刁翯 白文佩 趙立東

【摘要】 背景 近年來(lái)，圍絕經(jīng)期聽(tīng)力損失（PMS-HL）癥狀得到普遍關(guān)注，但無(wú)針對(duì)性治療。左慈丸治療耳聾已有百年歷史，但尚無(wú)該藥治療PMS-HL的相關(guān)研究。目的 在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，初步探討左慈丸對(duì)PMS-HL的作用機(jī)制及治療靶點(diǎn)。方法 檢索數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)限均為建庫(kù)至2023年2月。根據(jù)左慈丸的組方，通過(guò)TCMSP和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘該藥物活性成分和作用靶點(diǎn)，根據(jù)GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取PMS-HL的蛋白靶點(diǎn)，取其交集，篩選左慈丸治療PMS-HL的潛在治療靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白相互作用分析功能篩選核心靶點(diǎn)。采用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白的功能及其通路進(jìn)行富集分析。使用Autodock和Pymol對(duì)核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，確定核心靶點(diǎn)與左慈丸的關(guān)鍵活性成分之間的結(jié)合能力。于2022年9月—2023年1月建立絕經(jīng)大鼠模型：假手術(shù)組（SHAM）組、去卵巢組（OVX）組、左慈丸（ZCW）組，并檢測(cè)血清中關(guān)鍵蛋白白介素1β（IL-1β）水平，使用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 左慈丸組方中化合物的活性成分90個(gè)，潛在蛋白靶點(diǎn)226個(gè)，PMS-HL相關(guān)靶點(diǎn)2 481個(gè)，左慈丸與PMS-HL交集靶點(diǎn)150個(gè)。基因本體論（GO）功能中獲得生物過(guò)程共183個(gè)條目，分子功能103個(gè)條目，細(xì)胞成分103個(gè)條目；京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）前三位分別是癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化病變通路和化學(xué)致癌的受體激活通路。分子對(duì)接顯示，左慈丸治療PMS-HL的主要活性成分有槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿和海風(fēng)藤酮；左慈丸的活性成分與核心靶蛋白：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、白介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、IL-1β、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）結(jié)合能穩(wěn)定。3組大鼠血清IL-1β水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.73，P<0.001）。結(jié)論 左慈丸中的槲皮素等90個(gè)活性成分通過(guò)作用于AKT1等226個(gè)潛在蛋白，實(shí)現(xiàn)調(diào)控組織細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血脂血糖代謝、抗腫瘤等途徑，直接或間接地起到保護(hù)圍絕經(jīng)期聽(tīng)力功能的作用，IL-1β可能是其中發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶蛋白。

【關(guān)鍵詞】 圍絕經(jīng)期；聽(tīng)力損失；左慈丸；中藥化學(xué)成分；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接

【中圖分類號(hào)】 R 711.51 R 764.43 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0390

Chemical Composition and Mechanism of Zuoci Pill in Treating Perimenopausal Hearing Loss Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Technology

DIAO He1*，BAI Wenpei2，ZHAO Lidong3

1.Department of Traditional Chinese Medicine，Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics/Nankai University Maternity Hospital/Tianjin Key Laboratory of Human Development and Reproductive Regulation，Tianjin 300199，China

2.Department of Obstetrics and Gynecology，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China

3.Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，Chinese PLA General Hospital/National Clinical Research Center for Otolaryngologic Diseases/State Key Lab of Hearing Science Affiliated to Chinese Ministry of Education/Beijing Key Lab of Hearing Impairment Prevention and Treatment，Chinese PLA Medical School，Beijing 100853，China

