高偉洪 曲瀟笛 姚云平 李昌模

(天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457)

近年來,隨著生活水平的提高,食用油脂的安全問題受到關(guān)注與重視[1-2]。脂質(zhì)過氧化與許多外在因素有關(guān),例如輻射、金屬離子和光照。脂類氧化不僅會在食品中產(chǎn)生令人不快的酸敗味,還會在烹飪和加工后形成有害的氧化產(chǎn)物,從而降低營養(yǎng)質(zhì)量和安全性[3]。人工合成的抗氧化劑雖對油脂的抗氧化效果顯著,但因具有潛在毒性,過量使用有一定致癌作用[4]。安全、高效、綠色的天然抗氧化劑開發(fā)已成為當(dāng)今食品科學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和發(fā)展趨勢[5-6]。

白藜蘆醇和芝麻酚是天然的酚類物質(zhì),具有抗自由基、抗氧化等生理活性,作為抗氧化劑添加到油脂中能明顯降低油脂的氧化、劣變[7-12]。Huang等[13]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與芝麻酚對高油酸花生油能起到協(xié)同保護(hù)作用,并對脂肪酸的異構(gòu)化有明顯抑制作用。雖然白藜蘆醇與芝麻酚在油脂保護(hù)方面具有明顯的協(xié)同作用,但協(xié)同機(jī)理尚不清楚,且二者對油脂中自由基清除的相關(guān)報道較少。隨著計算科學(xué)的發(fā)展,量子化學(xué)模擬技術(shù)在學(xué)術(shù)和工業(yè)研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。與傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法相比,量子化學(xué)模擬可以從化學(xué)動力學(xué)角度揭示化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理[14-15]。Tang等[16]利用量子化學(xué)觀察到不同烷基鏈長的抗氧化劑對橄欖油的影響,其中極性抗氧劑表現(xiàn)出良好的抗氧化性和相對適宜的遷移性。

研究擬將去除天然抗氧化劑的葵花籽油作為基質(zhì),研究白藜蘆醇和芝麻酚之間的相互作用。通過自由基分析和量子計算相結(jié)合的方法,深入研究白藜蘆醇與芝麻酚在葵花籽油中的協(xié)同抗氧化行為,以期為脂溶性抗氧化劑的協(xié)同作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

葵花籽油:市售;

芝麻酚、白藜蘆醇:純度98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):純度99%,西亞化學(xué)科技有限公司;

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

烘箱:DH-101-1BY型,天津市中環(huán)電爐股份有限公司;

紫外—可見光分光光度計:Evolution 300型,北京瑞利分析儀器有限公司;

高效液相色譜儀:LC-20AT型,日本島津公司;

油脂氧化穩(wěn)定儀:892型,瑞士萬通公司。

1.2 方法

1.2.1 葵花籽油的純化 100 g硅膠中加入150 mL濃鹽酸進(jìn)行酸化,然后水洗至中性,于110 ℃烘箱中活化6 h,加入50 g活性炭,攪拌均勻,加入100 g葵花籽油,200 mL正己烷,超聲、攪拌2 h,抽濾、50 ℃旋蒸,置于-18 ℃貯藏備用。

1.2.2 自由基檢測 將油樣于180 ℃加熱5 h,每隔1 h取樣,將50 μL氧化的油樣與4 mL 6 μmol/L的DPPH—乙醇溶液渦旋混合,暗處反應(yīng)30 min,利用紫外—可見光分光光度計測定517 nm處的吸光度。

1.2.3 氫過氧化物的檢測 將油樣于60 ℃加熱5 d,每24 h取樣一次。取40 mg樣品,加入5 mL正己烷,加入5 mL脂肪酶緩沖液(A液:取1.78 g磷酸氫二鈉溶于100 mL水,B液;取0.78 g磷酸二氫鈉溶于100 mL水;將100 mg脂肪酶溶于49 mL A液與51 mL B液的混合液體中),渦旋15 min,靜置后取上層清液,重復(fù)3次,合并有機(jī)相,氮?dú)獯蹈珊笥谜和槎ㄈ葜? mL,過0.45 μm微孔有機(jī)濾膜,待進(jìn)樣。

