李 凱, 王 倩, 段培培, 卞 華,3

(1.南陽理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 南陽 473004;2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院 河南 南陽 473004;3.河南中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院 河南 鄭州 450046)

0 引言

系統(tǒng)性硬化病(Systemic sclerosis, SSc)是一種以血管損傷、免疫紊亂、皮膚和/或內(nèi)臟進(jìn)行性纖維化為特征的自身免疫性疾病[1]。在SSc各種損傷的靶器官中,皮膚和肺部受累最常見,尤其是肺血管損傷和肺纖維化是影響SSc進(jìn)展和預(yù)后的主要原因。超過70%的SSc患者伴隨肺部病變,主要包括間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease, ILD)和肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension, PH),這兩種肺部病變占SSc相關(guān)死亡的60%[2]。目前認(rèn)為SSc相關(guān)肺部病變是以微血管損傷和肺泡炎癥等早期病理改變?yōu)槭紕?dòng)因素,其中微血管損傷誘導(dǎo)的炎癥和自身免疫反應(yīng)直接或間接刺激成纖維細(xì)胞的活化,導(dǎo)致纖維化發(fā)生[3]。研究證實(shí)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制主要與EndoMT、缺氧、自噬過度及炎癥等相關(guān)[4]。

目前,SSc的整體治療原則仍以抗炎、免疫調(diào)節(jié)、改善血液循環(huán)及抑制纖維化為主,比如抗TGF-β抗體CAT-192、抗CD-20抗體利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、D-青霉胺等[5]。但是,臨床數(shù)據(jù)顯示這些藥物的副作用以及長期治療效果均難以令人滿意。目前尚無有效的治療手段從保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞并改善肺功能角度來防治SSc,因此,致力于相關(guān)SSc新藥開發(fā)是解決目前SSc治療困局的最佳途徑。本課題組既往系列研究表明,溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc療效顯著,其作用機(jī)制主要為抗纖維化,調(diào)節(jié)免疫失衡和保護(hù)血管。研究發(fā)現(xiàn),溫陽化濁通絡(luò)方能夠降低SSc模型小鼠和SSc患者血清VEGF、CTGF、ET-1和vWF的表達(dá)水平[6-7],同時(shí)減少SSc患者血液中的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)[8],表明溫陽化濁通絡(luò)方對SSc患者的血管具有保護(hù)作用,并改善SSc血管病變。但是,溫陽化濁通絡(luò)方改善SSc血管病變的作用機(jī)制尚不清楚。因此,本研究旨在探討溫陽化濁通絡(luò)方通過抑制HIF-1α/Foxm1/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的EndoMT來改善肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物準(zhǔn)備

溫陽化濁通絡(luò)方的藥物組成為黃芪、黨參、山藥、淫羊藿、熟地、桂枝、積雪草、白芥子、槌果藤、絲瓜絡(luò),這些中藥均從河南省張仲景大藥房購買,湯劑制作方法參考我們之前的論文[9]。HIF-1α抑制劑KC7F2(濃度為10 mmol/L,HY-18777,MCE公司)。

1.2 主要試劑與儀器

Masson三色染色試劑盒(G1340,北京索萊寶科技有限公司),免疫組化試劑盒(D601037-0050,上海生工生物工程有限公司),HIF-1α抗體(AF1009,江蘇親科生物研究中心有限公司),Foxm1抗體(AF7860,江蘇親科生物研究中心有限公司),smad3抗體(AF6362,江蘇親科生物研究中心有限公司),VE-Cadherin(AF6265,江蘇親科生物研究中心有限公司),vimentin(AF7013,江蘇親科生物研究中心有限公司)。

1.3 博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型的構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組

