耿俊豪 李雪芝 周建平 陳昌華

(新疆大學(xué)智能制造現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000)

有機磷農(nóng)藥在防治病蟲害方面可以發(fā)揮重要作用。甲基對硫磷(MP)作為一種典型的硝基芳香族有機磷農(nóng)藥,在使用過程中容易造成水、土壤和空氣污染,甚至破環(huán)人體內(nèi)乙酰膽堿酶(AChE),肌肉無法放松,導(dǎo)致呼吸困難甚至死亡[1-2]。

當前,用于檢測MP的技術(shù)有氣相色譜法[3]、高效液相色譜[4]、比色法[5]、熒光生物探針等多種方法[6]。盡管這些方法能夠提供高的靈敏度和選擇性來檢測農(nóng)藥殘留,但價格昂貴、操作繁瑣、耗時較長,無法滿足一些實際要求,特別無法用于現(xiàn)場檢測[7]。

基于AChE的MP電化學(xué)生物傳感器已被證明可以提高檢測效率,以簡單、快速、選擇性好、成本低、易于小型化等優(yōu)點在農(nóng)藥殘留檢測中受到了廣泛的關(guān)注[8]。在電化學(xué)分析中,常用的分立式三電極體系在檢測過程中盡管檢測體系各項參數(shù)良好,但靈活性較差,很難在現(xiàn)場對農(nóng)藥殘留進行分析檢測[9]。絲網(wǎng)印刷電極(SPCE)作為一款具有輕薄、便攜、集成化程度高等特點的電極,簡化了操作步驟,是一種可用于現(xiàn)場快速檢測的電化學(xué)感知器件[10-11]。

為了提高AChE電化學(xué)生物傳感器的性能,增加傳感材料的表面積和提高導(dǎo)電性能是實現(xiàn)快速響應(yīng)的關(guān)鍵。石墨烯基納米復(fù)合材料因其出色的比表面積、優(yōu)異的導(dǎo)電性以及出色的化學(xué)穩(wěn)定性而備受關(guān)注,是目前研究的重要焦點[12]。與氧化石墨烯(GO)相比,還原氧化石墨烯(rGO)的導(dǎo)電能力顯著提升,而且已被廣泛驗證[13]。電化學(xué)還原GO與傳統(tǒng)熱還原方法和化學(xué)還原方法相比,具有簡單、省時、綠色等優(yōu)點[14]。此外,rGO和金納米顆粒(AuNPS)的結(jié)合具有獨特的性質(zhì),可以作為電子傳導(dǎo)途徑,促進氧化還原體系和電極材料之間的電子轉(zhuǎn)移。如金納米顆粒具有很好的生物相容性和良好的導(dǎo)電性,強大的吸附能力,以及獨特的物理和化學(xué)屬性,由于這兩個組分之間的協(xié)同作用,將金負載到石墨烯或其衍生物上時,金的電催化活性進一步提高[15]。

研究通過層層組裝將rGO、AuNPS和AChE固定在電極表面,制備具有AChE/rGO/AuNPS/SPCE結(jié)構(gòu)的生物傳感器,對生物傳感器的電子傳輸特性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、催化活性和存儲穩(wěn)定性進行評價,優(yōu)化傳感器的催化時間,并進行真實樣本測試,完成對甲基對硫磷的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氧化石墨烯分散液:南京先鋒納米材料科技有限公司;

乙酰膽堿酯酶(來自電鰻,500 U)、乙酰硫代膽堿氯化物(ATCl)、戊二醛(GA,50%)、牛血清白蛋白(BSA):美國Sigma-Aldrich公司;

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、硫酸鉀、氯金酸:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

甲基對硫磷:北京百靈威科技有限公司;

絲網(wǎng)印刷電極:波探科技(威海)有限公司;

電化學(xué)工作站:DH7000C型,江蘇東華分析儀器有限公司;

場發(fā)射掃描電子顯微鏡:JSM-7610FPlus型,深圳市藍星宇電子科技有限公司;