液相條件:色譜柱為Inertsil SIL 100A(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫40 ℃,檢測波長234 nm,等度洗脫,流速2 mL/min,流動相為正己烷∶異丙醇∶冰乙酸(V正己烷∶V異丙醇∶V冰乙酸為100∶1∶0.1);進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.4 誘導(dǎo)期測量 使用Rancimat 892油脂氧化穩(wěn)定儀測量誘導(dǎo)期(IP),取3.0 g油脂樣品于儀器專用測量管中,加入60 mL蒸餾水。儀器溫度為110 ℃,空氣流量為20 L/min。按式(1)、式(2)分別計算抗氧化保護(hù)系數(shù)和協(xié)同效應(yīng)。

PF=IP′/IPC,

(1)

SE=EE/(E1+E2),

(2)

式中:

PF——抗氧化保護(hù)系數(shù);

IP′——加入抗氧化劑的油脂氧化誘導(dǎo)時間,h;

IPC——未添加抗氧化劑的油脂氧化誘導(dǎo)時間,h;

SE——協(xié)同效應(yīng)(SE>1為協(xié)同作用,SE<1為拮抗作用[17]);

EE——組合抗氧化劑的試驗(yàn)值減去空白油樣的試驗(yàn)值,h;

E1、E2——單一抗氧化劑的試驗(yàn)值減去空白油樣的試驗(yàn)值,h。

1.2.5 抗氧化劑檢測

(1) 芝麻酚檢測:取2.0 g樣品和4 mL甲醇置于10 mL試管中,渦流混勻3 min,超聲15 min,4 ℃、5 000 r/min離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL試管中,萃取過程重復(fù)3次(每次3 mL甲醇),合并提取溶劑,氮?dú)獯蹈?復(fù)溶1 mL,并使用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾待進(jìn)樣。

色譜條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱;流動相為含5%乙酸乙酯的甲醇—水(V甲醇∶V水=7∶3);柱溫30 ℃;等度洗脫;流速0.8 mL/min;檢測波長298 nm;進(jìn)樣體積20 μL。

(2) 白藜蘆醇檢測:取2.0 g樣品和4 mL甲醇置于10 mL試管中,渦流混勻3 min,超聲15 min,4 ℃、5 000 r/min離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移到20 mL試管中,萃取過程重復(fù)3次(每次3 mL甲醇),合并提取溶劑,氮?dú)獯蹈?復(fù)溶1 mL,并使用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾待進(jìn)樣。

色譜條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流動相A為水;流動相B為甲醇。梯度洗脫程序:0～5 min,60% B;5～11 min,90% B;11～15 min,100% B。檢測波長306 nm;溫度35 ℃,流速1 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

1.2.6 量子化學(xué)計算 利用第一性原理的從頭計算方法,采用密度泛函理論(DFT)進(jìn)行計算。在B3LYP/6-311G(d,p)基礎(chǔ)上計算,利用過渡態(tài)(TST)理論公式進(jìn)行動力學(xué)常數(shù)計算。TST理論公式:

(3)

式中:

σ——反應(yīng)路徑簡并度,一般為1;

kB——玻爾茲曼常數(shù);

ΔG——標(biāo)準(zhǔn)態(tài)的活化能(過渡態(tài)與反應(yīng)物的能量差值);

T——反應(yīng)溫度,℃;

h——普朗克常量;

R——理想氣體常數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)為3次平行測量的平均值,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 2019軟件作圖, Gaussian09軟件進(jìn)行相關(guān)的量子計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 油脂高溫氧化下的自由基變化

由圖1可知,分別添加100 mg/kg白藜蘆醇和芝麻酚至葵花籽油中,氧化2 h時,抑制油脂氧化產(chǎn)生的自由基效果為白藜蘆醇>芝麻酚。相比于空白組,白藜蘆醇將自由基含量從0.21 mol/L下降到0.08 mol/L,減少了61.9%。加熱至3 h后,油樣中自由基含量趨于一致,且無顯著差異,與Lee等[18]的研究結(jié)果一致。所有樣品在氧化3 h后表現(xiàn)出相似的自由基含量,這與抗氧化劑的種類無關(guān),可能是由于加入抗氧化劑后油脂殘留的脂自由基所導(dǎo)致的。白藜蘆醇具有較強(qiáng)的清除自由基能力可能歸因于它不僅能起到供氫的作用,且在供氫后白藜蘆醇自由基能與脂肪酸自由基結(jié)合,影響其空間結(jié)構(gòu),增大了異構(gòu)化的能壘,從而防止異構(gòu)化的作用[19],進(jìn)而間接影響自由基含量。

