宋瑞雪 董靜 姚明旭 賈紅彥 李自慧 孫琦 朱傳智 杜博平 邢愛英 潘麗萍

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病,其防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻[1]。對(duì)結(jié)核病防控的關(guān)鍵在于盡早診斷和及時(shí)治療。盡管分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得目前病原學(xué)檢出率有所提升,但臨床仍存在約50%的病原學(xué)陰性結(jié)核病患者,需要依靠免疫學(xué)、影像學(xué)等輔助方法進(jìn)行診斷[2]。

近年來,有研究發(fā)現(xiàn)γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(interferon gamma-induced protein 10,IP-10)可能作為結(jié)核病輔助診斷的新靶標(biāo)[3-4]。IP-10是CXC家族中的一種趨化因子,在結(jié)核特異性抗原刺激后其表達(dá)水平明顯高于γ-干擾素(IFN-γ)[5]。有研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)核抗原刺激的2.5～8 h內(nèi),IP-10 mRNA的表達(dá)可以上調(diào)約100倍[6],故以IP-10 mRNA為靶點(diǎn)診斷結(jié)核感染可能帶來更高敏感性[7-8]。既往研究發(fā)現(xiàn),IP-10 mRNA可用于結(jié)核感染的檢測(cè)[9],而且對(duì)結(jié)核病具有一定的輔助診斷價(jià)值,但目前尚無在不同年齡組中分析IP-10 mRNA檢測(cè)診斷性能的數(shù)據(jù)。因此,本研究采用前瞻性分析,納入了1590例疑似結(jié)核病患者,根據(jù)年齡分為中青年組和老年組,根據(jù)最終臨床診斷結(jié)果,分別對(duì)不同年齡組內(nèi)IP-10 mRNA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析,進(jìn)一步評(píng)估IP-10 mRNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)不同年齡組結(jié)核病的輔助診斷價(jià)值。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

于2018年3月至2022年7月,在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院、河南省傳染病醫(yī)院和深圳市第三人民醫(yī)院連續(xù)性、前瞻性納入疑似結(jié)核病患者,共計(jì)1590例,剔除診斷不明確200例,共1390例納入分析。根據(jù)研究對(duì)象的臨床表現(xiàn)、常規(guī)生化檢測(cè)、結(jié)核病病原學(xué)檢測(cè)、影像學(xué)檢測(cè)和(或)病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果,將上述患者分為確診結(jié)核病組475例、臨床診斷結(jié)核病組518例和非結(jié)核病組397例。本研究通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),編號(hào)為(2018)年臨審第(2017-40-01)和(2019)年臨審第(2017-40-02),所有研究對(duì)象入組前均簽署知情同意書。

二、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)確診結(jié)核病組:參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[10],具有結(jié)核病臨床表現(xiàn)且具有MTB病原學(xué)診斷依據(jù)者。(2)臨床診斷結(jié)核病組:參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[10],具有結(jié)核病臨床表現(xiàn)且具備結(jié)核病影像學(xué)表現(xiàn),排除肺部其他疾病者。(3)非結(jié)核病組:主要指肺炎、肺癌、非結(jié)核分枝桿菌病等易混淆疾病,均按相應(yīng)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷,并經(jīng)臨床診斷及鑒別診斷最終確診。

2.排除標(biāo)準(zhǔn):年齡<18歲,最終診斷不明或者隨訪期內(nèi)診斷更改。

三、研究方法

1.IP-10 mRNA檢測(cè):采用IP-10 mRNA檢測(cè)試劑盒(蘇州創(chuàng)瀾生物科技有限公司)并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采集肝素抗凝靜脈血均勻分至空白對(duì)照管(N管)、結(jié)核抗原管(T管)和陽性抗原管(P管),每管1.2 ml,立即輕柔顛倒混勻3～5次,使血液充分與管內(nèi)壁接觸,然后轉(zhuǎn)入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)6 h。孵育后的全血標(biāo)本在全自動(dòng)核酸檢測(cè)反應(yīng)體系構(gòu)建系統(tǒng)上完成外周血標(biāo)本的RNA提取(儀器全自動(dòng)操作,蘇州創(chuàng)瀾生物科技有限公司,Innovo-100)。取10 μl RNA,按照50 ℃ 20 min,85 ℃ 2 min逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取10 μl cDNA,15 μl聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(包含探針、酶和緩沖液),組成25 μl擴(kuò)增體系,按照50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,然后95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s循環(huán)40次,完成實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR), qPCR檢測(cè)在美國(guó)ABI公司7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成。軟件自動(dòng)計(jì)算靶標(biāo)IP-10和內(nèi)參基因CHMP2A的擴(kuò)增循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct),采用ΔCt=Ct靶標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因的方法分別計(jì)算N管、T管和P管中靶標(biāo)IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)T管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量減去N管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量≤-1.04,定義為陽性結(jié)果;當(dāng)T管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量減去N管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量>-1.04,且P管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量減去N管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量≤-1.2時(shí),定義為陰性;當(dāng)T管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量減去N管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量>-1.04,且P管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量減去N管中IP-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量>-1.2時(shí),定義為不確定結(jié)果。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]”描述,組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以“百分率/構(gòu)成比(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)。基于R語言完成敏感度和特異度變化的Mann-Kendall趨勢(shì)檢驗(yàn),散點(diǎn)圖應(yīng)用Prism 8.0繪制。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般特征

