關(guān)鍵詞： 天麻；有效成分；產(chǎn)地加工；亞硫酸鹽添加劑

中圖分類號： S567.239.092 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0113?08

中藥材天麻是蘭科（Orchidaceae） 植物天麻（Gastrodia elata Bl.） 的干燥塊莖?，F(xiàn)代研究認為：天麻具有增強記憶、改善睡眠質(zhì)量、防治糖尿病等藥理作用[14-19]。隨著栽培技術(shù)的成熟，天麻已廣泛種植于中國湖北、云南、陜西等地[20]，目前市場中的商品天麻流通幾乎全部依靠人工栽培供應(yīng)。已有研究主要探討了天麻加工過程中干燥、斷生、硫熏等工藝對天麻有效藥用成分的影響。劉彥鐸等[21]以天麻素為質(zhì)量評價指標，對不同的干燥方法進行了比較。MA 等[22]利用電離質(zhì)譜成像技術(shù)，跟蹤調(diào)查蒸制過程中天麻酚類成分的空間分布變化，并認為水解酶的及時滅活是保證巴利森苷類化合物含量的關(guān)鍵。對天麻硫黃熏蒸的研究發(fā)現(xiàn)：二氧化硫在1～2 h 內(nèi)即與天麻中的酚酸類化合物發(fā)生反應(yīng)，導致天麻素含量降低30.94%，對羥基苯甲醛含量降低50.00%[23]；此外，硫熏過程中，苯酚類成分易發(fā)生酯化反應(yīng)，而較高的含水量也為天麻有效成分的轉(zhuǎn)化提供了適宜的反應(yīng)環(huán)境[24]。以上研究結(jié)果表明：不同的加工方式可對天麻的品質(zhì)產(chǎn)生巨大影響。但關(guān)于天麻的加工研究通常聚焦于部分加工環(huán)節(jié)或單一有效成分，試驗設(shè)計與實際產(chǎn)地加工情況較為脫節(jié)，不利于直接指導生產(chǎn)。

由于天麻塊莖中含有大量多糖類成分而不易干燥，因此，在目前的產(chǎn)地加工過程中，經(jīng)常使用含硫添加劑[ 焦亞硫酸鈉溶液（sodium metabisulfitesolution，SMS）] 浸泡的方法處理天麻。通過近年來在天麻主產(chǎn)區(qū)的調(diào)研發(fā)現(xiàn)：使用SMS浸泡新鮮天麻基本完全替代了傳統(tǒng)硫熏的加工方式，但目前關(guān)于其對天麻質(zhì)量的影響還知之甚少。為了明確不同產(chǎn)地加工方式和含硫添加劑對天麻藥材質(zhì)量的影響，本研究結(jié)合實際生產(chǎn)，采用超高效液相色譜—飛行時間質(zhì)譜（ultra high performanceliquid chromatography time-of-flight massspectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS） 解析不同處理方式對天麻化學成分的影響，并在此基礎(chǔ)上對天麻主要差異成分進行定量分析，旨在為不同產(chǎn)地加工方式的天麻質(zhì)量評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

色譜級甲醇和乙腈，德國默克公司；天麻素（gastrodin，GA，批號：62499-27-8）、對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HA，批號：623-05-2）、巴利森苷E （parishin E，PE，批號：952068-57-4）、巴利森苷B （parishin B，PB，批號：174972-79-3）和巴利森苷C （parishin C，PC，批號：174972-80-6），成都瑞芬思生物科技有限公司；巴利森苷A （parishin A，PA，批號：15082302），成都博普菲植物化學制品有限公司；亞硫酸鈉標準溶液，廣州檢測科技有限公司；焦亞硫酸鈉，上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；硫黃，洛陽天之道新材料科技有限公司。

新鮮天麻樣品為單個質(zhì)量約為150g 的紅天麻，購自湖北省羅田縣九資河鎮(zhèn)，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學劉大會教授鑒定為蘭科植物天麻，憑證標本存放于湖北中醫(yī)藥大學。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC I-Class 型超高效液相色譜系統(tǒng)和Xevo-G2-S Q-TOF-MS 質(zhì)譜系統(tǒng)（含Mass-Lynx 4.1 軟件），美國Waters 公司；LC-2030C 3D 型高效液相色譜儀，日本島津公司；ZORBAX EclipseXDB-C18 色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），安捷倫科技（中國） 有限公司；TRACE1300-ISQQD 型氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；KQ2200DB 型數(shù)控超聲波清洗器， 昆山市超聲儀器有限公司； 奧豪斯EX125DZH 天平，美國奧豪斯儀器（上海） 有限公司。