6～8周齡,體重20 g左右的雄性 C57/BL6N小鼠(浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)被用來構(gòu)建博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型。小鼠隨機(jī)分為7組,每組6只。一組小鼠不接受任何處理,標(biāo)記為對照組。一組小鼠皮下注射100 μL PBS溶液,標(biāo)記為PBS組。另外5組利用博來霉素構(gòu)建SSc小鼠模型,被標(biāo)記為模型組,動(dòng)物模型構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)方案參照我們之前的研究[10],針對動(dòng)物模型的藥物處理方案如下。在SSc小鼠模型構(gòu)建基礎(chǔ)上,藥物處理方案為:對照組小鼠、PBS組小鼠和模型組小鼠每天接受生理鹽水灌胃處理(1 mL/day),WYHZTL-L+模型組小鼠接受低劑量溫陽化濁通絡(luò)方灌胃處理(藥物劑量為11.75 g/kg/day),WYHZTL-M+模型組小鼠接受中劑量溫陽化濁通絡(luò)方灌胃處理(藥物劑量為23.5 g/kg/day),WYHZTL-H+模型組小鼠接受高劑量溫陽化濁通絡(luò)方灌胃處理(藥物劑量為47 g/kg/day),KC7F2+模型組小鼠接受KC7L2腹膜下注射處理(KC7L2溶解于PBS溶液,劑量為10 mg/kg)。所有的藥物治療持續(xù)4周,然后用氯胺酮(150 mg/kg)和乙酰丙嗪(15 mg/kg)的混合物腹膜內(nèi)注射來麻醉并處死小鼠。肺組織立即放入福爾馬林溶液中固定。PBS組被用來作為博來霉素的陰性對照。本研究的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作步驟均被南陽理工學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 Masson染色和免疫組化染色

將小鼠肺組織固定并用石蠟包埋制作成組織蠟塊,用切片機(jī)將蠟塊切成4～5 μm厚度的病理切片。對于masson染色步驟,按照試劑盒說明書操作,切片常規(guī)脫蠟脫水后用weigert鐵蘇木素染色液染色,酸性乙醇分化液分化,masson藍(lán)化液返藍(lán),麗春紅品紅染色液染色,磷鉬酸溶液洗滌,苯胺藍(lán)染色液染色,95%乙醇脫水,無水乙醇脫水,二甲苯透明,最后中性樹膠封片。Masson染色后肌纖維呈紅色,膠原纖維呈綠色或藍(lán)色,主要用于區(qū)分膠原纖維和肌纖維。對于免疫組化染色步驟,按照試劑盒說明書操作,切片60 ℃烤片,二甲苯脫蠟,分別用無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇浸泡水化,枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行抗原修復(fù),酶滅活,BSA封閉,加不同一抗置于4 ℃濕盒中孵育過夜,洗滌后滴加HRP標(biāo)記的二抗,用DAB法顯色,并用蘇木素復(fù)染,脫色返藍(lán)后用中性樹脂封片。利用imageJ軟件中的IHC插件進(jìn)行免疫組化結(jié)果的定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 溫陽化濁通絡(luò)方的治療作用

利用博來霉素誘導(dǎo)構(gòu)建SSc小鼠模型,通過masson染色檢測小鼠肺組織的纖維化程度,由圖1可知,相對于對照組和PBS組,模型組小鼠的肺組織以及肺血管的膠原纖維染色明顯增強(qiáng),表明模型組小鼠的肺組織發(fā)生了明顯的纖維化,證明了博來霉素誘導(dǎo)構(gòu)建SSc小鼠模型構(gòu)建成功。另外,在模型小鼠中分別施加溫陽化濁通絡(luò)方和KC7F2(HIF-1α抑制劑)處理,觀察不同劑量的溫陽化濁通絡(luò)方和KC7F2對肺纖維化的治療效果,masson染色結(jié)果顯示,相對于模型組,低、中、高劑量的溫陽化濁通絡(luò)方(WYHZTL-L+模型組、WYHZTL-M+模型組、WYHZTL-H+模型組)和KC7F2(KC7F2+模型組)治療后,小鼠肺組織和肺血管組織的膠原纖維染色強(qiáng)度顯著降低,表明溫陽化濁通絡(luò)方和KC7F2能夠顯著抑制博來霉素誘導(dǎo)構(gòu)建SSc小鼠肺纖維化。另外,相對于WYHZTL-L+模型組和WYHZTL-M+模型組,KC7F2+模型組和WYHZTL-H+模型組的小鼠肺組織和肺血管組織的膠原纖維染色強(qiáng)度顯著降低,表明溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc肺纖維化具有劑量依賴性。

