根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法,挑取經(jīng)初篩純化后的單菌落,以180 r/min、30 ℃,于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d,在5 000 r/min、以4 ℃離心10 min,除去菌體,保留上清液。將上清液滴入裝有液體石蠟?zāi)ず驼麴s水的平皿中,形成排油圈,選取排油圈直徑最大的菌株,保存于-80℃冰箱。

1.2.1.5 菌株的種屬鑒定

以篩選菌株基因組DNA為模版,利用通用引物27F/1492R,進(jìn)行菌株的16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增,將提純的DNA片段插入pQE-80L質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)染E.coliJM109,以獲得菌落。挑取單菌落培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒,進(jìn)行測(cè)序,以獲得分離菌株的16S rRNA基因的堿基序列。獲得的基因堿基序列與NCBI中基因庫(kù)的細(xì)菌進(jìn)行同源性比對(duì),利用MEGA (7.0.26)制作系統(tǒng)樹,以確定種屬并命名。

1.2.2 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.2.1 溫度與pH的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[20-21]的方法,取保存菌種50 μL,加入 5 mL LB液體培養(yǎng)基中,以27 ℃、180 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)14 h。以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量,接種5 mL于裝有100 mL LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中,于16、27、37和42 ℃搖床中培養(yǎng),每隔1 h取1 mL菌液置于石英比色皿中,于595 nm測(cè)定吸光度,通過測(cè)定的數(shù)據(jù)繪制該菌的溫度生長(zhǎng)曲線。

每個(gè)溫度分別進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),取平均值。用同樣方法優(yōu)化菌株的pH (6、7、8和9)。每個(gè)pH分別進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),取平均值。

1.2.2.2 碳源與氮源的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[22]的方法,將5 mL活化后的菌株發(fā)酵液以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量,分別加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%碳源的100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(含葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、辛酸鈉、月桂酸鈉、淀粉和食用油),在27 ℃、pH 7.0下培養(yǎng)3 d后,于5 000 r/min條件下離心10 min后,棄去上清,收集菌體后凍干至恒質(zhì)量。

每組碳源優(yōu)化分別進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),取平均值。同樣方法將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氮源(含NH4Cl、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4和乙酸銨)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%葡萄糖的100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基,優(yōu)化菌株的氮源。每組氮源優(yōu)化分別進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),取平均值。

根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法,利用酸沉淀-溶劑萃取法,分別提取發(fā)酵液中的表面活性劑,真空冷凍干燥至恒質(zhì)量,測(cè)定表面活性劑的產(chǎn)量。

1.2.3 菌株發(fā)酵液中產(chǎn)物的提取(酸沉淀-溶劑萃取法)

根據(jù)文獻(xiàn)[24]的方法,將20 mL活化菌株接種于以體積分?jǐn)?shù)1%葡萄糖為碳源的1 L無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在27 ℃、pH 7.0和180 r/min條件下培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液在5 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min,除去菌體,收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液調(diào)pH至2.0,于4 ℃靜置過夜。將過夜后的發(fā)酵液以10 000 r/min、4 ℃離心20 min后,收集絮狀物沉淀。將絮狀物沉淀的pH調(diào)至7.0,用乙酸乙酯萃取 3次,通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)溶劑后,得到黃色黏稠狀物質(zhì),真空冷凍干燥至恒質(zhì)量。

1.2.4 菌株發(fā)酵產(chǎn)物荷電性的檢測(cè) (CTAB培養(yǎng)法)

根據(jù)文獻(xiàn)[25]的方法,將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液稀釋10-2、10-4和10-6倍后,涂布于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%葡萄糖的CTAB固體平板上,于27 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2 d,通過觀察單菌落顏色來判斷菌株發(fā)酵產(chǎn)物的電荷性(若產(chǎn)生藍(lán)色的單菌落,則為陰離子表面活性劑)。

1.2.5 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的薄層層析(TLC)檢測(cè)

將提取的0.1mg發(fā)酵產(chǎn)物和0.1 mg鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于5 mL氯仿中,展開劑為氯仿與甲醇的混合溶液,體積比為1∶1,顯色劑為苯酚-H2SO4溶液。將展開劑倒入層析缸,靜置20 min,將樣品與鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣于硅膠板上,待完全干燥后,放入含有展開劑的層析缸中,至距離硅膠板上方1 cm處時(shí)停止。待硅膠板上展開劑揮發(fā)干凈后,均勻噴灑顯色劑,并于70 ℃烘箱中加熱20 min,觀察其顏色的變化。

