黃泰富， 于洪文，3， 黃利春， 韓雪容，2

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130000；3.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130000；4.興安盟農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400）

我國(guó)作為一個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)， 農(nóng)作物生物質(zhì)副產(chǎn)物秸稈年產(chǎn)量近9 億t （石祖梁等，2019）。2022 年全國(guó)農(nóng)作物秸稈中玉米秸稈占比40.27%，但因其纖維素等難以被消化，其中的養(yǎng)分吸收利用率低，動(dòng)物采食率較低，適口性差，只能作為動(dòng)物的劣質(zhì)粗飼料使用（李岫峰等，2022）。研究發(fā)現(xiàn)，食用菌有較強(qiáng)降解木質(zhì)素的能力，且食用菌發(fā)酵不存在明顯的安全問題 （尹珺伊等，2022； 叢立新，2014）。 在實(shí)際的食用菌栽培中杏鮑菇、 平菇和金針菇等多種常見食用菌菌糠可直接作為飼料或飼料添加劑（馮雪彬等，2021）。王雨瓊等（2021）選用3 株分別為粉褶側(cè)耳，糙皮側(cè)耳和漏斗狀側(cè)耳的側(cè)耳屬白腐菌發(fā)酵飼料， 發(fā)現(xiàn)其能夠有效改善發(fā)酵青稞秸稈的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)， 提高秸稈的利用效率。 綜上所述，食用菌具有分解稻草、玉米等秸稈中木質(zhì)纖維素的能力， 同時(shí)在其自身生長(zhǎng)發(fā)育過程中可產(chǎn)生多糖、 蛋白質(zhì)和脂肪酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分， 作為秸稈飼料化營(yíng)養(yǎng)配方改良用真菌前景廣闊。 然而直接將食用菌作為秸稈等生物質(zhì)的添加菌劑發(fā)酵培養(yǎng)的研究較少， 缺乏相關(guān)食用菌用作提高玉米秸稈飼料品質(zhì)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究擬對(duì)經(jīng)粗篩降解酶系酶活較高， 且生長(zhǎng)速率快的8 株食用菌使用ITS 條形碼進(jìn)行鑒定，再以玉米秸稈為唯一碳源作為培養(yǎng)料，通過比較該8 株食用菌對(duì)玉米秸稈中木質(zhì)纖維素的降解率，對(duì)比粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鈣和磷等含量，并采用掃描電鏡能譜儀觀察玉米秸稈結(jié)構(gòu)的微觀形態(tài)學(xué)，篩選出能高效降解玉米秸稈木質(zhì)纖維素，同時(shí)能提高飼料化玉米秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食用菌菌株，為高效利用玉米秸稈提供參考和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試菌種： 分別編號(hào)為S1 ～S8的8 株食用菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。 玉米秸稈在吉林省長(zhǎng)春市長(zhǎng)春新區(qū)周邊玉米地獲得。

1.2 培養(yǎng)基 PDA 固體培養(yǎng)基 （劉紅菊等，2018）：馬鈴薯去皮切小塊200 g，煮沸30 min 過濾，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，去離子水定容至1 L，pH 自然，115 ℃高壓滅菌30 min。 秸稈培養(yǎng)料配方：玉米秸稈粉（40 目）99.9%，多菌靈0.1%。

1.3 試劑及儀器 儀器：Synergy HIM 全功能微孔檢測(cè)儀（美國(guó)Biotek 公司）；5430R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；SKGL-1200 管式爐（中國(guó)中科院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所）；BSA224S-CW 分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；連續(xù)流動(dòng)分析儀SAN++（荷蘭Skalar）；5PrimeG/02基因擴(kuò)增儀（比比科技有限公司）；IT-500 掃描電鏡能譜儀 （日本JEOL 株式會(huì)社）；Vario MACRO cube 元素分析儀（德國(guó)Elementar 公司）。

試劑： 生工SK8259 Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒、 瓊脂糖、TAE、TaqDNA 聚合酶、通用引物ITS1 及ITS4、5×PCR Buffer、dNTP 和DNA Ladder Mix maker 購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1．4 試驗(yàn)方法