1390例納入分析的研究對(duì)象中,確診結(jié)核病組475例,包括男317例,女158例,年齡18～88歲,中位年齡為41歲;臨床診斷結(jié)核病組518例,其中男300例,女218例,年齡18～95歲,中位年齡為37歲;非結(jié)核病組397例,其中男232例,女165例,年齡18～88歲,中位年齡為53歲。具體見表1。

表1 研究對(duì)象的一般特征

按照世界衛(wèi)生組織年齡分段將納入分析的人群進(jìn)行分組[11],中青年組1062例(18～59歲)和老年組328例(60～95歲)。中青年組中,結(jié)核病患者810例,男489例,女321例,中位年齡33歲,其中確診結(jié)核病患者376例,男243例,女133例,中位年齡33歲;臨床診斷結(jié)核病患者434例,男246例,女188例,中位年齡33歲;非結(jié)核病患者252例,男146例,女106例,中位年齡45歲。老年組中,結(jié)核病患者183例,男128例,女55例,中位年齡66歲。其中確診結(jié)核病患者99例,男74例,女25例,中位年齡66歲;臨床診斷結(jié)核病患者84例,男54例,女30例,中位年齡67歲;非結(jié)核病患者145例,男86例,女59例,中位年齡67歲。

二、IP-10 mRNA檢測(cè)的診斷效能評(píng)估

1.IP-10 mRNA檢測(cè)在結(jié)核病輔助診斷中的價(jià)值評(píng)估:1390例納入分析的研究對(duì)象中,IP-10 mRNA檢測(cè)有效者1366例(98.3%),不確定結(jié)果24例(1.7%),其中,結(jié)核病組13例,非結(jié)核病組11例,主要原因是陽性對(duì)照管中靶標(biāo)IP-10的相對(duì)表達(dá)量低于設(shè)定的閾值。剔除獲得的24例不確定結(jié)果,在剩余的1366例有效檢測(cè)標(biāo)本中分析IP-10 mRNA檢測(cè)的診斷效能。結(jié)核病組980例患者中,880例IP-10 mRNA檢測(cè)陽性;非結(jié)核病組386例患者中,246例IP-10 mRNA檢測(cè)陰性。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn),IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度為89.8%(95%CI:87.7%～91.6%),特異度為63.7%(95%CI:58.7%～68.5%)。IP-10 mRNA檢測(cè)的陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽性似然比、陰性似然比分別為86.3%(95%CI:84.0%～88.3%)、71.1%(95%CI:66.0%～75.8%)、2.48(95%CI:2.17～2.83)、0.16(95%CI:0.13～0.19)。其中確診結(jié)核病組和臨床診斷結(jié)核病組的陽性檢出率分別為92.3%(432/468,95%CI: 89.4%～94.4%)和87.5%(448/512,95%CI: 84.2%～90.2%)。在非結(jié)核病組中,肺癌組、肺炎組和非結(jié)核分枝桿菌病組的陰性檢出率分別為53.7%(72/134,95%CI:44.9%～62.3%)、61.3%(106/173,95%CI:53.6%～68.5%)和83.3%(35/42,95%CI:68.0%～92.5%)。

