向丹華,李沛祺,王佳寶,陳雙,徐巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇 無(wú)錫,214122)

醬香型作為我國(guó)白酒的典型香型,其釀造工藝歷經(jīng)“八次發(fā)酵”、“九次蒸煮”、“七次取酒”,生產(chǎn)過(guò)程具有“四高兩長(zhǎng)”(“高溫制曲”、“高溫堆積”、“高溫餾酒”、“生產(chǎn)周期長(zhǎng)”、“陳釀貯存時(shí)間長(zhǎng)”)的典型特征,形成了具有“醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體綿柔、回味悠長(zhǎng)、空杯留香”的獨(dú)特風(fēng)味特點(diǎn)[1]。目前研究表明醬香型白酒香氣組分種類十分多樣,包括醇類、醛酮類、酸類、酯類、萜烯類、含氮類、含硫類等超過(guò)300種。其中揮發(fā)性硫醇類化合物由于香氣特征獨(dú)特,香氣閾值極低,是醬香型白酒中一類對(duì)風(fēng)味品質(zhì)具有重要影響的香氣化合物[2]。代表性的甲硫醇[3](爛白菜、燒焦的橡膠味,46%酒精水溶液中化合物的香氣閾值為2.2 μg/L)、乙硫醇[4](洋蔥、橡膠味,46%酒精水溶液中化合物的香氣閾值為0.8 μg/L)、2-甲基-3-呋喃硫醇[5](烘烤味,53%酒精水溶液中化合物的香氣閾值為0.004 8 μg/L)和糠硫醇[6](烤芝麻、咖啡味,46%酒精水溶液中化合物的香氣閾值為0.1 μg/L)等揮發(fā)性硫醇類化合物在原酒中含量的變化會(huì)顯著影響醬香型白酒的風(fēng)味品質(zhì)[7]。醬香型白酒輪次基酒的貯存、重新組合形成了復(fù)雜而獨(dú)特的酒體風(fēng)格[8],輪次基酒的風(fēng)味特征是保證醬香型白酒品質(zhì)的重要條件基礎(chǔ),很大程度上決定了成品酒的品質(zhì)[9]。然而,揮發(fā)性硫醇類化合物在釀造過(guò)程中研究較少,監(jiān)測(cè)揮發(fā)性硫醇類化合物在白酒釀造過(guò)程中的規(guī)律性變化是實(shí)現(xiàn)調(diào)控輪次基酒風(fēng)味品質(zhì)的重要途徑。

由于白酒中揮發(fā)性硫醇化合物的含量極低(大多在μg/L或ng/L水平),且不穩(wěn)定易分解[10],對(duì)這類化合物的分析檢測(cè)十分具有挑戰(zhàn)性[11]。往往需要通過(guò)特殊的衍生化處理再結(jié)合氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)[12]或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[13]才能有效檢測(cè)。用于硫醇類化合物檢測(cè)的衍生化試劑通常有2,3,4,5,6-五氟溴化芐(pentafluorobenzyl bromide,PFBBr)[14]、丙炔酸乙酯(ethyl propiolate,ETP)[15-16]、4,4′-聯(lián)吡啶二硫醚(4,4′-dithiodipyridine,DTDP)[17]等。衍生化試劑的選擇既與檢測(cè)的目標(biāo)化合物相關(guān),也與測(cè)定樣品的基質(zhì)性質(zhì)相關(guān),選擇合適的衍生化試劑是揮發(fā)性硫醇化合物準(zhǔn)確檢測(cè)的關(guān)鍵因素之一。