1.4.1 8 種食用菌菌株培養(yǎng) 將8 種食用菌菌株（S1 ～S8）分別接種在PDA 固體培養(yǎng)基中，于搖床27 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.4.2 菌種基因組DNA 提取方法 待PDA 培養(yǎng)基上長(zhǎng)滿菌絲后， 用鑷子分別挑取8 種食用菌菌絲20 mg， 采用上海生工SK8259 Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取各菌株的DNA。

1.4.3 8 株菌種ITS 條形碼的PCR 擴(kuò)增與測(cè)序用真菌通用引物ITS1/ITS4（由上海生物工程有限公司合成）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3’。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：基因組DNA 0.5 μL，5×PCR Buffer（含MgCl2）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，F(xiàn) Primer 0.5 μL，R Primer 0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，最后加ddH2O 補(bǔ)至總體積為25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共36 個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

在凝膠成像系統(tǒng)中觀察經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后的PCR 產(chǎn)物，用小刀切下8 條編號(hào)為S1 ～S8，長(zhǎng)度為600 ～700 bp 的條帶， 采用Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的PCR產(chǎn)物，于上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4.4 8 株菌株分子系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將經(jīng)公司測(cè)序后擴(kuò)增的8 條ITS 序列輸入NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)BLAST 比對(duì)，選取與鑒定菌種相似度在99%以上序列，用MEGA5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA 5.0 中的鄰近相鄰法（NJ）構(gòu)建、分析。各分支的置信度經(jīng)bootstrap 1000 次循環(huán)檢驗(yàn)各分支的系統(tǒng)學(xué)意義與可靠性。

1.4.5 8 株菌種與玉米秸稈共培養(yǎng) 將PDA 上培養(yǎng)的S1 ～S8 菌每組取三個(gè)相同菌塊， 分別接種在過40 目篩， 經(jīng)121 ℃、30 min 蒸汽高壓處理后， 含有1.5 L 玉米秸稈培養(yǎng)料的2 L 體積燒杯中，空白試驗(yàn)組為不接種食用菌的秸稈培養(yǎng)料。 在27 ℃，培養(yǎng)28 d 后，將每個(gè)試驗(yàn)組的降解后玉米秸稈培養(yǎng)料全部取出，均勻混合，放于50 ℃烘箱干燥4 h，研磨過40 目篩。每個(gè)試驗(yàn)組收集100 g 樣品供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.4.6 培養(yǎng)料中纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質(zhì)素含量的測(cè)定 采用Van Soest（Tian 等，2017）法測(cè)定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量。

1.4.7 經(jīng)8 株菌株分解的玉米秸稈掃描電鏡分析每個(gè)試驗(yàn)組取樣品質(zhì)量1.0000 g， 同組試驗(yàn)的三個(gè)樣品均勻混合，重新標(biāo)號(hào)為a ～i。9 組樣品用研缽研磨成粉末狀，用牙簽挑取少許處理后樣品，在銅臺(tái)上用導(dǎo)電膠粘好后放入離子鍍膜儀上噴鍍黃金，再用IT-500 掃描電鏡能譜儀，在真空條件下觀察拍照。

1.4.8 經(jīng)側(cè)耳屬真菌處理后的玉米秸稈粗脂肪含量檢測(cè) 采用索氏抽提法（Huijun 等，2022）測(cè)定培養(yǎng)料中粗脂肪含量。

1.4.9 經(jīng)8 株菌株處理后的玉米秸稈元素含量檢測(cè) 全氮測(cè)定方法：LY/T1269-1999 森林植物與枯枝落葉層全氮的測(cè)定。 準(zhǔn)確稱取磨細(xì)的樣品0.3000 g 于三角瓶中，加1.8 g 催化劑（硒粉：硫酸銅：硫酸鉀=1:10:100），加4 mL 濃硫酸，于電熱板上消煮至溶液清亮即可，取下冷卻后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻待測(cè)。 待測(cè)液用連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀（SKALAR SAN++）測(cè)定。

全N/（mg/kg）=測(cè)值×100/樣重。

鈣元素測(cè)定方法：LY/T1270-1999 電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICPS-7500）ICP-AES 法。 稱取風(fēng)干磨碎的樣品0.5 g 于三角瓶中，加5 mL 濃HNO3，2 mL HClO4， 于電熱板上消煮至溶液變成透明， 有少量白煙。 取下冷卻， 加2.5 mL 10%HNO3，轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用去離子水定容，搖勻待測(cè)，同時(shí)做空白試驗(yàn)。待測(cè)液用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICPS-7500） 或電感耦合等離子體質(zhì)譜（NeXion350D）測(cè)定。