*Corresponding author：DIAO He，Attending? physician；E-mail：hedia@bjmu.edu.cn

【Abstract】 Background In recent years，the symptoms of perimenopausal hearing loss（PMS-HL）have received widespread attention，but there is no targeted treatment. Zuoci pill has been used clinically for a hundred years，but there is no relevant research on the treatment of PMS-HL with this drug. Objective To explore the mechanism and therapeutic targets of Zuoci pill on PMS-HL through further validation of animal experiments based on the network pharmacology and molecular docking technology. Methods The active components and action targets of Zuoci pill were obtained through TCMSP and Uniprot databases，and the protein targets of PMS-HL were obtained through GeneCards，OMIM，TTD，DrugBank，and PharmGKB databases according to the composition of Zuoci pill from inception to February 2023，the intersection was taken to screen the potential therapeutic targets of Zuoci pill for the treatment of PMS-HL，and the "drug-active ingredient-target" interaction network diagram was constructed. The protein interaction analysis function of the String database was utilized to screen core targets. The Metascape database was used for enrichment analysis of the function of the proteins and pathways. Molecular docking of the core proteins was performed using Autodock and Pymol software to determine the binding capacity between key active ingredients and core targets. The menopausal animal model was established from September 2022 to January 2023，including Sham operation group（SHAM）group，ovariectomized（OVX）group，and Zuoci pill（ZCW）group，and serum level of the key protein interleukin 1β（IL-1β）was detected and statistically analyzed using SPSS 26.0. Results There were 90 active components，226 potential protein targets，2 481 PMS-HL related targets，and 150 Zuoci pill and PMS-HL intersection targets for the compounds in the Zuoci pill formula. A total of 183 items for biological process，103 items for molecular function，and 103 items for cellular components were obtained in the Gene Ontology（GO）function. The top three Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）were cancer pathways，lipid and atherosclerotic lesion pathway，and receptor activation pathway for chemical carcinogenesis. Molecular docking showed that the main active ingredients of Zuoci pill in treating PMS-HL were quercetin，kaempferol，stigmasterol，β- Sitosterol，isorhamnetin，diosgenin，tetrahydrostilbene and kaempferone；the active components of Zuoci pill can bind to the core target proteins of serine/threonine kinase 1（AKT1），cellular tumor antigen p53（TP53），interleukin 6（IL-6），vascular endothelial growth factor（VEGFA），cystatinase 3（CASP3），IL-1β，epidermal growth factor receptor（EGFR），and estrogen receptor 1（ESR1）stably. Comparison of serum IL-1β level among the three groups of rats showed statistically significant difference（F=11.73，P<0.001）. Conclusion The 90 active ingredients in Zuoci pill，such as quercetin，act on 226 potential proteins such as AKT1 to regulate the antioxidant stress of tissues and cells，metabolism of blood lipids and glucose，and anti-tumor pathway，directly or indirectly protect the perimenopausal hearing function，IL-1β may be one of the key target proteins.

【Key words】 Perimenopause；Hearing loss；Zuoci pill；Chemical compositions；Network pharmacology；Molecular docking

女性的卵巢功能會(huì)伴隨衰老而逐漸減弱，導(dǎo)致激素水平的變化，進(jìn)而引發(fā)下丘腦-垂體-卵巢軸的一系列臨床表現(xiàn)，稱為圍絕經(jīng)期綜合征（perimenopausal syndrome，PMS）［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，女性圍絕經(jīng)期間存在聽(tīng)力損失（hearingloss，HL）的情況［2-3］，屬于PMS的癥狀之一。雌激素對(duì)聽(tīng)力的保護(hù)機(jī)制具有多種途徑，比如：雌激素可維持內(nèi)耳神經(jīng)、血流及代謝的水平，保持耳內(nèi)微循環(huán)平衡，從而保護(hù)聽(tīng)力功能；雌激素能夠?qū)β?tīng)覺(jué)的上皮細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而減少HL；雌激素可以調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)基因的表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)鈣離子濃度平衡進(jìn)而保護(hù)聽(tīng)神經(jīng)細(xì)胞等［4-5］。臨床上對(duì)于PMS大多采用絕經(jīng)激素治療（menopausal hormone therapy，MHT），本質(zhì)是彌補(bǔ)年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致的卵巢功能衰竭。但雌激素屬于多種功能的類固醇激素，其受體在人類組織器官上分布較為廣泛，故圍絕經(jīng)期聽(tīng)力損失（PMS-HL）使用MHT針對(duì)性欠佳。