1.2.6 菌株發(fā)酵產(chǎn)物糖含量的檢測(cè)

分別取鼠李糖脂0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g/L各0.5 mL,加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為 6%的苯酚溶液,加2.5 mL濃H2SO4后,置于冰水浴中輕微振蕩并混勻,室溫靜置20 min,于490 nm處測(cè)定不同質(zhì)量濃度鼠李糖的吸光度。根據(jù)文獻(xiàn)[26]的方法,以鼠李糖脂質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用和鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品相同的調(diào)制方法,制備待測(cè)樣品并測(cè)定其吸光度,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取物中的鼠李糖脂質(zhì)量濃度。

1.2.7 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分散作用(排油圈法)

根據(jù)文獻(xiàn)[27]的方法,在培養(yǎng)皿中加入20 mL蒸餾水和3 mL液體石蠟,待液體石蠟覆蓋蒸餾水表面后,加入質(zhì)量濃度為0.04 g/mL菌株發(fā)酵產(chǎn)物水溶液100 μL與相同濃度、相同體積的鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品,于室溫下測(cè)量排油圈的直徑。

1.2.8 菌株發(fā)酵產(chǎn)物乳化性質(zhì)的測(cè)定

室溫下取2支試管,分別加入3 mL液體石蠟,再分別在2個(gè)試管中各加入3 mL質(zhì)量濃度均為0.04 g/mL的菌株發(fā)酵產(chǎn)物水溶液與鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品水溶液,振蕩2 min,靜置24 h后,測(cè)量試管中乳化層高度 (h1)和液體總高度(h),計(jì)算乳化指數(shù)E,E=h1/h×100%。

1.2.9 菌株發(fā)酵產(chǎn)物表面張力的測(cè)定

用去離子水,將菌株發(fā)酵產(chǎn)物稀釋成質(zhì)量濃度為40、50、60、70、80、90、100和110 mg/L的水溶液,作為檢測(cè)樣品,進(jìn)行表面張力的測(cè)定(表面張力發(fā)生明顯轉(zhuǎn)折點(diǎn)的濃度即為臨界膠束濃度(CMC)),測(cè)試方法為吊環(huán)法,于25 ℃測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選菌株的鑒定與培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 篩選菌株的形態(tài)特征結(jié)果

通過初篩與復(fù)篩,得到一株排液狀石蠟直徑較大的菌株,結(jié)果見圖1。由圖1可知:該菌株在LB平板培養(yǎng)基上菌落較小,呈圓球狀,邊緣規(guī)則。該菌株的革蘭氏染色結(jié)果表明其為革蘭氏陰性菌(圖2)。

圖1 Pseudomonas libanensi PbA單菌落形態(tài)Fig.1 Single colony morphology of Pseudomonas libanensi PbA

圖2 Pseudomonas libanensis PbA革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram staining results of Pseudomonas libanensis PbA

2.1.2 篩選菌株的種屬鑒定結(jié)果

利用Genebank中BLAST對(duì)菌株的16S rRNA基因序列(1 397 bp,Genebank ID:MH930445)進(jìn)行同源性比對(duì),選擇與該菌株相似性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)該菌株與Pseudomonaslibanensis(KT767978)的16S rRNA基因序列相似度達(dá)100%,因此,將其命名為PseudomonaslibanensisPbA (圖3)。

圖3 Pseudomonas libanensis PbA的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Pseudomonas libanensis PbA

2.1.3 菌株P(guān)seudomonaslibanensisPbA培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.3.1 菌株P(guān)seudomonaslibanensisPbA溫度和pH的優(yōu)化結(jié)果

PseudomonaslibanensisPbA培養(yǎng)溫度和pH生長(zhǎng)曲線見圖4和5。由圖4可知:該菌株可生長(zhǎng)的溫度為16 ～37 ℃,溫度升高至42 ℃后,菌株未見增殖。由圖5可知:該菌株可生長(zhǎng)的pH為6～9。因此,菌株的最適培養(yǎng)條件為溫度27 ℃、pH 7。

圖4 Pseudomonas libanensis PbA的溫度生長(zhǎng)曲線Fig.4 Temperature growth curve of Pseudomonas libanensis PbA

