王淑婧，曾祥冰，孫西同，陳曉藝，李 苗，王添譽，李 巖，李 僉,，李憲臻,

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連 116034）

脂肪酶是一種能夠催化酯水解、酯化和酯交換反應(yīng)的工業(yè)酶，這使其成為食品、制藥和生物能源行業(yè)中炙手可熱的生物催化劑[1-3]。然而，游離的脂肪酶不能滿足工業(yè)生物催化劑的所有要求，存在有機溶劑耐受性低、熱穩(wěn)定性差，以及難以回收利用等問題[4]，這都極大地制約了脂肪酶的進(jìn)一步應(yīng)用。為獲得適用范圍更廣、性能更加優(yōu)越的脂肪酶，人們主要從兩方面入手開展相關(guān)研究工作。一方面，可以通過分子改造提高脂肪酶本身的環(huán)境耐受性，但是存在改造成本高、研究過程繁瑣等問題[5-6]。另一方面，采用固定化酶技術(shù)，將酶固定在載體上，使酶能夠重復(fù)使用并增加其穩(wěn)定性，從而簡化回收過程，在實際應(yīng)用中具有更大優(yōu)勢[7-8]。使用化學(xué)方法（如交聯(lián)法）固定化酶是研究熱點之一，然而常用的戊二醛、京尼平、環(huán)氧氯丙烷等交聯(lián)劑會影響酶分子的構(gòu)象，進(jìn)而造成酶活的損失，在一定程度上限制了固定化酶的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，減少使用或不使用交聯(lián)劑，而是利用材料表面的粘附性及氫鍵等作用力進(jìn)行固定化酶，是解決上述問題的主要方法之一。

以多巴胺（dopamine，DA）沉積為代表的貽貝仿生技術(shù)，因其綠色、環(huán)保的優(yōu)點受到越來越多的關(guān)注，并已初步應(yīng)用于固定化酶的研究中[9]。該技術(shù)的主要反應(yīng)機制是，在有氧和弱堿性條件下，多巴胺可自發(fā)在材料表面氧化自聚形成聚多巴胺（polydopamine，PDA）涂層。聚多巴胺憑借優(yōu)良的粘附特性以及豐富的反應(yīng)基團(tuán)（如鄰苯二酚基團(tuán)），通過邁克爾加成或席夫堿反應(yīng)再次鍵合功能分子，從而實現(xiàn)進(jìn)一步的功能化修飾[10]。例如，Liu 等[11]使用多巴胺與聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）共沉積作為柔性鏈修飾氧化石墨烯，用于固定化腺苷酸環(huán)化酶，沉積時間需16 h。Zhai 等[12]以聚多巴胺/聚乙烯亞胺共沉積修飾二氧化硅微球，用于固定化碳酸酐酶，固定化酶在10 次循環(huán)之后有初始酶活的95.10%，沉積時間需12 h。因此尋找合適的載體并盡量縮短沉積時間，對制備和應(yīng)用固定化酶具有積極意義。

甲基丙烯酸縮水甘油酯的合成方法簡單，具有良好的生物相容性，已被用于β-葡萄糖苷酶[13]、纖維素酶[14]及葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶共固定化[15]的研究中，而將其與貽貝仿生技術(shù)相結(jié)合并應(yīng)用于脂肪酶的固定化具有較強的創(chuàng)新性和重要的研究意義。因此，本研究采用聚甲基丙烯酸縮水甘油酯（poly（glycidyl methacrylate），PGMA）微球作為固定化酶的載體，在其表面通過多巴胺（DA）和聚乙烯亞胺（PEI）共沉積的方法進(jìn)行貽貝仿生改性，實現(xiàn)在不使用任何交聯(lián)劑的前提下，利用載體表面的特異性官能團(tuán)直接與脂肪酶結(jié)合，進(jìn)行酶的固定化工藝研究。進(jìn)一步評估固定化酶的酶學(xué)性能，包括催化活性、穩(wěn)定性和重復(fù)利用性等。最后，研究固定化酶催化酯化反應(yīng)的效果。該固定化酶策略具有反應(yīng)條件較溫和及催化效率較高等優(yōu)點，在大規(guī)模工業(yè)催化領(lǐng)域具有廣闊的實際應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）CICC 33470 購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；鹽酸多巴胺（98%）、聚乙烯亞胺（99%）、甲基丙烯酸縮水甘油酯（97%）上海阿拉丁試劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮、棕櫚酸對硝基苯酯 均為分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司；偶氮二異丁腈、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（99%）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SpectraMax Plus384 酶標(biāo)儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Spectrum 10 傅里葉變換紅外光譜儀 鉑金埃爾默儀器有限公司；JSM 7800F 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；Zeta sizer 3000HSA 激光粒度儀 英國馬爾文儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 近平滑假絲酵母脂肪酶的制備 根據(jù)石瑩[16]的方法活化凍干菌粉。用接種環(huán)蘸取活化后的近平滑假絲酵母菌液，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上劃線，于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待有單菌落出現(xiàn)并生長良好后，用接種環(huán)挑取一個單菌落，接種到裝液量為20%的搖瓶中，28 ℃，200 r/min 培養(yǎng)14 h，作為種子液。將種子液以10%接種量（v/v）接種至搖瓶中，200 r/min 培養(yǎng)14 h，將得到的發(fā)酵液在4 ℃，8000 r/min 離心10 min，上清液即為脂肪酶酶液。