因此,本研究擬將衍生化與固相萃取(solid phase extraction,SPE)方法結(jié)合,聯(lián)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)檢測(cè)技術(shù)對(duì)醬香型白酒中揮發(fā)性硫醇類化合物進(jìn)行定量分析,解析不同釀造輪次的輪次基酒以及不同時(shí)間蒸餾出的餾分酒中揮發(fā)性硫醇類化合物含量變化規(guī)律,可為實(shí)現(xiàn)醬香型白酒釀造過(guò)程中揮發(fā)性硫醇類風(fēng)味物質(zhì)的調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采用的樣品由某醬香型白酒有限公司提供,包括3組不同生產(chǎn)輪次的基酒樣品,以及單一輪次60 min內(nèi)中不同發(fā)酵層(上層、中層、下層)酒醅,經(jīng)過(guò)連續(xù)6 min間段蒸餾的基酒。上層和中層取酒時(shí)間點(diǎn)為6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 min。下層取酒時(shí)間點(diǎn)3、9、15、21、27、33、39、45、51、57 min。醬香型白酒的蒸餾階段,餾出酒的酒精度由高到低逐漸降低。具體樣品信息如表1所示。

1.1.2 主要試劑

甲硫醇、乙硫醇、巰基乙酸乙酯、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、乙酸3-巰基己酯、2-巰基丙酸乙酯、1-丁硫醇、1-戊硫醇、2-苯乙硫醇(內(nèi)標(biāo)),Sigma-Aldrich(上海)或百靈威(北京),純度均大于95%;C18固相萃取柱(6 mL,500 mg)、2′-脫氧胸苷-5′-二磷酸(2′-deoxythymidine-5′-diphosphate,DTDP)、乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA-Na2)、鹽酸和乙醛,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)或安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司(上海);甲酸為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海);乙腈為質(zhì)譜級(jí),Sigma-Aldrich(上海)。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀、液相色譜柱(BEH C18 2.1 mm×100 mm,1.7 μm),沃特世科技(上海)有限公司;N-EVAP111型氮吹儀,美國(guó)Organomation公司;Milli-Q超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白酒中揮發(fā)性硫醇類化合物的衍生化處理

通常,PFBBr和ETP在堿性pH下與硫醇類化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)。然而,白酒的pH值約為4,屬于酸性環(huán)境,針對(duì)白酒進(jìn)行揮發(fā)性硫醇類化合物的衍生化,DTDP是一種非常好的選擇,它能與硫醇迅速反應(yīng),并且能在較廣的pH范圍內(nèi)發(fā)生[18]。因此采用衍生化試劑DTDP將白酒中的揮發(fā)性硫醇類化合物進(jìn)行衍生化處理,衍生化試劑的制備過(guò)程如下:將220 mg DTDP溶于20 mL超純水和100 μL濃鹽酸(37%質(zhì)量分?jǐn)?shù))的混合液中,超聲反應(yīng)溶解后,用超純水定容至100 mL,制得衍生化試劑(10 mmol/L)。并將DTDP溶液貯存在-20 ℃下備用[19]。

表1 不同生產(chǎn)輪次以及不同時(shí)間蒸餾出的醬香型 白酒樣品信息Table 1 Information of sauce-aroma baijiu distilled in different production rounds and at different time

使用超純水或乙醇將白酒酒精度調(diào)整至25%vol左右,總體積為40 mL,加入濃度為58.7 mg/L的2-苯乙硫醇溶液68 μL,同時(shí)添加EDTA-Na240 mg,50%乙醛160 μL和新鮮解凍的衍生化試劑(4,4′-聯(lián)吡啶二硫醚,10 mmol/L)400 μL。渦旋振蕩5 min后,靜置25 min。甲硫醇、乙硫醇、巰基乙酸乙酯、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、乙酸3-巰基己酯、2-巰基丙酸乙酯、1-丁硫醇和1-戊硫醇,9種揮發(fā)性硫醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別配制于20 mL的53%vol酒精水溶液中進(jìn)行上述前處理過(guò)程。

1.3.2 SPE分離白酒中的硫醇的衍生物

將靜置后的樣品或配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次通過(guò)使用6 mL甲醇和6 mL超純水活化處理的C18固相萃取柱。然后用3 mL的甲醇進(jìn)行洗脫,并收集洗脫液,在常溫下使用氮吹儀用溫和的氮?dú)饬鳚饪s至400 μL,過(guò)膜后避光貯存于4 ℃冰箱中,以待分析。