X射線光電子能譜儀:ESCALAB 250Xi型,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 AChE/rGO/AuNPS/SPCE的制備

首先將絲網(wǎng)印刷電極在0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中施加范圍-0.6～+0.8 V的循環(huán)電位,掃速100 mV/s,進行電極激活,直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖。處理完用蒸餾水對電極表面進行沖洗。如圖1所示,取5 μL 0.5 mg/mL的GO分散液滴涂在電極表面,使其自然干燥,之后將其置于0.1 mol/L KCl溶液中CV還原,施加0～-1.8 V的電位以100 mV/s的速度掃描5圈,然后用蒸餾水沖洗,并在室溫下自然干燥。再通過CV法進行電沉積納米金,將樣品浸入含有0.01 mol/L K2SO4和0.001 mol/L HAuCl4的溶液中沉積10 min,最后,將10 μL的AChE(0.2 U/μL)和2.0%的BSA混合液滴涂于電極表面(記為AChE/AuNPS/rGO/SPCE),35 ℃干燥30 min,完成AChE/rGO/AuNPS/SPCE的構(gòu)建。

圖1 GO、rGO和rGO/AuNPS修飾的SPCE的SEM圖像

1.3 甲基對硫磷電化學(xué)檢測

AChE/rGO/AuNPS/SPCE先在1 mmol/L的ATCL中孵育5 min,再進行DPV表征。將傳感器浸泡在一定濃度的MP溶液中,抑制10 min,接著在1 mmol/L的ATCL中孵育5 min,最后進行DPV表征。按式(1)計算甲基對硫磷對傳感器的抑制率。

I=[(I0-Icat)/I0]×100%,

(1)

式中:

I——傳感器抑制率,%;

I0——傳感器在被抑制前催化1 mmol/L ATCl時的峰值電流,μA;

Icat——傳感器在被抑制后催化1 mmol/L ATCl時的峰值電流,μA。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析并繪圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 材料表征

通過SEM技術(shù),對GO、rGO、rGO/AuNPS改性SPCE的表面形貌特征進行了表征。從圖1(a)和圖1(b)可以清晰地觀察到電極表面上石墨薄膜獨有的褶皺紋理,這些褶皺提高了修飾電極的比表面積,為修飾金納米提供更多的活性位點[16]。此外,GO和rGO薄膜中C和O的存在也可以通過EDX圖像得到證實,如圖2(a)和圖2(b)所示。GO中O的信號從22.08%顯著降低到13.21%,說明GO成功還原為rGO。基于圖1(c),大量AuNPS密集且均勻分散在rGO膜表面。rGO/AuNPS納米復(fù)合材料的EDX光譜也顯示了C、O和Au信號的存在,如圖2(c),包括83.36%的C元素、2.58%的O元素和14.06%的Au元素。這些結(jié)果清楚地證實了rGO/AuNPS納米復(fù)合材料在SPCE上的形成[17]。為了進一步驗證復(fù)合納米材料成功修飾在電極表面,使用X射線光電子能譜儀測試電極表面的化學(xué)元素組成和價態(tài)分布,并對能譜進行分析如圖3所示。圖3(a)中出現(xiàn)了C1s、O1s和Au 4f的峰,并分別對其進行了擬合。圖3(b)和圖3(c)在284.8,532.4 eV處分別為O1s和C1s的特征峰,圖3(d)為Au 4f的特征峰,其在84.3,88.0 eV處出現(xiàn)兩個特征峰,分別歸屬于Au 4f7/2和Au 4f5/2,表明Au元素被有效修飾在電極表面。

圖2 GO、rGO和rGO/AuNPS修飾的SPCE的EDX圖像

圖3 rGO/AuNPS的XPS能譜圖及組成元素的XPS譜圖

2.2 生物傳感器的催化活性

生物傳感器的催化活性是傳感器最重要的性能參數(shù)之一。米氏常數(shù)(Km)可以用來衡量酶的親和力,其值越小,表明酶的親和力越強。米氏常數(shù)可以通過Lineweaver Burk方程計算:

(2)

式中:

Icat——添加ATCl時的電流值,μA;

Imax——ATCl飽和狀態(tài)下的最大電流值,μA;

C——ATCl濃度,mmol/L;

Km——米氏常數(shù),mmol/L。

圖4 AChE/AuNPS/rGO/SPCE電極對不同濃度ATCl的DPV響應(yīng)

圖5 峰值電流的倒數(shù)與乙酰硫代膽堿氯化物濃度的倒數(shù)的校準曲線

2.3 電化學(xué)表征

圖6(a)描述了在5 mmol/L Fe3(CN)6/0.1 mol/L KCl溶液中不同修飾電極的CV圖,掃描速度為0.1 V/s,電位范圍為-0.6～0.8 V。在未修飾任何材料前,SPCE具有明確的可逆電化學(xué)響應(yīng)。經(jīng)過GO修飾,峰值電流顯著下降,主要歸因于GO的導(dǎo)電性較差。此外,與裸電極和GO修飾電極相比,還原后的rGO修飾的SPCE具有很好的導(dǎo)電性,表明rGO的優(yōu)異導(dǎo)電性和大表面積有助于加快整個電化學(xué)過程[20]。

a. SPCE b. GO/SPCE c. rGO/SPCE d. AuNPS/rGO/SPCE e. AChE/AuNPS/rGO/SPCE

在沉積AuNPS后形成rGO/AuNPS復(fù)合材料,AuNPS充當電子轉(zhuǎn)移通道,進一步提高rGO膜的導(dǎo)電性,改性層和電解質(zhì)(離子)之間的電荷轉(zhuǎn)移過程加快并更有效地發(fā)生。根據(jù)Randles-Sevcik方程測定了修飾rGO/AuNPS電極的電活性表面積,并與SPCE的電活性表面積進行了比較。

Ip=(2.69×105)n3/2ACD1/2v1/2,

(3)

式中:

Ip——循環(huán)伏安響應(yīng)的峰值電流,μA;

n——氧化還原反應(yīng)中的電子轉(zhuǎn)移數(shù);

A——電極表面積,cm2;

C——氧化還原指示劑Fe3(CN)6的濃度,mol/L;

D——擴散系數(shù),cm2/s;

v——掃描速率,V/s。

2.4 優(yōu)化設(shè)計

從圖7(a)可以看出,響應(yīng)電流的最大值在pH 7.5時,電解液過酸或過堿都會影響所固定的AChE的生物活性。因此,在隨后的試驗中選用pH 7.5的PBS。從圖7(b)可以看出,隨著AChE酶修飾量的增加,峰值電流會先上升后下降,可能是由于AChE的過厚導(dǎo)致其電阻增大。因此,選擇10 μL AChE作為最佳修飾量。從圖7(c)可以看出,AChE的最適溫度為35 ℃,溫度超過35 ℃其峰值電流出現(xiàn)下降,可能是溫度過高對酶活性造成了影響。從圖7(d)可以看出,酶的修飾時間對其影響較小,最終選擇30 min作為AChE的修飾時間。從圖7(e)可以看出,當?shù)孜餄舛葹?.0 mmol/L時,MP對AChE的抑制率達到最大,當ATCl濃度>1.0 mmol/L 時,抑制率呈下降趨勢。這是因為ATCl濃度的增加導(dǎo)致酶活性中心逐漸被底物占據(jù),在此過程中,酶分子上積累了過多的底物,產(chǎn)生了膽堿、乙酸等非活性中間體,這些不活躍的中間產(chǎn)物影響了電流反饋。因此,后續(xù)試驗選擇1.0 mmol/L作為底物濃度。另外,抑制時間對抑制率也有一定的影響,如圖7(f)所示,AChE/AuNPS/rGO/SPCE在50 ng/mL的MP溶液中浸泡不同時間。結(jié)果表明,MP對AChE的抑制率隨抑制時間的延長而增加,當抑制時間超過10 min時,曲線趨于平穩(wěn),表明農(nóng)藥與酶的結(jié)合達到了平衡。因此,選擇浸泡時間為10 min。