2.不同年齡組中IP-10 mRNA檢測(cè)輔助診斷結(jié)核病的性能分析:中青年組(18～59歲)中,結(jié)核病組患者799例,非結(jié)核病組患者247例,IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度和特異度分別為90.2%(95%CI:87.9%～92.1%)和68.8%(95%CI:62.6%～74.4%)。中青年組中,按照0～20歲、20～40歲、40～60歲進(jìn)行了進(jìn)一步亞組分析。在0～20歲中,31例結(jié)核病組患者中27例IP-10 mRNA檢測(cè)陽性,5例非結(jié)核病組患者中3例IP-10 mRNA檢測(cè)陰性,IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度和特異度分別為87.1%(95%CI:69.2%～95.8%)和60.0%(95%CI:17.0%～92.7%);20～40歲中,480例結(jié)核病組患者中435例IP-10 mRNA檢測(cè)陽性,86例非結(jié)核病組患者70例IP-10 mRNA檢測(cè)陰性,IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度和特異度分別為90.6%(95%CI:87.6%～93.0%)和81.4%(95%CI:71.2%～88.7%);在40～60歲中,288例結(jié)核病組患者中259例IP-10 mRNA檢測(cè)陽性,156例非結(jié)核病組患者中97例IP-10 mRNA檢測(cè)陰性,IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度和特異度分別為89.9%(95%CI:85.7%～93.0%)和62.2%(95%CI:54.0%～69.7%)。老年組(60～95歲)中,結(jié)核病組患者181例,非結(jié)核病組患者139例,IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度和特異度分別為87.8%(95%CI:82.0%～92.0%)和54.7%(95%CI:46.0%～63.1%)。IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度在中青年組和老年組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.922,P=0.337),中青年組IP-10 mRNA檢測(cè)的特異度高于老年組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.704,P=0.006)。具體見表2。

表2 不同年齡組中IP-10 mRNA檢測(cè)結(jié)核病的效能分析

3.IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度和特異度隨年齡變化趨勢(shì):以每10歲為一個(gè)年齡組,將結(jié)核病組980例及非結(jié)核病組386例患者進(jìn)行分組。隨著年齡增加,IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度變化趨勢(shì)見圖1。結(jié)果顯示,無論是確診結(jié)核病組(Z=-0.157,P=0.875)、臨床診斷結(jié)核病組(Z=-0.601,P=0.548)或所有結(jié)核病組(Z=-1.063,P=0.288)中,IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度隨年齡變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各年齡組內(nèi)IP-10 mRNA診斷特異度變化趨勢(shì)見圖2。結(jié)果顯示,IP-10 mRNA檢測(cè)的特異度在30歲及以下人群中達(dá)到頂峰(81.8%),隨后隨年齡增長(zhǎng)診斷特異度逐漸降低(Z=-2.846,P=0.004)。

圖1 IP-10 mRNA檢測(cè)結(jié)核病敏感度隨年齡變化折線圖

圖2 IP-10 mRNA檢測(cè)結(jié)核病特異度隨年齡變化折線圖

討 論

目前,關(guān)于IP-10用于結(jié)核病診斷的薈萃分析研究提示其檢測(cè)的綜合敏感度為85%(95%CI:80%～88%),綜合特異度為89%(95%CI:84%～92%)[12],提示IP-10作為結(jié)核病輔助診斷靶標(biāo)的可行性。IP-10 mRNA檢測(cè)作為一種新的結(jié)核感染診斷靶標(biāo),在既往研究中對(duì)其輔助診斷結(jié)核病的性能有所分析,提示在診斷結(jié)核病中也有著良好的性能[13],但其在不同年齡分組中,特別是老年群體中對(duì)結(jié)核病輔助診斷的性能如何,現(xiàn)階段數(shù)據(jù)不足。本研究募集了一組較大樣本量的疑似結(jié)核病患者隊(duì)列,根據(jù)最終診斷分為結(jié)核病組和非結(jié)核病組,并在中青年組和老年組中分別探討了以IP-10 mRNA為靶標(biāo)的檢測(cè)技術(shù)的診斷效能,發(fā)現(xiàn)在中青年和老年組結(jié)核病患者中IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而且在年齡分層分析中IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度受年齡影響較小。既往關(guān)于γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assays,IGRA)的診斷性能評(píng)價(jià)中,均提示IGRA檢測(cè)結(jié)核病的敏感度隨年齡增長(zhǎng)而下降[14-16],國(guó)內(nèi)研究結(jié)果也提示IGRA檢測(cè)對(duì)老年結(jié)核病的敏感度相較于中青年組明顯降低[17-18],提示老年人中應(yīng)用IGRA檢測(cè)會(huì)存在更高比例的假陰性結(jié)果。但本研究發(fā)現(xiàn)IP-10 mRNA檢測(cè)對(duì)老年結(jié)核病的敏感度不受年齡影響,因此,相對(duì)于傳統(tǒng)的IGRA檢測(cè),在老年疑似結(jié)核病患者中應(yīng)用IP-10 mRNA檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行結(jié)核病診斷,可能獲益更多。