1.3.3 UPLC-MS/MS 儀器條件設(shè)置

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(multiple reaction-monitoring, MRM)模式的正電離模式進(jìn)行檢測(cè)。柱溫始終保持在40 ℃,流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈(B),洗脫梯度為:0～13 min, 15%～22% B;13～14 min, 22%～30% B;14～18 min, 30%～35% B;18～18.5 min, 35%～100% B;18.5～21.5 min, 100% B;21.5～22 min, 100%～15% B。流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣體積為10 μL。選擇以下質(zhì)譜檢測(cè)條件:離子源的條件溫度為150 ℃,去溶劑溫度為500 ℃,毛細(xì)管電壓3 kV,去溶劑氣流速800 L/h。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)中醬香型白酒中揮發(fā)性硫醇類化合物的含量范圍[4],確定硫醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的用量,添加一定量的硫醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶解于53%vol乙醇溶液中,依次進(jìn)行2倍梯度稀釋。配制成10個(gè)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。通過(guò)與樣品進(jìn)行相同的前處理方法后進(jìn)樣分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)使用MassLynx V4.1進(jìn)行處理。繪圖是通過(guò)使用Origin Pro 2022b完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-MS / MS 檢測(cè)醬香型白酒揮發(fā)性硫醇類化合物的方法的建立

硫醇類化合物的質(zhì)譜參數(shù)是參考YAN等[4]優(yōu)化的結(jié)果,定量離子對(duì)(m/z)、錐孔電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜信息為甲硫醇(母離子:158.0,子離子:110.7,錐孔電壓:23,碰撞電壓:19);乙硫醇(172.0,143.0,23,19);1-丁硫醇(199.7,143.4,25,19);1-戊硫醇(214.0,143.2,27,17);糠硫醇(223.7,143.8,21,19),2-甲基-3-呋喃硫醇(224.0,110.6,23,25);巰基乙酸乙酯(230,143.4,25,27);2-巰基丙酸乙酯(244.0,143.2,25,27);乙酸3-巰基己酯(286.2,143.3,23,23)以及內(nèi)標(biāo)2-苯乙硫醇(248.5,143.5,23,20)。通過(guò)上面得到的質(zhì)譜信息,采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的檢測(cè)。根據(jù)結(jié)果對(duì)硫醇類化合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 硫醇類化合物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves for the detection of thiol compounds

不同的硫醇類衍生物在液相色譜上進(jìn)行分離,采用乙腈作為有機(jī)相,在添加0.1%甲酸后,有了更好的峰形和響應(yīng),最終在18 min內(nèi)的流動(dòng)相梯度下的完全分離。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品衍生物進(jìn)樣,確定單個(gè)硫醇衍生物的出峰時(shí)間。將9個(gè)硫醇類衍生物的出峰位置整理在同一視圖上,如圖1所示。

圖1 硫醇衍生物UPLC-MS/MS的出峰時(shí)間Fig.1 The peak time of thiol derivatives detected by UPLC-MS/MS