圖1 白藜蘆醇與芝麻酚對自由基的抑制影響

2.2 氫過氧化物含量變化

根據(jù)已知的脂質(zhì)鏈?zhǔn)椒磻?yīng),油脂在形成烷基自由基后,易與三線態(tài)氧(3O2)反應(yīng),產(chǎn)生過氧自由基,過氧自由基通過抽氫形成氫過氧化物,通過對氫過氧化物的分析可知過氧自由基的變化。由圖2可知,60 ℃下,未添加酚類抗氧化劑的葵花籽油在加熱后的第4天氫過氧化物含量最高。添加100 mg/kg的白藜蘆醇和芝麻酚,其氫過氧化物含量分別從32 mg/g下降至16,5 mg/g。白藜蘆醇和芝麻酚均能抑制已鑒定的氫過氧化物的形成。根據(jù)已提出的自由基介導(dǎo)機(jī)制,可以推測自由基清除劑可能通過阻止氧化過程中的過氧自由基的形成來抑制氫過氧化物的形成。

圖2 60 ℃下氫過氧化物含量變化

2.3 油脂熱穩(wěn)定性分析

當(dāng)白藜蘆醇和芝麻酚添加量從100 mg/kg提高到2 000 mg/kg時,能夠顯著增加葵花籽油的氧化誘導(dǎo)時間,且二者添加量為1 400 mg/kg時,氧化誘導(dǎo)時間分別達(dá)(3.60±0.09),(8.32±0.48) h,相比于空白油樣分別延長了4.1,11.2倍,PF值最高。通過表1可知,白藜蘆醇和芝麻酚能起到協(xié)同作用的最佳添加量分別為1 400,200 mg/kg。與空白組相比,氧化誘導(dǎo)時間延長了9.18倍;與單獨(dú)添加芝麻酚相比,氧化誘導(dǎo)時間增加了3倍;與單獨(dú)添加白藜蘆醇相比,氧化誘導(dǎo)時間增加了1.89倍,說明二者按照一定配比添加到葵花籽油中,對亞油酸體系的氧化誘導(dǎo)時間的延長有更好的效果。

表1 白藜蘆醇與芝麻酚混合作用對葵花籽油氧化誘導(dǎo)時間的影響

2.4 組合抗氧化劑的降解

白藜蘆醇和芝麻酚于180 ℃下加熱7 h,其含量與降解速度變化分別如圖3、圖4所示。

圖3 白藜蘆醇和芝麻酚于180 ℃下的降解曲線

圖4 白藜蘆醇和芝麻酚于180 ℃下的降解速度變化曲線

由圖3可知,單獨(dú)添加,白藜蘆醇添加量隨加熱時間的延長呈下降趨勢,對比混合添加,白藜蘆醇添加量在加熱時間≤3 h時,其含量一直保持在相對穩(wěn)定的狀態(tài),3 h后其含量開始下降。由圖4可知,白藜蘆醇消耗速度最快的時間為2.5 h,混合添加時消耗速度最快的時間為4.5 h。與單獨(dú)添加相比,芝麻酚的加入延緩了白藜蘆醇的消耗,一方面是前期白藜蘆醇的消耗量較少,其消耗速度明顯減緩。由此推測:① 芝麻酚與白藜蘆醇同時存在時,芝麻酚先參與抗氧化;② 二者前期都有一定的消耗,但是前期白藜蘆醇失去一個H后,能夠接受芝麻酚提供的H,導(dǎo)致白藜蘆醇的降解速度變得緩慢。

單獨(dú)添加芝麻酚時,其在3 h內(nèi)消耗殆盡,且誘導(dǎo)期數(shù)據(jù)也表明添加200 mg/kg的芝麻酚可以在2.2 h內(nèi)保證油的穩(wěn)定性?；旌咸砑訒r,加熱時間為3 h時,芝麻酚的撥云見日一分?jǐn)?shù)為75 mg/kg,到加熱第7 h時,芝麻酚剩余10 mg/kg。白藜蘆醇的加入,能夠延長芝麻酚的保護(hù)時間,可能是因?yàn)榘邹继J醇能夠?qū)χヂ榉悠鸬皆偕饔谩?/p>