PMS-HL屬于中醫(yī)婦科學(xué)絕經(jīng)前后諸證的范疇，其病機(jī)以腎虛為主，腎的陰陽(yáng)平衡失調(diào)，處于“陰常不足，陽(yáng)常有余”的狀態(tài)?！鹅`樞·脈度篇》中有“腎氣通于耳，腎和則耳能聞五音矣”的記載。腎精不足則出現(xiàn)HL的癥狀。左慈丸是中醫(yī)治療耳聾的經(jīng)典名方，出自《飼鶴亭集方》，在2020版《中國(guó)藥典》［6］中錄入的名稱為“耳聾左慈丸”，處方中中藥的組成包括熟地黃、茯苓、山藥、煅磁石、山茱萸、丹皮、柴胡、澤瀉共八味，主治功能為滋腎平肝，治療肝腎陰虛的耳聾、耳鳴等癥。目前研究證實(shí)，左慈丸對(duì)藥物性耳聾、突聾、老年性耳聾以及中耳炎導(dǎo)致HL均有確切療效［7-8］。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示，左慈丸可能對(duì)耳蝸內(nèi)組織的水通道蛋白4以及血清氧自由基產(chǎn)生影響，從而減少HL［9］。目前，關(guān)于左慈丸治療PMS-HL的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此，左慈丸治療PMS-HL的具體作用靶點(diǎn)和組織生物學(xué)途徑有待進(jìn)一步闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可系統(tǒng)闡釋多組分中藥的靶標(biāo)蛋白及其生物學(xué)作用［10-11］。分子對(duì)接技術(shù)可以通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)科支持，模擬化學(xué)分子的幾何結(jié)構(gòu)，通過(guò)兩分子之間的作用關(guān)系，闡明藥物與靶蛋白或活性位點(diǎn)的相互作用，預(yù)測(cè)其結(jié)合模式與親和力［12］。因此，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理及分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)左慈丸的有效成分及其治療PMS-HL的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究并進(jìn)行動(dòng)物學(xué)驗(yàn)證，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

本文數(shù)據(jù)庫(kù)檢索時(shí)限均為建庫(kù)至2023-02-28。

1.1.1 左慈丸有效成分與作用靶點(diǎn)的收集與篩選：使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)［13］對(duì)煅磁石、柴胡、熟地黃、山茱萸、丹皮、山藥、茯苓、澤瀉的相關(guān)活性成分進(jìn)行篩選，推算作用靶點(diǎn)。活性成分滿足以下條件：類藥性（oral bioavailability，OB）≥30%；藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18［14］。刪除重復(fù)的靶點(diǎn)后，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)［15］（http：//www.uniprot.org/）進(jìn)行分析，限定物種為人（已驗(yàn)證），對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1.2 PMS-HL疾病靶點(diǎn)獲?。菏褂肎eneCards［16］（https：//www.genecards.org/）、OMIM［17］（https：//omim.org/）、TTD［18］（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank［19］（https：//go.drugbank.com/）、PharmGKB［20］（https：//www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“climactic syndrome”“primenopause syndrom”“menopause syndrome”“menopausal syndrome”“deaf”和“hearingloss”作為檢索詞，篩選PMS-HL的靶點(diǎn)基因集，刪除交集靶點(diǎn)后得到PMS-HL的靶點(diǎn)，導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1.3 繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖：分別整理左慈丸的藥物靶點(diǎn)以及PMS與HL的疾病靶點(diǎn)，導(dǎo)入Jvenn網(wǎng)站［21］（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/），進(jìn)行映射取交集，繪制韋恩圖；采用Cytoscape 3.9.1軟件［22］導(dǎo)出藥物關(guān)聯(lián)活性成分與治療靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，利用內(nèi)置工具Network Analyzer篩選核心活性成分。

