◎ 宋春雪

(盤(pán)錦檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧 盤(pán)錦 124000）

氯霉素是抗生素的一種，用來(lái)治療水產(chǎn)以及畜禽等動(dòng)物與細(xì)菌相關(guān)的各種疾病，藥性較好，作用顯著，但其會(huì)殘留在動(dòng)物體內(nèi)。人們長(zhǎng)期食用含有此類藥物的食品，可能罹患血液疾病[1]。因此，與氯霉素相關(guān)的藥物已成為獸藥殘留必檢的項(xiàng)目[2]。目前，檢測(cè)氯霉素的方法有液相色譜法、氣相色譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）[3]。其中，檢測(cè)相同濃度的氯霉素時(shí)，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)具有靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度更高的特點(diǎn)[4]。由于動(dòng)物源性食品成分復(fù)雜，為使檢測(cè)結(jié)果更可信，對(duì)不確定度進(jìn)行測(cè)量評(píng)定非常有必要[5]。本文深入探討使用UPLC-MS/MS 檢測(cè)豬肉中氯霉素殘留量時(shí)的各種影響因素，并對(duì)這些影響因素進(jìn)行分析，為其他相關(guān)聯(lián)獸藥殘留量測(cè)量提供相關(guān)資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

AB4000QTRAP 液質(zhì)聯(lián)用儀（AB 公司）；FA2004N電子天平（上海精密儀器有限公司）；VORTEX-6 型旋渦儀（其林貝爾公司）；HSC-24B 氮吹儀（恒奧科技發(fā)展有限公司）；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA）；Z36HK型高速離心機(jī)（其林貝爾公司）。

1.2 材料與試劑

豬肉為當(dāng)?shù)厥惺凵唐?，?lái)源于新發(fā)地批發(fā)市場(chǎng)。

LC-Si 固相萃取柱（200 mg，3 mL，逗點(diǎn)公司）；微孔濾膜（0.22 μm，Agilent）；正己烷（色譜純，F(xiàn)isher）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）；丙酮（色譜純，F(xiàn)isher）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；正丙醇（分析純，國(guó)藥）；標(biāo)準(zhǔn)品：氯霉素（純度為99.3%，不確定度為0.03%，k=2，德國(guó)Dr）、氯霉素-D5（濃度為100 μg·mL-1，不確定度為1.2%，k=2，德國(guó)Dr）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 22338—2008 中3.4 部分進(jìn)行樣品制備與保存，3.5 部分進(jìn)行樣品提取與凈化。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A 相為乙腈，B 相為10 mmol·L-1乙酸銨溶液。梯度洗脫程序：0 min，10% A；1.00 min，10% A；2.50 min，90% A；5.50 min，90% A；5.51 min，10% A；7.00 min，10% A。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：ESI-；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子電壓：-4 500 V；離子源溫度：550 ℃；其掃描采集參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)測(cè)定過(guò)程，分析了影響結(jié)果的各種分量的來(lái)源，主要包括4 方面內(nèi)容。①重復(fù)性測(cè)量。②樣品稱量過(guò)程。③樣品定容過(guò)程（包括定容過(guò)程中溫度變化）。④標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 測(cè)量結(jié)果重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(rep)

對(duì)樣品進(jìn)行6 次平行測(cè)量，測(cè)得氯霉素含量xi分別為1.92 μg·kg-1、1.90 μg·kg-1、1.94 μg·kg-1、1.89 μg·kg-1、1.84 μg·kg-1和1.86 μg·kg-1，平行測(cè)定結(jié)果的平均值為1.89 μg·kg-1。

單次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為

測(cè)量結(jié)果重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 樣品稱量過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

用分析天平稱取5.000 g 樣品，稱量的最大允許誤，則樣品稱量過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為差為0.1 mg，按均勻分布處理

2.2.3 樣品定容過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)

用A 級(jí)刻度吸管吸取5 mL 丙酮-正己烷（體積比為1∶9），其允差為±0.025 mL，按均勻分布處理，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

樣品最終用1 mL A 級(jí)刻度吸管定容并上樣分析，其允差為±0.008 mL，按均勻分布處理其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，可得樣品定容過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度引入的不確定度。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息可知氯霉素外標(biāo)純度引入的不確定度為0.03%（k=2）；氯霉素內(nèi)標(biāo)純度引入的不確定度為1.2%（k=2），則氯霉素外標(biāo)、內(nèi)標(biāo)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度。①1 mg·mL-1氯霉素配制過(guò)程：準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)0.010 07 g，用甲醇溶解、定容至（10±0.02）mL容量瓶。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量和定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

1 μg·mL-1氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過(guò)程為精密吸取氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)（100±1）μL 于（10±0.02）mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸取和定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

②標(biāo)準(zhǔn)中間液引入的不確定度。1 μg·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液配制過(guò)程為精密吸取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100±1）μL 于（100±0.10）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸取和定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

③標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度。100 ng·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程為精密吸取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 000±10）μL 于（10±0.02）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸取和定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

100 ng·mL-1氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程為精密吸取氯霉素D5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000±10）μL 于（10±0.02）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸取和定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

④混合標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度。準(zhǔn)確吸取100 ng·mL-1氯 霉素標(biāo)準(zhǔn)工 作液（200±2）μL，100 ng·mL-1氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液（500±5）μL，用空白基質(zhì)液稀釋、定容至（10±0.02）mL 容量瓶中，配成標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為2 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)為5 ng·mL-1。

則吸?。?00±2）μL 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

將（200±2）μL 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液定容到（10±0.02）mL 容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

吸?。?00±5）μL 氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

將（500±5）μL 氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液定容到（10±0.02）mL 容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）溫度變化引入的不確定度。上述標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中用到了10 mL 和100 mL 容量瓶，在使用容量瓶過(guò)程中，溫度的變化也會(huì)導(dǎo)致容量瓶體積的微量變化，導(dǎo)致不確定度的引入。假設(shè)室溫有3 ℃差異（ΔT=3），液體膨脹系數(shù)ρ=1.18×10-3/℃，則溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度（最小二乘法擬合）。用配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)定3 次，得到的峰面積比分別為0.673、0.664、0.654，則平均峰面積比為0.664，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.332x，r=0.999 9。標(biāo)準(zhǔn)曲線剩余標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算為

式中：yi為各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值；y為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的理論響應(yīng)值；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù)（由于每個(gè)點(diǎn)測(cè)3 次，n=3）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜上，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.5 合成不確定度

將各不確定度分量匯總，合成不確定度為

2.2.6 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

3 結(jié)論

本文使用UPLC-MS/MS 法檢測(cè)了豬肉中氯霉素的殘留量，建立了特定的數(shù)學(xué)模型，并用此模型對(duì)不確定度進(jìn)行了計(jì)算、模擬和評(píng)估。在整個(gè)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，能夠引入不確定度的過(guò)程很多，包括稱量、提取、凈化、質(zhì)譜測(cè)定等。本實(shí)驗(yàn)從標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制、樣品前處理、樣品重復(fù)測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合這4 個(gè)方面分析評(píng)定引入的不確定度。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合這2 個(gè)步驟引入的不確定度分量最大，其次是體積量取和測(cè)量重復(fù)性這2 個(gè)過(guò)程。因此，可以通過(guò)提高標(biāo)準(zhǔn)品純度、對(duì)前處理各步驟進(jìn)行優(yōu)化、增加測(cè)定重復(fù)次數(shù)、提高UPLC-MS/MS 靈敏度、對(duì)所用到的儀器定期進(jìn)行檢定以及不斷提高化驗(yàn)員的實(shí)驗(yàn)水平等方式對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行控制，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。