2.5 協(xié)同抗氧化機(jī)理分析

2.5.1 反應(yīng)活性位點(diǎn)的確定 量子化學(xué)分子軌道理論認(rèn)為,最高占據(jù)軌道(HOMO)和最低空軌道(LUMO)分布直觀地顯示了抗氧化劑的主要活性中心,這些參數(shù)可以直觀地表達(dá)抗自由基活性相關(guān)的重要參數(shù),HOMO的形狀決定了自由基攻擊的位置[20]。

由圖5可知,芝麻酚的HOMO定位于苯酚環(huán)和亞甲基二氧基位置,白藜蘆醇的HOMO定位于除間位的羥基以外的整個分子中。由圖6可知,羥基的鍵解離能相比于其他位置的碳?xì)滏I要低112.97～138.07 kJ/mol,因此二者的活性位點(diǎn)位于羥基基團(tuán)附近。在脂質(zhì)環(huán)境中,酚類抗氧化劑的羥基基團(tuán)在熱力學(xué)上優(yōu)先選擇H原子轉(zhuǎn)移機(jī)制[21],進(jìn)而阻止油脂氧化中的鏈傳播。所以這二者更是一種通過供H的方式來實(shí)現(xiàn)其動態(tài)平衡。

圖5 白藜蘆醇和芝麻酚的最高占據(jù)軌道

圖6 白藜蘆醇和芝麻酚的鍵解離能

2.5.2 白藜蘆醇與芝麻酚之間的H轉(zhuǎn)移 由圖7可知,白藜蘆醇向芝麻酚自由基供H的能壘為17.66 kJ/mol,芝麻酚向白藜蘆醇自由基供H的能壘為12.93 kJ/mol,這兩種反應(yīng)均可自發(fā)進(jìn)行,表明白藜蘆醇與芝麻酚之間存在一種反應(yīng)平衡。相比之下,自由基更容易奪取芝麻酚中的H。雖然芝麻酚的能壘比白藜蘆醇的低4.73 kJ/mol,但當(dāng)芝麻酚添加量較少時,白藜蘆醇才能與芝麻酚發(fā)生協(xié)同作用。當(dāng)芝麻酚添加量>400 mg/kg時,芝麻酚向白藜蘆醇自由基供H占據(jù)整個體系中的主導(dǎo)反應(yīng),所以二者發(fā)生拮抗作用,與表1結(jié)果一致。

圖7 白藜蘆醇和芝麻酚之間的反應(yīng)路徑

反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)是描述化學(xué)反應(yīng)速率的重要參數(shù)。利用TST理論公式對白藜蘆醇與芝麻酚之間的供H反應(yīng)分別進(jìn)行動力學(xué)常數(shù)計算,其中白藜蘆醇向芝麻酚自由基供H的反應(yīng)速率常數(shù)為8.682×1010mol/(L·s),芝麻酚供H給白藜蘆醇的反應(yīng)速率常數(shù)為3.040×1011mol/(L·s),芝麻酚供H給白藜蘆醇的速率更快,與二者混合添加時白藜蘆醇在前期的降解消耗較慢相對應(yīng)。隨著降解時間的延長,芝麻酚一方面保護(hù)葵花籽油,另一方面保護(hù)白藜蘆醇,導(dǎo)致其含量不斷下降,向白藜蘆醇供H反應(yīng)速率下降,打破了互相供H的局面,特別是加熱4.5 h時,白藜蘆醇的消耗速度最快,反應(yīng)后期更傾向于白藜蘆醇供H給芝麻酚自由基,導(dǎo)致芝麻酚再生。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明,白藜蘆醇和芝麻酚對葵花籽油中的總自由基和過氧自由基分別有最佳抑制效果。當(dāng)白藜蘆醇和芝麻酚添加量分別為1 400,200 mg/kg時具有最佳抗氧化性,誘導(dǎo)期達(dá)到(6.81±0.17) h,為空白組的9.2倍。反應(yīng)后期,反應(yīng)平衡更傾向于白藜蘆醇向芝麻酚自由基供氫,從而間接地保護(hù)了芝麻酚。后續(xù)可從抑制不同自由基的作用與抗氧化劑之間相互作用相結(jié)合進(jìn)一步闡明協(xié)同抗氧化性的研究機(jī)制。