圖1 在博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型中觀察溫陽化濁通絡(luò)方對肺纖維化的治療作用注:WYHZTL-L為低劑量的溫陽化濁通絡(luò)方,WYHZTL-M為中劑量的溫陽化濁通絡(luò)方,WYHZTL-H為高劑量的溫陽化濁通絡(luò)方,KC7F2為HIF-1α抑制劑。

2.2 溫陽化濁通絡(luò)方的調(diào)控作用

在博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型中,通過免疫組化檢測了小鼠肺組織中的HIF-1α/Foxm1/smad3信號(hào)通路,以及EndoMT標(biāo)志物VE-cadherin和vimentin的蛋白表達(dá)水平。由圖2可知,相對于對照組和PBS組,模型組小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中的HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin的蛋白表達(dá)水平顯著增高,而VE-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低。相對于模型組,經(jīng)過溫陽化濁通絡(luò)方或KC7F2的治療后,小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中的HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin的蛋白表達(dá)水平顯著降低,而VE-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著提高。另外,相對于低劑量的溫陽化濁通絡(luò)方(WYHZTL-L+模型組),中、高劑量的溫陽化濁通絡(luò)方(WYHZTL-M+模型組、WYHZTL-H+模型組)對HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin和VE-cadherin的蛋白表達(dá)水平具有更加顯著的調(diào)控作用。而中、高劑量的溫陽化濁通絡(luò)方對于HIF-1α、Foxm1、smad3和VE-cadherin的調(diào)控作用無顯著性差異。但是,相對于中劑量的溫陽化濁通絡(luò)方(WYHZTL-L+模型組),高劑量的溫陽化濁通絡(luò)方(WYHZTL-H+模型組)對于vimentin的抑制作用更加明顯。另外,結(jié)果顯示KC7F2(KC7F2+模型組)對于HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin和VE-cadherin的調(diào)控作用與高劑量的溫陽化濁通絡(luò)方(WYHZTL-H+模型組)無顯著性差異,但是優(yōu)于低、中劑量的溫陽化濁通絡(luò)方(WYHZTL-L+模型組、WYHZTL-M+模型組)。這些結(jié)果表明,溫陽化濁通絡(luò)方和KC7F2能夠通過抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信號(hào)通路介導(dǎo)的EndoMT,改善SSc肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,而且溫陽化濁通絡(luò)方的這種效應(yīng)存在劑量依賴性。

圖2 在博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型中觀察溫陽化濁通絡(luò)方對HIF-1α/Foxm1/Smad3信號(hào)通路和EndoMT標(biāo)志物的調(diào)控作用注:A:各組小鼠肺組織的免疫組化結(jié)果;B-F:不同蛋白的免疫組化結(jié)果的定量分析。WYHZTL-L為低劑量的溫陽化濁通絡(luò)方,WYHZTL-M為中劑量的溫陽化濁通絡(luò)方,WYHZTL-H為高劑量的溫陽化濁通絡(luò)方,KC7F2為HIF-1α抑制劑。ns表示沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。