2.2 醬香型白酒不同輪次中的揮發(fā)性硫醇類化合物的含量分布

醬香型白酒的一個(gè)完整的生產(chǎn)過(guò)程需要持續(xù)一整年(歷經(jīng)8次發(fā)酵、9次蒸煮、7次取酒)。在醬香型白酒的生產(chǎn)過(guò)程中,揮發(fā)性硫醇類化合物作為一類影響醬香型白酒風(fēng)味品質(zhì)的重要風(fēng)味物質(zhì),研究不同生產(chǎn)輪次中揮發(fā)性硫醇類化合物的含量變化規(guī)律對(duì)于實(shí)現(xiàn)醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中硫醇類風(fēng)味物質(zhì)的含量控制具有重要的參考意義。因此,本研究采用3組不同輪次的基酒樣品進(jìn)行檢測(cè)。3組不同輪次的輪次基酒中,甲硫醇的質(zhì)量濃度為28.56～746.67 μg/L,乙硫醇的質(zhì)量濃度為2.97～3.02 μg/L,1-丁硫醇的質(zhì)量濃度為0.53～3.49 μg/L,1-戊硫醇的質(zhì)量濃度為0.59～1.87 μg/L,糠硫醇的質(zhì)量濃度為16.96～26.09 μg/L,2-甲基-3-呋喃硫醇質(zhì)量濃度為0.65～17.31 μg/L,巰基乙酸乙酯的質(zhì)量濃度為0.12～0.42 μg/L,2-巰基丙酸乙酯的質(zhì)量濃度為0.05～0.14 μg/L,乙酸3-巰基己酯的質(zhì)量濃度為0.16～2.40 μg/L。隨著輪次的增加,甲硫醇、糠硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇等重要揮發(fā)性硫醇類化合物的含量整體變化有一定上升的趨勢(shì),結(jié)果如圖2所示。

a-甲硫醇;b-糠硫醇;c-2-甲基-3-呋喃硫醇圖2 一至七輪次醬香型白酒中甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇的含量變化Fig.2 The content changes of methanethiol, 2-furfurylthiol, and 2-methyl-3-furanethiol in sauce-aroma Baijiu from one to seven round

2.3 醬香型白酒單一輪次下不同蒸餾時(shí)間的硫醇類化合物的含量變化規(guī)律

醬香型白酒中的硫醇類化合物整體輪次含量變化規(guī)律已經(jīng)得到解析,為了進(jìn)一步觀察單一輪次蒸餾過(guò)程中硫醇類化合物的含量變化規(guī)律。醬香型白酒的3組不同發(fā)酵層(上層、中層和下層)的不同出酒時(shí)間的餾分酒從出酒開(kāi)始計(jì)時(shí),上層和中層,每隔6 min收集餾分,下層從3 min時(shí)開(kāi)始收集第一組餾分,共計(jì)30個(gè)餾分,進(jìn)行揮發(fā)性硫醇類化合物的檢測(cè)分析。檢測(cè)結(jié)果如圖3～圖5所示。在蒸餾階段,餾分酒中的揮發(fā)性硫醇類化合物的含量變化為甲硫醇(61.26～1 204.38 μg/L),乙硫醇(2.98～3.34 μg/L),1-丁硫醇(0.69～17.45 μg/L),1-戊硫醇(0.64～4.72 μg/L),糠硫醇(17.53～80.63 μg/L),2-甲基-3-呋喃硫醇(0.86～20.31 μg/L),巰基乙酸乙酯(0.16～0.47 μg/L),2-巰基丙酸乙酯(0.08～0.36 μg/L),乙酸3-巰基己酯(0.02～3.67 μg/L)。

醬香型白酒上層酒醅的蒸餾過(guò)程中,餾分酒中的糠硫醇、2-巰基丙酸乙酯、乙酸3-巰基己酯、1-戊硫醇、巰基乙酸乙酯、1-丁硫醇的濃度變化總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。甲硫醇總體呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì),2-甲基-3-呋喃硫醇總體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),乙硫醇含量變化較為穩(wěn)定。中層酒醅的蒸餾過(guò)程中,1-丁硫醇、乙酸3-巰基己酯、2-甲基-3-呋喃硫醇、1-戊硫醇、巰基乙酸乙酯、2-巰基丙酸乙酯的濃度變化總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),糠硫醇和乙硫醇濃度變化較為穩(wěn)定。下層酒醅的蒸餾過(guò)程中,1-丁硫醇、1-戊硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、2-巰基丙酸乙酯、巰基乙酸乙酯、乙酸3-巰基己酯濃度變化總體呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì),甲硫醇呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),糠硫醇和乙硫醇的濃度變化較為穩(wěn)定。醬香型白酒的三層不同發(fā)酵酒醅的餾分中揮發(fā)性硫醇類化合物的部分變化規(guī)律是不同的,這可能也是醬香型白酒形成3種典型體(醬香、醇甜、窖底香)[20],產(chǎn)生差異的原因之一。