圖7 pH值、AChE修飾量、底物濃度和抑制時間優(yōu)化圖

2.5 農(nóng)藥含量檢測

圖8(a)顯示在最優(yōu)底物濃度的情況下進行DPV測試,隨著不斷加大農(nóng)藥質(zhì)量濃度,傳感器催化活性降低。由圖8(b)可以看出,隨著農(nóng)藥質(zhì)量濃度的增加,抑制率呈線性變化。顯示了兩個線性范圍:1～50 ng/mL的抑制率方程分別為I=0.513 8CMP+10.298(R2=0.981),50～500 ng/mL 的抑制率方程為I=0.066 5CMP+34.561(R2=0.987)。該傳感器的檢出限為0.692 ng/mL(使用3σ/N規(guī)則計算)。表1總結(jié)了不同修飾電極材料對于MP的電化學(xué)檢測。

表1 與常見修飾電極的比較

圖8 AChE/AuNPS/rGO/SPCE在不同濃度甲基對硫磷抑制10 min后在1 mmol/L ATCl中的差分脈沖伏安響應(yīng)曲線和抑制率與甲基對硫磷質(zhì)量濃度之間的關(guān)系

2.6 干擾研究

為評估AChE/AuNPS/rGO/SPCE的選擇性,將0.1 mol/L NaCl、KCl和K2SO4、0.1 mmol/L PBS、1 mg/mL葡萄糖(Glucose)分別加入到質(zhì)量濃度為50 ng/mL的MP中。如圖9所示,添加干擾后MP溶液的電流響應(yīng)無明顯變化,表明制備的傳感器在受到干擾時仍具有令人滿意的選擇性。

圖9 不同物質(zhì)對MP安培響應(yīng)的干擾

2.7 實際樣品檢測

通過向生菜和蘋果樣品中添加一定量的MP來進行回收試驗。樣品是從附近菜市場購買,用破壁機榨汁,并用PBS稀釋10倍。將MP添加到稀釋的果汁樣品中以制備所需濃度MP測試溶液。收集其上清液進行電化學(xué)分析。計算其回收率,結(jié)果見表2。由表2可知,MP在樣品中的回收率為93.6%～101.6%,相對標準偏差(RSD)為1.84%～6.12%,與氣相色譜法的檢測結(jié)果基本一致。

表2 樣品中甲基對硫磷的檢測

結(jié)果表明,該生物傳感器可以非常準確地檢測甲基對硫磷。

2.8 重現(xiàn)性、重復(fù)性、儲存穩(wěn)定性

選取5個酶電極,在最優(yōu)試驗條件下,研究了酶電極的重現(xiàn)性、重復(fù)性與儲存穩(wěn)定性,記錄其對1 mmol/L底物的DPV響應(yīng)電流,其相對標準偏差范圍為3.10%～5.60%。單個電極連續(xù)5次在1 mmol/L底物溶液中測定的標準偏差為4.30%。隨后用PBS沖洗后儲存在4 ℃的冰箱中,干燥密封。測量結(jié)果為在7 d后保持初始狀態(tài)95%以上,在30 d后仍保留了其初始電流響應(yīng)的80%。結(jié)果表明,相比于傳統(tǒng)的三電極,該絲網(wǎng)印刷電極依然具有不錯的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

該傳感器將還原氧化石墨烯、金納米顆粒和乙酰膽堿酶采用逐層組裝的方法修飾在絲網(wǎng)印刷電極表面,制備了乙酰膽堿酶/金納米顆粒/還原氧化石墨烯/絲網(wǎng)印刷電極電化學(xué)生物傳感器用于檢測甲基對硫磷。結(jié)果表明,甲基對硫磷的線性范圍為5～500 ng/mL,檢出限為0.692 ng/mL,具有低成本和良好的選擇性與穩(wěn)定性。