鈣/（mg/kg）=（測(cè)值-空白）×50/樣重。

植物全磷采用LY/T1270-1999 連續(xù)流動(dòng)分析儀（SAN++）測(cè)定。 準(zhǔn)確稱取粉碎的樣品0.3000 g于三角瓶中，加5 mL HNO3，2 mL HClO4，于電熱板上消煮至透明，取下冷卻，轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻待測(cè)。 待測(cè)液用連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀（SKALAR SAN++）測(cè)定。

全磷/（mg/kg）=測(cè)值×100/樣重。

計(jì)算培養(yǎng)料粗蛋白質(zhì)含量； 以上每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 軟件和SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITS 系統(tǒng)發(fā)育樹的8 種菌株分類 8 個(gè)獲得的ITS 序列測(cè)序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行對(duì)比后，得到同源性較高菌株的ITS 序列。同時(shí)下載16 個(gè)具有代表性菌株序列與本試驗(yàn)所測(cè)的8 個(gè)菌株ITS 序列用MEGA5 軟件采用鄰近相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 S1 ～S8 食用菌及其參考菌株ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖1 可知， 菌株S1、S5、S6 和S7 分別與Hypsizygus marmoreus（KU836544.1，MK966519.1，JX046017.1，JX046031.1） 同源性為 100% 、99.82%、100%和100%，以上菌株被鑒定為斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）。 菌株S2 與Pleurotus pulmonarius（MN244439.2）同源性為100%，被鑒定為肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）。菌株S3 與Stropharia rugosoannulat（MN622796.1）同源性為100%，被鑒定為大球蓋菇（Stropharia rugosoannulat）。 菌株S4 與Pleurotus ostreatus（MN244441.2）同源性為100%，被鑒定為糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）。菌 株 S8 與Pleurotus eryngii（MH517524.1）同源性為100%，被鑒定為刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii）。

2.2 8 株菌株與玉米秸稈共培養(yǎng)后的木質(zhì)纖維素含量及營(yíng)養(yǎng)成分變化

2.2.1 玉米秸稈中酸性洗滌木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量 在接種了8 株食用菌28 d 后，玉米秸稈纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質(zhì)素和營(yíng)養(yǎng)成分含量變化見表1，與不接種食用菌的對(duì)照組相比，秸稈培養(yǎng)料中的纖維素、 半纖維素和酸性洗滌木質(zhì)素顯著降低。8 株菌對(duì)纖維素降解中，S4 號(hào)菌株降解效果最好達(dá)到了48.4%， 其次是S7 號(hào)菌株，達(dá)27.35%。 對(duì)半纖維素降解中，S1 號(hào)菌株降解效果最好達(dá)到了62.85%， 其次是S5 號(hào)菌株，達(dá)60.15%。 對(duì)酸性洗滌木質(zhì)素降解中，S4 號(hào)菌株降解效果最好達(dá)到了71.2%， 其次是S8 號(hào)菌株，達(dá)53.79%。 綜合比較玉米秸稈各組降解率，糙皮側(cè)耳的S4 菌株降解秸稈能力最強(qiáng)。

表1 食用菌對(duì)秸稈木質(zhì)纖維素含量及營(yíng)養(yǎng)成分的影響 %

2.2.2 培養(yǎng)料中營(yíng)養(yǎng)成分含量 由表1 可知，在接種了8 株食用菌28 d 后，和不接種食用菌的空白對(duì)照組相比， 秸稈培養(yǎng)料中的營(yíng)養(yǎng)元素均有明顯提升。 粗蛋白質(zhì)含量，S2 號(hào)菌株提升效果最好，提升了145%，其次是S8 號(hào)和S4 號(hào)菌株，粗蛋白質(zhì)含量提升了111%和110%。 粗脂肪含量，S1 號(hào)菌株提升效果最好，提升了495%，其次是S2 號(hào)菌株，粗脂肪含量提升了476%。 鈣含量，S2 號(hào)菌株提升效果最好， 提升了82%， 其次是S4 號(hào)菌株， 提升了76%。 磷含量，S4 號(hào)菌株提升效果最好，磷含量提升了100%，其次是S2 號(hào)菌株，磷含量提升了92%。