圖5 菌株P(guān)seudomonas libanensis PbA的pH生長(zhǎng)曲線Fig.5 pH growth curve of strain Pseudomonas libanensis PbA

2.1.3.2 菌株P(guān)seudomonaslibanensis PbA碳源和氮源的優(yōu)化結(jié)果

菌株P(guān)seudomonaslibanensisPbA的碳源優(yōu)化結(jié)果見圖6。由圖6可知:菌株在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蔗糖、葡萄糖、辛酸、果糖、麥芽糖和食用油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng),其中葡萄糖為最佳碳源。此時(shí),菌體干質(zhì)量為0.74 g/L。Soberon-chavez等[28]的研究結(jié)果表明:在菌株的生長(zhǎng)過程中,不同氮源會(huì)影響菌株產(chǎn)表面活性劑的產(chǎn)量,因此,需優(yōu)化選擇該菌株的氮源。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在以葡萄糖為碳源時(shí),菌株P(guān)seudomonaslibanensisPbA使用NH4Cl和KNO3生產(chǎn)生物表面活性劑的產(chǎn)量要高于對(duì)照組,使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%KNO3為氮源,鼠李糖脂產(chǎn)量可提高14.5% (圖7)。

圖6 Pseudomonas libanensis PbA的碳源優(yōu)化Fig.6 Carbon source optimization of Pseudomonas libanensis PbA

圖7 Pseudomonas libanensis PbA的氮源優(yōu)化Fig.7 Nitrogen source optimization of Pseudomonas libanensis PbA

總結(jié)以上結(jié)果,篩選到一株與Pseudomonaslibanensis16S rRNA基因序列相似度達(dá)100%的菌株,將其命名為PseudomonaslibanensisPbA,在27 ℃、 pH 7且含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%葡萄糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% KNO3的優(yōu)化培養(yǎng)條件下,表面活性劑產(chǎn)量可達(dá)0.54 g/L,比未優(yōu)化前提高了17%。筆者得到的菌株盡管屬于Pseudomonassp.,但還沒有生產(chǎn)生物表面活性劑的報(bào)道,因此對(duì)其提取物進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。

2.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的初步鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株發(fā)酵產(chǎn)物荷電性能的檢測(cè)結(jié)果

表面活性劑根據(jù)其解離能力的不同,可分為陰離子型、陽(yáng)離子型和非離子型表面活性劑。表面活性劑的荷電性能直接影響其性質(zhì)及應(yīng)用領(lǐng)域,使用CTAB培養(yǎng)法鑒定該菌株發(fā)酵產(chǎn)物的荷電性能,結(jié)果見圖8。由圖8可知:在CTAB固體平板培養(yǎng)基上,菌落周圍形成了深藍(lán)色圈,證明該菌株發(fā)酵產(chǎn)物為陰離子型,可用于吸附或沉淀帶正電的水污染溶液。

圖8 Pseudomonas libanensis PbA的荷電結(jié)果Fig.8 Charging results of Pseudomonas libanensis PbA

2.2.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的TLC結(jié)果

為了鑒定該菌株產(chǎn)物的分類,利用TLC初步檢測(cè)了其與鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品的相似度,結(jié)果見圖9。由圖9可知:1為菌株發(fā)酵產(chǎn)物樣品;2為鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品,二者均出現(xiàn)了一個(gè)明顯的棕色斑點(diǎn),且出現(xiàn)位置相同,證明該菌株發(fā)酵產(chǎn)物組分單一,因此,初步判定其為糖脂類物質(zhì)。

圖9 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的TLC結(jié)果 Fig.9 TLC results of product

2.2.3 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的糖含量測(cè)定結(jié)果

將菌株的發(fā)酵產(chǎn)物稀釋50倍,鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍后,分別測(cè)得490 nm的吸光度為0.14、 0.101。根據(jù)鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程Y=2.942 6X+0.000 3,計(jì)算得發(fā)酵產(chǎn)物及鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品中糖含量分別為2.34、3.37 g/L(圖10)。糖含量的測(cè)定結(jié)果不同,可能因?yàn)樵摦a(chǎn)物親水端含有不同于標(biāo)準(zhǔn)品的鼠李糖脂結(jié)構(gòu)。

圖10 鼠李糖脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 Standard curve of rhamnose