1.3 樣品制備

將采購的新鮮天麻樣品洗凈后晾干表面水分，每組挑選大小一致的天麻約600 g。按照產(chǎn)地加工方式，設(shè)置5 種天麻處理方式（表1）：J 組天麻樣品先在SMS 中浸泡2 h，后隔水蒸至斷面無白心；K 組天麻樣品先在SMS 中浸泡2 h，后水煮至斷面無白心；L 組天麻樣品先在水中浸泡2 h，后使用SMS 煮至斷面無白心；M 組天麻樣品先用水煮至斷面無白心，后置于SMS 中浸泡2 h；N 組天麻樣品先水煮至斷面無白心，后置于干燥器上層，下層點燃硫黃粉末（m_天麻∶m_硫黃=20∶1） 進行硫熏。

在J、K、L 和M 組中，根據(jù)實際生產(chǎn)使用情況，設(shè)置5 個SMS 梯度處理，分別為：0 （空白對照組）、3、6、9 和12g/L；在N 組中，設(shè)置3個硫熏時間，分別為：0 （空白對照組）、1 和2 h。為了分析不同加工方式對天麻有效成分和二氧化硫殘留量變化的影響，選取常用的煮制斷生（K、L 和M 組） 方式，并采用6g/L SMS 處理樣品，進一步分析其成分的變化規(guī)律。天麻處理后統(tǒng)一55 ℃ 烘干，打粉過60目篩備用。

1.4 標準品溶液制備

精密稱取適量GA、HA、PA、PB、PC 和PE對照品，于10 mL 容量瓶中加入50% 甲醇溶液定容，分別制成質(zhì)量濃度為0.416、0.306、0.602、0.318、0.808 和0.318 mg/mL 的標準品溶液。

1.5 供試品溶液制備

精密稱取天麻藥材粉末0.5 g，加入50% 甲醇溶液20 mL，室溫下超聲提?。üβ?20 W，頻率40 kHz） 30 min，補足失重，取上清液1 mL過0.22 μm 濾膜，供高效液相色譜與Q-TOF-MS質(zhì)譜分析。在供試樣品制備完成后，間隔挑選15 個樣品，各取100 μL 制成混合對照樣品。

1.6 高效液相色譜條件

流動相：A 相為色譜純乙腈，B 相為加入0.1% 磷酸的超純水溶液；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；流速0.8 mL/min；檢測波長220 nm；梯度洗脫程序為：0～10 min，3%～10% A；10～15 min，10%～12% A； 15～25 min， 12%～18% A； 25～40 min，18% A；40～42 min，18%～95% A。

1.7 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），離子化模式為負離子，離子源溫度100 ℃，氮氣流速900 L/h。毛細管電壓2 000 V，錐孔電壓40 V，掃描范圍m/z 50～1500。以Leucineenk Ephalin 為校正液。

1.8 二氧化硫殘留量檢測方法

天麻樣品的二氧化硫殘留量按照《中華人民共和國藥典》[25]中的氣相色譜法測定。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有試驗重復3 次，結(jié)果用“平均值±標準差”表示。采用SPSS 26 進行ANOVA 顯著性分析；采用GraphPad Prism 8.3.0 作圖；采用MassLynxTM4.1 （Waters，美國） 處理原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)，再采用Progenesis QI 和EZinfo 分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要差異化合物

經(jīng)與二級裂解碎片和標準品（圖1a） 對比后，確認天麻混合樣品（圖1b） 中的6 個主要有效成分離子峰為2種天麻素類與4 種巴利森苷類化合物。由樣品整體的主成分分析可知：混合對照樣品的化學成分數(shù)據(jù)分布穩(wěn)定；5 種不同處理的統(tǒng)計結(jié)果大致可分為2 大類，其中J、K 組樣品聚為一類，M、N 組樣品聚為另一類，而L 組由于組內(nèi)樣品有效成分含量差異較大導致離散程度較大（圖2a）。從不同處理組的組間數(shù)據(jù)離散程度來看，K 組和M 組的數(shù)據(jù)完全分離，表明經(jīng)過這2 種不同處理方式后，天麻成分變化差異明顯，由于煮制斷生法目前在產(chǎn)地加工中被廣泛使用，為了更好地代表不同加工方式對天麻品質(zhì)的影響差異，選取K 組和M 組樣品進行進一步的主要差異成分分析。