3 討論

EndoMT指內(nèi)皮細(xì)胞在受到刺激后獲得間充質(zhì)細(xì)胞樣表型。在EndoMT過程中,由于駐留的內(nèi)皮細(xì)胞從血管壁的組織細(xì)胞層分離并侵入周圍組織,將導(dǎo)致血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的破壞,造成血管損傷[11-12]。SSc的早期特征是內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,以及內(nèi)膜的增生和血管腔的最終閉塞。毛細(xì)血管血流量減少加上血管生成不足會(huì)導(dǎo)致慢性缺氧和組織缺血,從而形成正反饋回路,維持血管重塑,而細(xì)胞外基質(zhì)積聚導(dǎo)致纖維化進(jìn)一步加劇了這種情況[13]。因此,抑制EndoMT進(jìn)而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,可能是治療SSc的有效途徑之一。在本研究中,首先我們在博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型中發(fā)現(xiàn)EndoMT標(biāo)志物VE-cadherin和vimentin表達(dá)水平的失調(diào),證實(shí)了SSc肺血管內(nèi)皮細(xì)胞確實(shí)存在EndoMT的現(xiàn)象。

研究發(fā)現(xiàn),SSc患者的血氧分壓較健康對照顯著降低,提示SSc發(fā)病過程中一直伴隨長期慢性缺氧的癥狀。缺氧是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT的有效刺激,HIF-1α能夠誘導(dǎo)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT,進(jìn)而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[14]。同時(shí),Lavigne等[15]發(fā)現(xiàn)HIF-1α通過促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT導(dǎo)致放射線誘發(fā)的肺纖維化的發(fā)生。這些結(jié)果表明,缺氧誘導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT可能與HIF-1α有關(guān)。在本研究中,我們的結(jié)果證實(shí)了博來霉素誘導(dǎo)的SSc小鼠模型中HIF-1α表達(dá)水平上調(diào),并且HIF-1α抑制劑KC7F2能夠抑制SSc肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT,表明SSc發(fā)生發(fā)展過程中HIF-1α能夠促進(jìn)EndoMT的發(fā)生。

在SSc發(fā)生發(fā)展過程中,缺氧促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT的分子機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)用TGF-β和內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)處理的正常成纖維細(xì)胞也能夠促進(jìn)相同內(nèi)皮細(xì)胞的EndoMT[16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,TGF-β的激活能夠促進(jìn)Foxm1介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT,其分子機(jī)制為Foxm1與Smad蛋白相互作用,上調(diào)促EndoMT因子(如Snail、Slug、Twist和Zeb等)的表達(dá)[17-18]。Huang等[18]發(fā)現(xiàn)Foxm1基因啟動(dòng)子區(qū)含有低氧反應(yīng)元件(HRE),HIF-1α能夠特異性地與Foxm1基因啟動(dòng)子HRE結(jié)合,促進(jìn)Foxm1的表達(dá)水平。因此,HIF-1α/Foxm1/Smad3信號(hào)通路可能是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT的分子機(jī)制之一。在SSc小鼠模型中,我們發(fā)現(xiàn)缺氧確實(shí)能夠激活HIF-1α/Foxm1/Smad3信號(hào)通路和內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT,而抑制HIF-1α能夠逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)。我們的研究證實(shí)了低氧環(huán)境下,HIF-1α/Foxm1/Sma3d信號(hào)通路的過度激活能夠促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT,這是導(dǎo)致SSc肺血管損傷的重要機(jī)制之一。更重要的是,在SSc小鼠模型中,我們證實(shí)了溫陽化濁通絡(luò)方具有類似于HIF-1α抑制劑的效應(yīng),能夠抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信號(hào)通路介導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT。

綜上,在本研究中,我們首先證實(shí)了SSc發(fā)生發(fā)展過程中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT的存在。進(jìn)一步地,我們闡釋了低氧環(huán)境下,HIF-1α/Foxm1/Smad3信號(hào)通路的過度激活能夠促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT,這是導(dǎo)致SSc肺血管損傷的重要機(jī)制之一。最后,我們發(fā)現(xiàn)溫陽化濁通絡(luò)方能夠抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信號(hào)通路介導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT,這可能是溫陽化濁通絡(luò)方保護(hù)肺血管治療SSc的作用機(jī)制之一。