醬香型白酒的三層發(fā)酵酒醅在蒸餾過(guò)程中,甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇等重要揮發(fā)性硫醇類化合物,其含量變化會(huì)出現(xiàn)一個(gè)甚至多個(gè)拐點(diǎn)。在酒醅的連續(xù)蒸餾過(guò)程中,硫醇類化合物等風(fēng)味物質(zhì)通過(guò)蒸餾過(guò)程中的萃取作用轉(zhuǎn)移到餾分酒中,其含量并不是一直下降的,這說(shuō)明揮發(fā)性硫醇類化合物在酒醅中的總量并不是恒定不變的,發(fā)酵過(guò)程中不僅僅只產(chǎn)生含量恒定的揮發(fā)性硫醇類化合物,同時(shí)也可能產(chǎn)生了一定量的硫醇前體物質(zhì)[21],在蒸餾加熱過(guò)程中,前體物質(zhì)的熱降解反應(yīng)可能增加了揮發(fā)性硫醇類化合物的總量。

圖3 上層酒醅不同蒸餾時(shí)間的餾分酒中揮發(fā)性硫醇類化合物的含量變化規(guī)律Fig.3 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of upper layers fermented grains at different distillation time

圖4 中層酒醅不同蒸餾時(shí)間的餾分酒中揮發(fā)性硫醇類化合物的含量變化規(guī)律Fig.4 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of middle layers fermented grains at different distillation time

圖5 下層酒醅不同蒸餾時(shí)間的餾分酒中揮發(fā)性硫醇類化合物的含量變化規(guī)律Fig.5 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of bottom layers fermented grains at different distillation time

甲硫醇和硫化氫可能來(lái)源于蛋氨酸或半胱氨酸衍生物的降解[22]。酒醅在發(fā)酵過(guò)程中含硫氨基酸會(huì)大量積累,在蒸餾過(guò)程中將酒醅中大量合成的蛋氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫醇,通過(guò)蒸餾作用萃取到餾分酒中。糠硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇是白酒中重要的硫醇類化合物,它們?cè)卺u香型白酒釀造過(guò)程中的前體物質(zhì)可能是糖類和氨基酸,糠硫醇的中間體之一是糠醛和硫化氫[23],2-甲基-3-呋喃硫醇的中間體之一是4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮[24],糠醛和4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮是糖的降解產(chǎn)物。在蒸餾過(guò)程中,前體物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng),最后產(chǎn)生糠硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇,而隨著蒸餾的進(jìn)行,前體物質(zhì)的減少,中間體物質(zhì)的消耗,糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇的生成也逐漸緩慢。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)DTDP衍生化結(jié)合SPE前處理后進(jìn)行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的方法,對(duì)醬香型白酒不同釀造輪次基酒以及單一輪次不同時(shí)間蒸餾出的餾分酒中的揮發(fā)性硫醇類化合物進(jìn)行定量分析,確定其含量變化范圍并對(duì)其含量變化規(guī)律進(jìn)行解析。結(jié)果表明,隨著輪次的增加,醬香型白酒中香氣閾值極低的2-甲基-3-呋喃硫醇、糠硫醇等揮發(fā)性硫醇的含量隨著輪次的增加而上升,不同輪次間揮發(fā)性硫醇類化合物可能存在一定的累積效應(yīng),導(dǎo)致下一輪次中硫醇類化合物含量的增加。不同發(fā)酵層酒醅的餾分酒中硫醇類化合物的含量變化規(guī)律為絕大部分呈現(xiàn)出先上升后下降的變化規(guī)律,部分硫醇含量變化穩(wěn)定,蒸餾過(guò)程的熱反應(yīng)促進(jìn)了甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇等重要揮發(fā)性硫醇類化合物的生成。