基于以上分析,初步鑒定該菌株產(chǎn)物為糖脂類表面活性劑。糖脂類表面活性劑的親水端和疏水端結(jié)構(gòu)復(fù)雜,親水端可能是單糖、雙糖或多糖的混合物;疏水端可能是飽和或不飽和脂肪酸以及帶羥基的脂肪酸等。因此,鑒定其親水端和疏水端的化學(xué)結(jié)構(gòu)需要借助進(jìn)一步的儀器分析。

2.3 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的性質(zhì)測(cè)試結(jié)果

2.3.1 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分散性能測(cè)試結(jié)果

分散與乳化性能是衡量表面活性劑的重要指標(biāo)。因此,利用排油圈法測(cè)定了菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分散性能。以沒有任何添加的水溶液作為陰性對(duì)照,結(jié)果見圖11。由圖11可知:菌株發(fā)酵產(chǎn)物和鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品的添加質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL時(shí),排油圈直徑分別為5.6和3.7 cm,表明提取物比鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品具有更好的分散性能。

圖11 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的排油圈結(jié)果Fig.11 Results of oil drain ring of extracting surfactant

2.3.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的乳化性能結(jié)果

利用液體石蠟對(duì)表面活性劑的乳化性能結(jié)果見圖12。由圖12可知:當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL時(shí),其乳化指數(shù)為60.3%,與同濃度鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品的乳化指數(shù)(62.1%)差別不大,該結(jié)果表明,篩選菌株提取的發(fā)酵產(chǎn)物的棕黃色膏狀物具有良好的乳化性質(zhì)。

注:a為鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品,b為菌株發(fā)酵產(chǎn)物圖12 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的乳化性質(zhì)Fig.12 Emulsion property of extracting surfactant

2.3.3 菌株發(fā)酵產(chǎn)物表面張力和臨界膠束濃度的測(cè)定結(jié)果

為了進(jìn)一步分析菌株發(fā)酵產(chǎn)物作為表面活性劑的特性,測(cè)定了其表面張力,并計(jì)算了其臨界膠束濃度(圖13)。由圖13可知:隨著菌株發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度從0.4 g/L增加至大于1.1 g/L,溶液的表面張力從65.3 mN/m降低到54.1 mN/m,之后逐漸變得平穩(wěn)。曲線變化趨勢(shì)的拐點(diǎn)代表表面活性劑的CMC,為106 mg/L。其臨界膠束濃度遠(yuǎn)小于化學(xué)表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS),而與非離子表面活性劑吐溫相差不大。

圖13 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的表面張力Fig.13 Surface tension of extracted surfactant

基于以上分析,菌株發(fā)酵產(chǎn)物的分散性能優(yōu)于鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品,乳化活性與鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng),其表面張力可降低至54.1 mN/m。朱湧[29]的研究結(jié)果表明:鼠李糖脂的表面張力通常為30 mN/m左右。兩者間的顯著差異說明該菌株發(fā)酵產(chǎn)物可能是一種具有新型結(jié)構(gòu)的生物表面活性劑,將在以后的研究中進(jìn)一步分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

通過富集、分離篩選,從污水廠底泥中篩選到一株能夠產(chǎn)表面活性劑的菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測(cè),鑒定為假單胞菌屬,命名為PseudomonaslibanensisPbA。在27 ℃、 pH 7和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%葡萄糖作為碳源的條件下,添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% KNO3,獲得發(fā)酵產(chǎn)物為0.54 g/L。該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物可能為糖脂類陰離子表面活性劑,在質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL時(shí),排油圈直徑為5.6 cm,優(yōu)于鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品,乳化指數(shù)為60.3%,與標(biāo)準(zhǔn)品類似。隨著質(zhì)量濃度的增加,產(chǎn)物的表面張力從65.3 mN/m (質(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)) 減小至54.1 mN/m(大于質(zhì)量濃度106 mg/L時(shí));其臨界膠束濃度為106 mg/L,與通常鼠李糖脂的表面張力降低至30 mN/m左右相比,差別較大,后續(xù)將對(duì)產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行深入研究,包括成分的鑒定和化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析,并探尋此差別的原因。本研究為豐富生物表面活性劑生產(chǎn)菌,開發(fā)發(fā)酵生產(chǎn)流程及表面活性劑的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。