K 組和M 組間的正交偏最小二乘判別分析結(jié)果（圖2b） 顯示：2 種處理的樣品完全分離。在左側(cè)M 組樣品數(shù)據(jù)的區(qū)間內(nèi)，樣品按不同質(zhì)量濃度處理各自聚集，且組內(nèi)整體離散程度較大，其中，9 g/L 處理的化學成分含量與空白組相距最遠，表明該處理下的樣品化學成分含量變化較大。而在K 組樣品中，各質(zhì)量濃度處理的數(shù)據(jù)離散程度較小，即不同質(zhì)量濃度處理的天麻成分含量變化不明顯。根據(jù)S-plot 分析結(jié)果（圖2c），篩選得到了6 種具有明顯差異的成分，經(jīng)鑒定后確認其分別為PE （1，t_R 13.24，m/z 459.115 0）、PA（2，t_R 16.66，m/z 995.305 2）、HA （3，t_R 9.19，m/z124.137 0）、GA （4，t_R 6.06，m/z 285.096 5）、PB（5，t_R 14.14，m/z 727.211 1）、PC （6，t_R 15.63，m/z727.207 4）。根據(jù)其裂解碎片大小和裂解規(guī)律最終確定其化學結(jié)構(gòu)，分別為2種酚酸類成分（GA、HA） 和4 種糖苷類成分（PA、PB、PC、PE），這些糖苷類化合物在含硫的加工環(huán)境中可能發(fā)生磺化或亞磺化反應(yīng)，從而導致有效成分流失。

2.2 不同加工方式對天麻有效成分及二氧化硫殘留量的影響

由表2 可知：同一SMS 質(zhì)量濃度下，不同加工方式處理的天麻，其有效成分含量具有顯著差異（Plt;0.05）。L 組樣品的GA 和HA 含量顯著低于其他組，但其PA、PC 和PE 含量顯著高于其他組；從總含量來看，K 組的6 種有效成分總量最低，M 組的總含量最高。在所有樣品中，酚酸類與巴利森苷類成分總含量呈此消彼長的動態(tài)趨勢，即隨著天麻素類化合物含量的增加，巴利森苷類總含量逐漸下降，且在巴利森苷類含量最低的K 組樣品中，其二氧化硫殘留量最高。

2.3 不同加工方式對天麻有效成分總含量的影響

由圖3可知：在各組處理中，GA 與HA 含量之和的最小值為2.88 mg/g，達到二者含量之和不小于2.5 mg/g 的標準[25]。從整體來看，各處理組中天麻有效成分總量的變化較大，說明添加劑的質(zhì)量濃度能顯著影響天麻的品質(zhì)，其中，J 組處理的SMS 質(zhì)量濃度達到16 g/L 時，天麻的有效成分總量最低。另外，樣品中各有效成分的占比較為穩(wěn)定，表明這些特征差異化合物在加工過程中都受到了影響，造成了有效成分的流失并最終影響天麻的品質(zhì)。從有效成分的變化趨勢來看，N 組硫熏天麻的有效成分隨著硫熏時長的增加而降低；其他使用添加劑溶液浸泡加工的天麻樣品，其有效成分含量均隨著SMS 質(zhì)量濃度的升高呈先升高后降低的趨勢。在J 組處理中，1 g/L SMS 浸泡處理的天麻總有效成分含量最高，為42.76 mg/g；而在產(chǎn)地加工中常用的煮制斷生（K、L、M 組） 處理下， 均以6 g/L SMS浸泡處理的總有效成分含量最高，分別為35.52、39.77 和39.84 mg/g。以上結(jié)果表明：斷生過程中，適當?shù)厥褂肧MS 可以提高其有效成分總含量，但煮制處理的添加劑溶液超過6 g/L 后，天麻的有效成分含量降低，過量使用添加劑會顯著破壞天麻的品質(zhì)；蒸制斷生的加工方式可以在低質(zhì)量濃度添加劑的條件下（1 g/L） 最大程度地減少有效成分流失。

3討論

中藥原材料的品質(zhì)直接影響著中藥的安全與療效，而藥材的產(chǎn)地加工則是直接影響中藥材的品質(zhì)、賦予其獨特藥性的過程，因此，科學規(guī)范的產(chǎn)地加工方式是中藥質(zhì)量和安全的關(guān)鍵。產(chǎn)地加工的作用包括在藥材收獲后篩分其藥用部位、延長保質(zhì)期限以利于儲存運輸、催生有效成分以提高藥材品質(zhì)、降低藥材毒性、改變藥性等[1， 26-27]。中藥材的鮮加工有效避免了其在自然緩慢干燥過程中活性成分的流失，在一定程度上保證了成品藥材的質(zhì)量[28]。張薇等[29]研究表明：微波干燥后，丹參表皮較傳統(tǒng)烘干更為鮮亮，其丹參酮類成分的含量也有所提升；而與黑豆共蒸加工后，何首烏中的二苯乙烯苷含量降低了約一半[30]。這說明中藥材加工具有減毒增效、提升藥材品質(zhì)的作用。