1.1.4 構(gòu)建左慈丸治療PMS-HL的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)：利用String數(shù)據(jù)庫(kù)［23］（https：//string-db.org/）研究左慈丸相關(guān)靶點(diǎn)與靶點(diǎn)間的相互作用。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.9.軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。使用Network Analyzer推算拓?fù)鋮?shù)分析，根據(jù)Betweenness Centrality（中心度值）、Closeness Centrality（緊密中心度值）、Degree（節(jié)點(diǎn)連接度值）篩選核心靶蛋白。

1.1.5 基因本體論（GO）功能與京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路富集分析：將左慈丸治療PMS-HL的靶基因上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)［24］（http：//metascape.org/gp/index.html），物種：“Homo Sapiens”，得出GO功能和KEGG信號(hào)通路的富集結(jié)果（以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。GO富集分析包含3個(gè)方面：細(xì)胞組分（cellularcomponent，CC）、生物過(guò)程（biologicalprocess，BP）和分子功能（molecularfunction，MF）。結(jié)果設(shè)置：值截止<0.01，最小重疊>3，最小富集>1.5。使用Bioinformatic平臺(tái)（http：//bioinformatics.com.cn/）繪制GO和KEGG前20個(gè)結(jié)果的氣泡圖，數(shù)據(jù)可視化處理，使用Cytoscape 3.9.1繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病-信號(hào)通路”圖。

1.2 分子對(duì)接驗(yàn)證

1.2.1 建立有效化合物配體及受體：在建立配體時(shí)，選擇核心小分子化合物。Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)［25］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索化合物并保存其3D結(jié)構(gòu)。經(jīng)PyMOL 2.6.1處理后，該化合物能量最小化，保存為mol2格式。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)［26］（https：//www.rcsb.org/）中搜索核心靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)（PDB格式），篩選原則：人類來(lái)源、具有高分辨率并且具有原始配體。以核心靶點(diǎn)作為受體。

1.2.2 分子對(duì)接驗(yàn)證：核心靶點(diǎn)蛋白經(jīng)過(guò)PyMOL 2.6.1軟件處理，將其水分子剝離，去除原始配體。采用AutoDock Tools［27］軟件處理核心靶點(diǎn)和小分子化合物。利用AutoDock 1.5.7［28］和PyMOL 2.6.1軟件進(jìn)行分子對(duì)接和結(jié)果可視化，轉(zhuǎn)化為三維圖形，導(dǎo)出熱圖分析結(jié)果。

1.3 白介素1β（IL-1β）血清水平檢測(cè)

1.3.1 研究對(duì)象：雌性SD大鼠［動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，均由北京華阜康生物有限公司提供］，10周齡，SPF級(jí)，室溫恒溫（16～24℃），濕度45%～55%，日光照12 h，去豆粕飼料，自由飲水。本方案已通過(guò)南開(kāi)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3.2 造模及分組：將60只大鼠編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)（SHAM）組、去卵巢（OVX）組、左慈丸（ZCW）組，每組20只。10周齡時(shí)，SHAM組進(jìn)行假手術(shù)、OVX組與ZCW組進(jìn)行去卵巢手術(shù)。手術(shù)5～10 d后，進(jìn)行陰道涂片巴氏染色，判斷大鼠動(dòng)情周期。12～16周齡時(shí)，ZCW組進(jìn)行左慈丸湯劑（自制）灌胃，SHAM組、OVX組等同劑量生理鹽水灌胃。大鼠用藥劑量遵循鼠-人劑量折算公式：大鼠劑量=人臨床劑量×70 kg（人均體質(zhì)量）×0.018/200 g（大鼠體質(zhì)量）。

1.3.3 藥物制備：左慈丸湯劑（熟地黃24 g、山茱萸12 g、山藥12 g、茯苓9 g、澤瀉9 g、丹皮9 g、柴胡3 g、鍛磁石3 g），原料藥物均一次性購(gòu)于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并由該院煎藥室煎制，湯液密封裝袋。后水煎液制備濃縮至0.3 g/mL。