本研究中IP-10 mRNA檢測(cè)對(duì)疑似結(jié)核病的敏感度和特異度分別為89.8%(95%CI: 87.7%～91.6%)和63.7%(95%CI:58.7%～68.5%),其敏感度與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似,但特異度相對(duì)較低[19]。IP-10 mRNA檢測(cè)作為結(jié)核感染的診斷方法,與IGRA類似,并不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核病。年齡增長(zhǎng)、免疫力低下是結(jié)核感染的危險(xiǎn)因素[20-21],本研究中非結(jié)核病組患者多為老年肺癌和肺炎患者,免疫力低且容易合并感染(中位年齡為53歲),導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌潛伏感染比例增加,進(jìn)而表現(xiàn)為IP-10 mRNA檢測(cè)特異度較低。而既往關(guān)于IP-10蛋白用于診斷結(jié)核病的Meta分析中[4],主要以健康人、兒童非結(jié)核病患者或密切接觸者作為對(duì)照組,相較于本研究的對(duì)照組其潛伏感染風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低,特異度較高。本研究也在不同年齡組中分析了其特異度,發(fā)現(xiàn)在40歲及以下群體中,IP-10 mRNA檢測(cè)的整體特異度維持在80%以上。盡管在低于20歲的群體中,特異度僅為60%,但這很大程度上是因?yàn)楸狙芯恐械陀?0歲的非結(jié)核病組患者例數(shù)太少(5例)導(dǎo)致。隨著年齡增長(zhǎng),在40歲及以上年齡的人群中,潛伏感染風(fēng)險(xiǎn)增高,導(dǎo)致特異度逐漸降低,在老年組中降至60%以下。這一數(shù)據(jù)與國(guó)內(nèi)既往關(guān)于老年人中IGRA檢測(cè)的結(jié)果一致,即在我國(guó)超過60歲的老年人群中,潛伏感染率明顯上升,超過30%[22-23]。

老年患者由于缺乏典型臨床癥狀、病原學(xué)檢出率低及因免疫反應(yīng)受損導(dǎo)致對(duì)IGRA等診斷反應(yīng)減弱,因此結(jié)核病診斷困難。但與青年人相比,老年人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)卻增加了1.5倍[24],說明對(duì)老年疑似結(jié)核病患者的臨床診斷需求更加強(qiáng)烈。同時(shí),在《老年肺結(jié)核診斷與治療專家共識(shí)(2023版)》[25]中也指出對(duì)于具有危險(xiǎn)因素的老年結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者,建議進(jìn)行相關(guān)的結(jié)核病篩查。有研究表明,體外應(yīng)用MTB抗原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ比年輕人低,且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中老年小鼠對(duì)MTB的易感性增加,這可能與CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫受損有關(guān)[26],這也是IGRA檢測(cè)敏感度隨年齡增加而降低的原因之一。但本研究結(jié)果提示IP-10 mRNA檢測(cè)敏感度不受年齡影響,提示IP-10的釋放存在其他細(xì)胞來源或存在其他通路調(diào)節(jié)機(jī)制,仍需要進(jìn)一步探究。

綜上,本研究基于臨床真實(shí)世界的研究隊(duì)列,評(píng)估了IP-10 mRNA檢測(cè)在不同年齡組中對(duì)結(jié)核病診斷的性能,特別是分析了其在臨床鑒別診斷困難的老年疑似結(jié)核病患者中的診斷性能,結(jié)果提示,IP-10 mRNA檢測(cè)在老年結(jié)核病診斷中只能作為輔助手段;但在缺乏病原學(xué)證據(jù)的情況下,由于IP-10 mRNA檢測(cè)的敏感度不受年齡增長(zhǎng)影響,因此,其陰性結(jié)果能夠更好地提示臨床醫(yī)生優(yōu)先考慮其他非結(jié)核性疾病。

本研究尚存在一些不足之處。首先,在研究評(píng)估IP-10 mRNA檢測(cè)的效能時(shí),并未同時(shí)納入IGRA檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比分析。其次,受樣本量限制,本研究并未進(jìn)一步對(duì)IP-10 mRNA檢測(cè)在其他合并癥人群中的診斷效能進(jìn)行評(píng)估,其中包含糖尿病、其他免疫疾病人群和HIV感染人群等,未來應(yīng)在各類特殊人群中進(jìn)行深入分析,以便于指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)宋瑞雪:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章;董靜和姚明旭:實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù);賈紅彥:對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱;李自慧:獲取研究經(jīng)費(fèi)、支持性貢獻(xiàn);孫琦、杜博平和邢愛英:行政/技術(shù)/材料支持、支持性貢獻(xiàn);朱傳智:獲取研究經(jīng)費(fèi);潘麗萍:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、獲取研究經(jīng)費(fèi)、指導(dǎo)、支持性貢獻(xiàn)