付佳樂(lè),耿 直,郭亞敏,陽(yáng)京津

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院,陜西 西安 712046)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬植物,含有豐富的黃酮類(lèi)、萜內(nèi)酯類(lèi)、多糖類(lèi)等活性成分,具有抗菌、消炎等功效,是生產(chǎn)生物農(nóng)藥的良好原料,可用于食品、醫(yī)藥、生物農(nóng)藥等領(lǐng)域。近年來(lái),醫(yī)學(xué)研究證明,銀杏中的有效成分達(dá)200余種,其中具有藥用價(jià)值且可提取成分達(dá)160余種[1-3]。

活性成分的提取常采用乙醇提取法,該方法雖操作簡(jiǎn)單,但乙醇具有揮發(fā)性會(huì)危害人體健康,安全性較低,且需多次提取,操作繁瑣。隨著綠色化學(xué)的興起和發(fā)展,低共熔溶劑(deep eutectic solvents,DESs)為活性成分的提取提供了新思路。該溶劑是由Abbott等提出并合成[4],具有成本低、操作簡(jiǎn)單、可降解、綠色安全等優(yōu)勢(shì),引起了研究者的廣泛重視[5-9]。

在此,作者采用DESs對(duì)銀杏葉總黃酮進(jìn)行提取,采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),以期為銀杏葉資源的開(kāi)發(fā)利用提供借鑒,同時(shí)為其它植物中黃酮成分的提取提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

銀杏葉(綠色未黃),采自陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院校園內(nèi),洗凈,晾干,烘干,粉碎,過(guò)80目篩。

蘆丁對(duì)照品(≥98%,批號(hào)YO6J8S37439)、氯化膽堿等。

TU-80型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器公司;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器,上海力辰邦西儀器科技有限公司;tdl-40b型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 DESs的制備

參照文獻(xiàn)[6-9],選擇氯化膽堿作為氫鍵受體(HBA)、多元醇或酸作為氫鍵供體(HBD),如尿素、葡萄糖、檸檬酸、甘油、乳酸、草酸、丙二醇,按一定的物質(zhì)的量比將HBA、HBD置于70 ℃磁力攪拌器中,攪拌至液體均相、無(wú)色透明,即得DESs。

1.3 銀杏葉總黃酮的提取

精密稱(chēng)取0.3 g銀杏葉粉末,加入一定體積的DESs,一定溫度下磁力攪拌一定時(shí)間后,5 000 r·min-1離心30 min,傾出上清液,加入同種類(lèi)的DESs定容至一定體積,即得銀杏葉總黃酮提取液。

1.4 銀杏葉總黃酮提取率的測(cè)定

制備22.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,參照文獻(xiàn)[6]方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),擬合得線(xiàn)性回歸方程：y=8.69369x+0.0238(R2=0.99728)。精密移取一定量銀杏葉總黃酮提取液置于25 mL容量瓶中,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定總黃酮含量,按下式計(jì)算總黃酮提取率(%)：

式中：c為樣品中總黃酮含量,mg·mL-1;V為樣品溶液體積,mL;m為銀杏葉粉末質(zhì)量,g。

1.5 銀杏葉總黃酮提取工藝的優(yōu)化

參考文獻(xiàn)[6-9]方法,首先篩選DESs種類(lèi)(氯化膽堿-尿素、氯化膽堿-葡萄糖、氯化膽堿-檸檬酸、氯化膽堿-甘油、氯化膽堿-乳酸、氯化膽堿-草酸、氯化膽堿-丙二醇),在確定DESs種類(lèi)的基礎(chǔ)上,考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1,mL∶g,下同)、提取溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、n(氯化膽堿)∶n(尿素)(4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)、DESs含水量(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)、提取時(shí)間(15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min)對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇對(duì)銀杏葉總黃酮提取率影響較顯著的液料比(A)、提取溫度(B)、n(氯化膽堿)∶n(尿素)(C)為考察因素,以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,進(jìn)一步優(yōu)化銀杏葉總黃酮的提取工藝。

1.6 銀杏葉總黃酮的抗氧化活性研究

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Design Expert 13軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)和分析。采用Origin 2021對(duì)單因素和抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 DESs種類(lèi)對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖1)

圖1 DESs種類(lèi)對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of DESs type on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖1可知,以氯化膽堿-尿素為DESs時(shí),銀杏葉總黃酮提取率最高,為1.04%。分析發(fā)現(xiàn),氯化膽堿是一種有序的陰陽(yáng)離子,與2個(gè)中性尿素分子發(fā)生氫鍵反應(yīng)后,氯化膽堿陰陽(yáng)離子間的相互作用減小、有序結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂,從而有利于對(duì)總黃酮的提取;此外,氯化膽堿-尿素組成的DESs體系黏度小、流動(dòng)性好,有利于總黃酮的傳遞和提取。因此,選擇氯化膽堿-尿素為DESs進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.2 液料比對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 液料比對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖2可知,當(dāng)液料比為30∶1時(shí),銀杏葉總黃酮提取率最高,為1.19%。這是因?yàn)?DESs用量增加,增大了溶劑與銀杏葉粉末的接觸面積,加速了溶劑與提取物間傳質(zhì)過(guò)程,細(xì)胞內(nèi)外濃度差增大,有利于總黃酮的溶出;但是當(dāng)液料比達(dá)到30∶1后,提取過(guò)程趨于飽和,總黃酮成分幾乎被完全提取,繼續(xù)增加DESs用量,提取率不再升高。因此,選擇30∶1作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)液料比的中心點(diǎn)。