1.3.4 標(biāo)本采集：連續(xù)干預(yù)給藥4周，麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈取血，血液室溫條件下靜置30 min，使用低溫離心機(jī)（4 ℃，3 000 r/min，離心10 min）處理，取上清液，-20 ℃保存。

1.3.5 指標(biāo)檢測(cè)：血清中白介素1β（IL-1β）蛋白使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本研究計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左慈丸與作用靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出活性成分90個(gè)，其中柴胡17個(gè)，山茱萸20個(gè)，熟地黃2個(gè)，山藥16個(gè)，茯苓15個(gè)，丹皮10個(gè)，澤瀉10個(gè)。該數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄煅磁石的活性成分，根據(jù)文獻(xiàn)補(bǔ)充的錳、銅、鋅以及四氧化三鐵4種化合物均未達(dá)到篩選條件，所以刪除。刪除活性成分中交集項(xiàng)目，刪除Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)法找到official-symbol活性成分的化合物，得到活性成分52個(gè)，其中，有4種化合物是左慈丸內(nèi)不同中藥共有的活性成分，見(jiàn)表1。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Related Targets”模塊，獲得左慈丸活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白226個(gè)。導(dǎo)入U(xiǎn)niprot標(biāo)準(zhǔn)化名稱，刪除重復(fù)及非人類靶蛋白，導(dǎo)出靶蛋白216個(gè)，對(duì)應(yīng)基因506個(gè)。

2.2 PMS-HL疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因與藥物靶點(diǎn)映射

通過(guò)利用檢索GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank及PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)分別為：PMS 3 700個(gè)，HL 10 602個(gè)，取交集后導(dǎo)出PMS-HL基因2 481個(gè)，再與左慈丸治療靶點(diǎn)取交集，最終獲得左慈丸治療PMS-HL藥物靶點(diǎn)150個(gè)。通過(guò)Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“左慈丸-活性成分-藥物靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，經(jīng)過(guò)篩選共獲得左慈丸藥物包含的52種化學(xué)成分，靶蛋白148個(gè)，相應(yīng)靶基因150個(gè)（圖1）。

2.3 “左慈丸-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖分析

將150個(gè)靶蛋白通過(guò)Cytoscape軟件繪制“左慈丸-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，獲得網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)206個(gè)，其中藥材節(jié)點(diǎn)7個(gè)、化合物節(jié)點(diǎn)50個(gè)、靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)150個(gè)，邊642條，見(jiàn)圖2。通過(guò)Network Analyzer軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行計(jì)算，并對(duì)中心度值、緊密中心度值、節(jié)點(diǎn)連接度值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行篩選，得到藥物作用的關(guān)鍵樞紐靶點(diǎn)。每個(gè)靶點(diǎn)平均與化合物相互作用的個(gè)數(shù)為13.1，每個(gè)化合物平均與靶點(diǎn)相互作用的個(gè)數(shù)為3.9。提示了左慈丸組方內(nèi)多種化合物成分與多治療靶點(diǎn)具有共同作用，體現(xiàn)了左慈丸治療MPS-HL疾病的組方具有整體性和聯(lián)系性的特點(diǎn)。通過(guò)篩選得出節(jié)點(diǎn)連接度值前8位的活性成分：槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿、海風(fēng)藤酮。左慈丸的4種共有活性成分（槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇）均在前8位，見(jiàn)表2。網(wǎng)絡(luò)中靶基因的面積大小依據(jù)degree設(shè)定，由圖2可知PTGS2、PGR、NR3C2、HSP90AA1、TOP2A、F2R、ADRB2、DPP4、F10、PPARG、CHRM2等靶基因度值較大。