本研究采用實際生產(chǎn)的加工方式，通過比較不同加工方式后天麻的主要差異成分、不同組別天麻藥材有效成分含量以及二氧化硫殘留量的變化規(guī)律，探討5 種加工方式對天麻品質(zhì)的影響。通過差異性分析和S-plot 分析，確定了不同處理組間的6 種主要差異成分，并對其進行定量分析；在J、K、L、M 組的空白對照樣品中，M 組樣品的總有效成分含量最高，達到39.84 mg/g，該結(jié)果與前期研究結(jié)果[22]一致，即先進行斷生處理可以有效減少天麻藥用成分的流失。在所有樣品中，酚酸類與巴利森苷類成分總含量呈此消彼長的動態(tài)趨勢，這可能是由于巴利森苷類化合物由若干個天麻素分子與檸檬酸在不同位點結(jié)合而成，在含有二氧化硫的酸性環(huán)境下，巴利森苷類成分易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化，使得天麻素分子與檸檬酸的結(jié)合部位出現(xiàn)裂解與重構(gòu)現(xiàn)象，導致巴利森苷類化合物的相互轉(zhuǎn)化。此外，隨著SMS 質(zhì)量濃度的升高，J、K、L、M 組樣品的有效成分總含量均呈先升高后降低的趨勢，分析認為：在添加劑存在的情況下，外部溶液的滲透壓增高，在一定程度上抑制了天麻中化學成分向水中的溶解，但試驗測定的6 種有效成分均為水溶性，而這4 組在處理過程中均長時間浸泡于水溶液中，導致天麻的有效成分損失。這說明一定程度的產(chǎn)地加工預處理確實可以保證中藥材的品質(zhì)（如：經(jīng)九蒸九曬加工的何首烏樣品，其二苯乙烯苷含量呈梯度下降，而游離蒽醌類含量上升[31]），但需要適合的處理時間和添加劑濃度。

天麻中的有效成分多為水溶性，楊飛等[32]研究認為：蒸制處理方式不僅便于天麻的后續(xù)切片加工，而且在斷生過程中破壞了β-糖苷鍵酶的活性，一定程度上降低了天麻苷的分解。這一結(jié)果與本研究相同。在蒸制處理的J 組樣品中，天麻的有效成分含量最高（42.76 mg/g），添加劑用量（1 g/L） 也低于其他處理組。分析認為：在蒸制條件下，天麻不直接與水分接觸，較煮制斷生而言會減弱成分向外滲透的作用，故保留的有效成分含量較高。在安全性方面，當煮制斷生且SMS的質(zhì)量濃度大于6 g/L 后，天麻的有效成分含量呈降低趨勢，且二氧化硫殘留量可能超過最大限值（400 mg/kg[25]），因此，在生產(chǎn)中應(yīng)嚴格注意SMS 的使用劑量。天麻作為藥食同源產(chǎn)品，應(yīng)多方面綜合評估其在產(chǎn)地加工過程中添加劑的種類、用量和用法問題，針對其藥材和食品的雙重屬性制定加工管理規(guī)范。此外，亞硫酸鹽作為化學合成制劑，會造成不同程度的二氧化硫殘留，具有潛在的安全風險，不應(yīng)作為長期使用的加工原料。后續(xù)研究應(yīng)積極尋找綠色的替代加工方案，根據(jù)天麻主要有效成分的化合物類型開發(fā)適宜的產(chǎn)地加工方案，如：杏仁和黃芩中主要為苷類成分，通常通過熱處理“殺酶保苷”[33-34]；對于薄荷等揮發(fā)油類成分較高的中藥材，通常避免加熱和處理時間過長等[35]。

4 結(jié)論

產(chǎn)地加工時，及時的斷生處理可以降低天麻有效成分的損失，一定質(zhì)量濃度的SMS 溶液浸泡也可以減少天麻有效成分的流失；但隨著添加劑質(zhì)量濃度的上升（gt;6g/L），其有效成分含量顯著降低，且二氧化硫殘留量可能超出限值標準。此外，蒸制斷生的效果優(yōu)于煮制斷生。在本研究中，蒸制斷生且添加1 g/L SMS 的加工方式處理下，天麻6 種有效成分的總含量最高，且添加劑的用量最少，增加了天麻產(chǎn)品的安全性。建議在產(chǎn)地加工過程中應(yīng)盡量減少亞硫酸鈉鹽類添加劑的使用，避免天麻與水分直接接觸，并采用快速蒸制斷生的處理方法，以保證天麻的品質(zhì)。

責任編輯：何謦成