2.3 與8 株食用菌菌株共培養(yǎng)后玉米秸稈的微觀結(jié)構(gòu)變化 在玉米秸稈培養(yǎng)料接種食用菌28 d后， 采用掃描電鏡觀察玉米秸稈結(jié)構(gòu)的微觀形態(tài)學(xué)變化（圖2）。 圖2a 為玉米秸稈，纖維組成部分排列十分清晰，結(jié)構(gòu)緊密，表面較為光滑。圖2b ～圖2i 分別對(duì)應(yīng)S1～S8 號(hào)食用菌與玉米秸稈共培養(yǎng)后的掃描電鏡， 均觀察到秸稈結(jié)構(gòu)受到不同程度破壞的微觀形貌，其中S3、S6 試驗(yàn)組（圖2d、圖2g）中能觀察到秸稈結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，秸稈相互交錯(cuò)且界限模糊，S4、S8（圖2e、圖2i）中能觀察到秸稈暴露出中間層的木質(zhì)纖維素骨架。

圖2 S1 ～S8 對(duì)玉米秸稈的結(jié)構(gòu)影響

3 討論

目前已有研究表明， 飼料復(fù)合酶添加劑比單一酶添加劑發(fā)酵效果好， 但是復(fù)合菌制劑對(duì)發(fā)酵條件要求高，工藝繁瑣，生產(chǎn)成本高，還可能存在拮抗和抑制的情況（李國(guó)祥等，2022）。食用菌通過分泌各種降解酶降解玉米秸稈各組分， 且降解效果優(yōu)于復(fù)合酶添加劑（司徒成等，2022）。本研究中鑒定為糙皮側(cè)耳的S4 菌株降解秸稈能力最強(qiáng)，Wan 等（2010）研究中白腐真菌Ceriporiopsis subvermispora降解玉米秸稈的木質(zhì)素降解率為31.59%，對(duì)纖維素的降解率低于6%（18d）。 甄靜等（2017）研究中Trametes hirsutaXYG422 在玉米秸稈中培養(yǎng)60 d 后，木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率分別為83.54%、50.65%和19.53%。該菌在培養(yǎng)28 d 后對(duì)玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解率可達(dá)48.40%、48.89%和71.2%。 通過掃描電鏡能譜儀觀察玉米秸稈微觀層面降解，SEM 結(jié)果顯示，食用菌降解后的玉米秸稈帚化嚴(yán)重，可見其結(jié)晶度明顯降低，與郭曉威等（2017）研究結(jié)果一致， 可以證明食用菌能明顯降低玉米秸稈的結(jié)晶度，提高適口性。粗蛋白質(zhì)含量是衡量飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，接種S2 菌株發(fā)酵28 d 飼料粗蛋白質(zhì)含量可達(dá)12.48%，相比未接種食用菌粗蛋白質(zhì)含量提升了145%。 對(duì)比秸稈氨化，微貯50 d，飼料中粗蛋白質(zhì)含量為8.89%和5.67%， 相對(duì)只提升了70.31%和8.6%。（楊勤等，2015）。 而Pleurotus ostreatus F6 處理秸稈30 d 后粗蛋白質(zhì)含量提升了151%（Bhuvnesh等，2011），本研究結(jié)果與之接近。同時(shí)食用菌中含有豐富的氨基酸、多糖、多肽、皂甙和多種微量元素，可以通過調(diào)節(jié)畜牧腸道微生物群，發(fā)揮抗菌、增強(qiáng)免疫力作用（郭遠(yuǎn)等，2022；劉啟燕等，2019；袁建國(guó)，2010）。

4 結(jié)論

綜上所述，食用菌發(fā)酵玉米秸稈是可行的，且不同菌種效果不一。 本研究證實(shí)糙皮側(cè)耳菌是發(fā)酵飼用玉米秸稈的優(yōu)勢(shì)菌株， 該菌株具有較高的木質(zhì)素降解能力，可改善玉米飼料的適口性，同時(shí)能顯著提高飼料粗蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素含量。 糙皮側(cè)耳有作為玉米秸稈飼料改良菌的極大潛力。