2.4 左慈丸治療PMS-HL潛在作用靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將靶基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)獲取左慈丸治療PMS-HL靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)，下載TSV文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1進(jìn)行可視化及并使用Mcode進(jìn)行基因連通性分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，以Mcode分?jǐn)?shù)定義靶點(diǎn)基因大小，分?jǐn)?shù)越高者為位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心連通性較高的靶基因，兩種靶基因相互關(guān)系證據(jù)程度分?jǐn)?shù)（combine score）以邊的顏色表示（圖3A）。在該網(wǎng)絡(luò)中具有節(jié)點(diǎn)150個(gè)，邊2 770條。緊密中心度值平均值為0.544 944 496、節(jié)點(diǎn)連接度值平均值為36.93、中心度值平均值為0.005 950。以節(jié)點(diǎn)連接度值73.86、中心度值≥0.011 9作為條件篩選得出核心網(wǎng)絡(luò)圖（圖3B）。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、白介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、IL-1β、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、腫瘤相關(guān)性蛋白（MYC）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF1A）為節(jié)點(diǎn)連接度值排名前10位靶蛋白，見(jiàn)表3。

2.5 GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析

GO功能富集分析：生物過(guò)程（biological process，BP）分析獲得183個(gè)條目，其中排名前3位的分別為：response to xenobiotic stimulus（對(duì)異種刺激的反應(yīng)）、response to hormone（對(duì)激素的反應(yīng)）、response to inorganic substance（對(duì)無(wú)機(jī)化合物的反應(yīng)）；細(xì)胞組分（cell component，CC）分析獲得78個(gè)條目，其中排名前3位的分別為：membrane raft（膜筏）、vesicle lumen（囊泡腔）、transcription regulator complex（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體）；分子功能（molecular function，MF）分析獲得103個(gè)條目，其中排名前3位的分別為：kinase binding（蛋白激酶結(jié)合）、DNA-binding transcription factor binding（DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合）、protein domain specific binding（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合）。分別選取BP、CC、MF結(jié)果排名前20位的過(guò)程繪制GO功能氣泡圖，見(jiàn)圖4。

KEGG信號(hào)通路富集分析共獲得161條信號(hào)通路，選取最為顯著的20個(gè)過(guò)程繪制KEGG信號(hào)通路富集氣泡圖，見(jiàn)圖5。使用Cytoscape 3.9.1繪制KEGG信號(hào)通路富集制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病-信號(hào)通路”圖，見(jiàn)圖6。

2.6 分子對(duì)接

利用AutoDock軟件將槲皮素、山柰酚、豆甾醇、谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿、海風(fēng)藤酮（即“左慈丸-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點(diǎn)連接度值最高的8個(gè)活性成分）與AKT1、TP53、IL-6、VEGFA、CASP3、IL-1β、EGFR、ESR1（PPI網(wǎng)絡(luò)圖中8個(gè)核心蛋白）進(jìn)行分子對(duì)接。以上核心蛋白PDB數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)分別為：7nh5、4rg2、1aIu、3qtk、3kjf、3ltq、8a27、5aav。其中二者結(jié)合能≤0 kcal/mol說(shuō)明兩者可以結(jié)合，結(jié)合能≤-2.0 kcal/mol說(shuō)明有較好的結(jié)合能力［10］，結(jié)合能越低，即結(jié)合越穩(wěn)定。結(jié)果顯示，化合物與靶蛋白的結(jié)合能如熱圖（圖7）所示，提示左慈丸中的8種化學(xué)成分與靶點(diǎn)蛋白與化合物綜合結(jié)合能力較強(qiáng)的蛋白為IL-1β與ESR1。利用PyMOL軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行三維圖轉(zhuǎn)化，圖中可展示活性成分與蛋白的分子對(duì)接，見(jiàn)圖8。

2.7 模型檢測(cè)