2.1.3 提取溫度對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 提取溫度對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖3可知,當(dāng)提取溫度(20 ℃)接近常溫時(shí),銀杏葉總黃酮提取率較低,可能與DESs在常溫下具有較高的黏度有關(guān);隨著提取溫度升高,DESs的黏度降低,流動(dòng)性顯著增強(qiáng),擴(kuò)散速度加快,細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換能力提高,目標(biāo)成分的溶解度增大亦有利于其滲透溶解在溶劑中,當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí),總黃酮提取率為0.917%;當(dāng)提取溫度升至70 ℃時(shí),總黃酮提取率最高,為0.978%;繼續(xù)升高提取溫度,總黃酮提取率下降,這是因?yàn)?提取溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致分子運(yùn)動(dòng)速度過(guò)快,DESs分子間氫鍵穩(wěn)定性降低,溶液極性下降,導(dǎo)致總黃酮提取率下降。由于提取溫度為50 ℃、70 ℃時(shí),總黃酮提取率相差不大,總黃酮提取率在50～70 ℃范圍內(nèi)的變化機(jī)制尚不清楚,綜合考慮能耗、成本等因素,選擇60 ℃作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)提取溫度的中心點(diǎn)。

2.1.4n(氯化膽堿)∶n(尿素)對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖4)

圖4 n(氯化膽堿)∶n(尿素)對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of n(choline chloride)∶n(urea) on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖4可知,當(dāng)n(氯化膽堿)∶n(尿素)為1∶2時(shí),銀杏葉總黃酮提取率最高,為1.16%。可能是因?yàn)?n(氯化膽堿)∶n(尿素)不同,制備的DESs的黏度不同,溶劑所產(chǎn)生的氫鍵數(shù)目、位置也有所不同,與銀杏葉總黃酮成分的結(jié)合程度不同。因此,選擇1∶2作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)n(氯化膽堿)∶n(尿素)的中心點(diǎn)。

2.1.5 DESs含水量對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖5)

圖5 DESs含水量對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of water content of DESs on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖5可知,當(dāng)DESs含水量為40%時(shí),銀杏葉總黃酮提取率最高,為0.8%;繼續(xù)增加DESs含水量,總黃酮提取率下降。這是由于,DESs黏度高,傳質(zhì)過(guò)程較慢,隨著含水量增加,DESs黏度降低,溶劑移動(dòng)速度加快,從而加速了植物細(xì)胞內(nèi)外溶劑的滲透過(guò)程;此外,含水量增加會(huì)改變?nèi)軇O性,溶劑極性與目標(biāo)成分總黃酮極性不吻合會(huì)影響總黃酮提取率;但含水量過(guò)多也可能沖斷DESs體系中HBA與HBD之間形成的氫鍵。因此,選擇DESs含水量為40%。

2.1.6 提取時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖6)

圖6 提取時(shí)間對(duì)銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖6可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),銀杏葉總黃酮提取率逐漸升高,當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí),總黃酮提取率最高,達(dá)到1.16%;繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,總黃酮提取率下降,可能是由于,提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),黃酮成分發(fā)生分解,不利于提取。因此,選擇提取時(shí)間為60 min。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1,設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)Design Expert 13軟件進(jìn)行多元擬合,得到回歸方程：Y=1.16-0.058A+0.1008B+0.0268C-0.1903AB-0.0443AC+0.0262BC-0.2702A2-0.1187B2-0.1497C2。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析

2.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)銀杏葉總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖7。

圖7 各因素交互作用對(duì)銀杏葉總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.7 Response surface plots and contour plots for effect of interation between variour factors on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖7可知,隨著提取溫度的升高,銀杏葉總黃酮提取率升高;隨著液料比的增大,總黃酮提取率先升高后降低。相較于液料比、n(氯化膽堿)∶n(尿素),提取溫度的響應(yīng)曲面更為陡峭,等高線(xiàn)具有明顯的密集趨勢(shì),說(shuō)明提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響更為顯著。此外,液料比與提取溫度的交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響顯著。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用擬合模型對(duì)銀杏葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)提取工藝為：液料比29.355∶1、提取溫度57.399 ℃、n(氯化膽堿)∶n(尿素)為1∶1.603、DESs含水量40%、提取時(shí)間60 min,銀杏葉總黃酮提取率的預(yù)測(cè)值為1.089%?？紤]到實(shí)際操作,最優(yōu)提取工藝調(diào)整為：液料比30∶1、提取溫度57 ℃、n(氯化膽堿)∶n(尿素)為1∶1.6、DESs含水量40%、提取時(shí)間60 min,在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到銀杏葉總黃酮提取率為1.062%,高于李新舟等[15]采用乙醇回流法(0.918%)和微波輔助法(0.910%)得到的銀杏葉總黃酮提取率。

2.5 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)

表4 銀杏葉總黃酮的抗氧化活性

3 結(jié)論