大鼠去勢(shì)后5～10 d，經(jīng)陰道脫落細(xì)胞巴氏染色（圖9）發(fā)現(xiàn)，SHAM組大鼠的脫落細(xì)胞中有被染成粉紅色、鱗狀脫落的角質(zhì)細(xì)胞及膨大的橢圓形上皮細(xì)胞，提示大鼠可能處于動(dòng)情期及動(dòng)情前期。OVX組與ZCW組只有透明藍(lán)黑色核深染的白細(xì)胞和少量較小的扁平上皮細(xì)胞，提示OVX組與ZCW組大鼠均無(wú)動(dòng)情周期。

2.8 IL-1β檢測(cè)及分析

給藥4 周后，大鼠主動(dòng)脈取血檢測(cè)血清IL-1β。3組大鼠血清IL-1β水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中OVX組、ZCW組大鼠血清IL-1β水平均高于SHAM組，而ZCW組大鼠血清IL-1β水平低于OVX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠減少聽(tīng)力的損失，絕經(jīng)期使用MHT能夠減緩女性絕經(jīng)時(shí)帶來(lái)的HL［2-4］。但由于雌激素是具有多種功能的類固醇激素，在身體的其他組織和器官的細(xì)胞內(nèi)也有受體，因此臨床上并沒(méi)有針對(duì)PMS-HL的癥狀而使用MHT。

左慈丸是治療腎虛類耳聾的名方，臨床研究數(shù)據(jù)表明，左慈丸可治療感音性耳聾、老年性耳聾以及慢性分泌性中耳炎導(dǎo)致聽(tīng)力下降等疾?。谎芯堪l(fā)現(xiàn)左慈丸可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激以及影響細(xì)胞的自噬與凋亡通路，進(jìn)而緩解年齡相關(guān)的HL［6-8］。但目前沒(méi)有針對(duì)左慈丸治療PMS-HL的相關(guān)研究。本研究創(chuàng)新性地將圍絕經(jīng)期與HL的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匯總導(dǎo)出并取得交集，從而獲得PMS-HL的潛在治療靶點(diǎn)。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)左慈丸中藥成分進(jìn)行研究，根據(jù)“左慈丸-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)其活性成分排名靠前的為槲皮素，山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿和海風(fēng)藤酮。其中，槲皮素、山柰酚、豆甾醇和β-谷甾醇均為左慈丸中多味中藥共同含有的活性成分。進(jìn)一步對(duì)其活性成分的治療靶點(diǎn)與PMS-HL靶點(diǎn)取交集，篩選潛在靶基因，并進(jìn)行富集分析。GO富集結(jié)果提示，靶蛋白主要集中在細(xì)胞的細(xì)胞膜筏、囊泡腔以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體等位置，生物過(guò)程主要表現(xiàn)為對(duì)異種刺激的反應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)和對(duì)無(wú)機(jī)化合物的反應(yīng)，其生物功能表現(xiàn)為蛋白激酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合。KEGG分析提示，在基因靶點(diǎn)富集的疾病通路中，前3名分別是：癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化病變通路和化學(xué)致癌的受體激活通路。

既往研究表明，耳聾的發(fā)病與伴隨衰老出現(xiàn)的代謝異常明顯相關(guān)；血黏度、血脂增高以及動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等可作為獨(dú)立因素導(dǎo)致聽(tīng)功能異常的發(fā)生［29-30］。左慈丸中的黃酮類活性成分：槲皮素、山柰酚、異鼠李素以及海風(fēng)藤酮具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂以及免疫保護(hù)等藥理作用和生物活性［31-32］；有研究發(fā)現(xiàn)，該類化合物能緩解慢性中耳炎、氧化應(yīng)激等導(dǎo)致的HL［33-34］。左慈丸中植物甾醇類活性成分：β-谷甾醇和豆甾醇具有抗氧化、降血糖、降低膽固醇的作用［35-36］，但目前沒(méi)有研究發(fā)現(xiàn)該類化合物與聽(tīng)力直接相關(guān)，提示該類活性化合物可能通過(guò)血糖、血脂的調(diào)節(jié)及抗氧化應(yīng)激等途徑間接保護(hù)聽(tīng)力功能。左慈丸中多種中藥共有的活性成分具有一致性，這也體現(xiàn)了中藥配伍中的“相須”和“相使”原則，即性能相似者以增強(qiáng)療效；作用在同一生物學(xué)通路者，一種藥物可以輔助另一種藥物來(lái)提高其原有的療效。

PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前8位的靶基因AKT1、TP53、VEGFA、IL-6、CASP3、IL-1β、EGFR、ESR1等，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多靶點(diǎn)治療的特點(diǎn)。通過(guò)分子對(duì)接結(jié)合能數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，核心蛋白與核心活性成分之間的結(jié)合能均≤-2.0 kcal/mol，說(shuō)明藥物和靶蛋白之間具有較好的結(jié)合能力，相互作用穩(wěn)定。其中，綜合結(jié)合能最為穩(wěn)定的是IL-1β和ESR1。IL-1β是IL-1家族中最為重要的成員，IL-1家族在生物體先天性免疫中發(fā)揮著重要作用。有動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胰島素生長(zhǎng)因子1缺乏時(shí)，在噪聲暴露環(huán)境下的衰老大鼠血清IL-1β水平增多，HL更為明顯［37］，這可能是造成糖尿病HL的病理機(jī)制。并有研究發(fā)現(xiàn)，衰老、噪聲以及耳毒性藥物導(dǎo)致的HL都會(huì)引起血清IL-1β水平增多［38］。本研究建立去勢(shì)模型，驗(yàn)證了雌激素缺失可導(dǎo)致血清IL-1β水平升高，而左慈丸治療能夠降低其血清IL-1β水平。該結(jié)果提示，左慈丸可能是通過(guò)IL-1β調(diào)控其下游，進(jìn)而減少HL。ESR1是雌激素受體α，在前期研究中發(fā)現(xiàn)，該蛋白在內(nèi)、外毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)上均有分布；雌激素的減退會(huì)影響外毛細(xì)胞中的動(dòng)力蛋白含量，并會(huì)導(dǎo)致大鼠高頻聽(tīng)力聽(tīng)閾升高［39］。本研究結(jié)果顯示，左慈丸中的活性成分可能與ESR1結(jié)合，發(fā)揮雌激素樣作用，從而減少雌激素導(dǎo)致的HL。但由于沒(méi)有對(duì)雌激素通路下游的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，左慈丸是否具有雌激素同樣的分子生物學(xué)功能仍有待驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，初步研究左慈丸治療PMS-HL的作用機(jī)制，闡述左慈丸可能通過(guò)其活性成分槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、薯蕷皂苷、四氫鴨腳木堿和海風(fēng)藤酮，作用于AKT1、EGFR、TP53、VEGFA、IL-6、CASP3、IL-1β、ESR1等靶點(diǎn)，通過(guò)癌癥通路、脂質(zhì)代謝與動(dòng)脈粥樣硬化病變通路以及化學(xué)致癌的受體激活等通路，多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同保護(hù)聽(tīng)力。研究結(jié)果體現(xiàn)了中藥復(fù)方配伍的嚴(yán)謹(jǐn)性和實(shí)用性，為闡明PMS-HL生理病理過(guò)程以及左慈丸對(duì)該癥的治療作用及其機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。但本研究受實(shí)驗(yàn)條件影響，未能對(duì)左慈丸入血的有效成分進(jìn)行進(jìn)一步探索，僅利用分子結(jié)合能推理出關(guān)鍵蛋白，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證?？赡軙?huì)忽略其他化合物，從而錯(cuò)失更為關(guān)鍵的靶蛋白。此外，期待未來(lái)的研究能夠?qū)?dòng)物進(jìn)行測(cè)聽(tīng)驗(yàn)證，進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)。

作者貢獻(xiàn)：刁翯負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)文章思路與框架，繪制圖表，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果和可視化呈現(xiàn)，撰寫(xiě)論文，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)；白文佩、趙立東負(fù)責(zé)論文終稿審校及質(zhì)量控制。

本文無(wú)利益沖突。

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