1.2.2 貽貝仿生功能化PGMA-OH 的制備及表征

1.2.2.1 聚甲基丙烯酸縮水甘油酯（PGMA）的制備

向三口燒瓶中加入81 g 無水乙醇、9 g 水和3 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP K-30），待固體超聲溶解后，加入10 g 甲基丙烯酸縮水甘油酯單體和0.2 g 偶氮二異丁腈。在通氮氣的條件下將體系加熱至70 ℃，磁力攪拌24 h，反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水和乙醇交替洗滌微球，冷凍真空干燥得到的微球粉末記為PGMA。

1.2.2.2 PGMA-OH 的制備 取3 g PGMA 微球加入100 mL 硫酸水溶液（0.1 mol/L）中，70 ℃下磁力攪拌反應(yīng)48 h。用去離子水和乙醇交替洗滌PGMA反應(yīng)后得到的微球，冷凍真空干燥得到的微球粉末記為PGMA-OH。

1.2.2.3 貽貝仿生功能化PGMA-OH 的制備 在20 mL 的Tris-HCl 緩沖液（0.05 mol/L，pH 為8.5）中加入0.5 g PGMA-OH。之后，迅速加入40 mg 聚乙烯亞胺（PEI）及多巴胺（DA）。25 ℃條件下，磁力攪拌6 h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水和乙醇交替洗滌至上清液無色，以PGMA-OH@PDA/PEI 表示冷凍真空干燥得到的微球粉末。

1.2.2.4 掃描電子顯微鏡與能譜分析 干燥后的PGMA、PGMA-OH 及PGMA-OH@PDA/PEI 樣品置于載物臺上，真空條件下噴金處理，將處理好的樣品放入觀察室，拍攝樣品形貌照片，分析樣品形貌，對元素分布進(jìn)行分析[17]。

1.2.2.5 紅外光譜分析 采用KBr 壓片法，將干燥后的PGMA、PGMA-OH 及PGMA-OH@PDA/PEI 與KBr 按照1%的比例充分混合、研磨，壓片后置于紅外光譜儀上測試[18]。

1.2.2.6 Zeta 電位分析 將PGMA-OH 及PGMA-OH@PDA/PEI 分散于蒸餾水中，稀釋后至1 mg/L 后，80 W 超聲10 min 進(jìn)行測試[19]。

1.2.3 固定化酶的制備及表征

1.2.3.1 固定化酶的制備及工藝條件優(yōu)化 將0.2 g PGMA-OH@PDA/PEI 溶 解 于5 mL PBS 緩 沖 液（0.02 mol/L，pH 為7.0）中，然后與5 mL 脂肪酶酶液混合，放入搖床中，200 r/min 固定化5 h，在4 ℃，6000 r/min 的條件下離心5 min，用PBS 緩沖液洗滌三次，冷凍真空干燥得到固定化酶粉末。分別在不同固定化溫度（20、25、30、35、40 ℃）、不同固定化pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、不同固定化時間（3、4、5、6、7 h）、不同初始酶活（112.59、225.18、337.76、450.35、562.93 U/mL）及不同載體添加量（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g）條件下進(jìn)行實驗，測定固定化酶酶活的變化規(guī)律。

1.2.3.2 固定化酶的紅外光譜分析 采用KBr 壓片法，將冷凍真空干燥所得最佳酶固定化條件下制備出的固定化酶樣品與KBr 按照1%的比例充分混合、研磨，壓片后置于紅外光譜儀上測試[18]。

1.2.4 游離酶及固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.4.1 游離酶及固定化酶的最佳反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 當(dāng)pH 為7.0 時，將游離酶及固定化酶分別置于不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）下反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)溫度后，以處理前的酶活力定義為100%，測定8 h 內(nèi)，游離酶與固定化酶的相對酶活。

1.2.4.2 游離酶及固定化酶的最佳反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性 在最佳反應(yīng)溫度下，將游離酶及固定化酶分別置于不同pH（6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)pH 后，以處理前測定的酶活力定義為100%，測定2 h 內(nèi)、4 ℃下，游離酶與固定化酶的相對酶活。

1.2.4.3 游離酶及固定化酶的最佳反應(yīng)時間 在最佳反應(yīng)溫度及最佳反應(yīng)pH 條件下，將游離酶及固定化酶分別反應(yīng)不同時間（5、10、15、20、25 min），確定最佳反應(yīng)時間。

1.2.4.4 固定化酶的重復(fù)利用性 在最佳反應(yīng)條件下，依據(jù)固定化酶酶活測定方法，將制備的固定化酶進(jìn)行8 次循環(huán)實驗。向3 mL PBS 緩沖液（0.02 mol/L）中加入0.022 g 固定化酶及200 μL 棕櫚酸對硝基苯酯，在50 ℃下反應(yīng)10 min，每次反應(yīng)結(jié)束后用PBS緩沖液洗滌三次，之后投入下一次循環(huán)。以第一次循環(huán)測定的酶活力定義為100%，測定固定化酶的相對酶活。

1.2.4.5 游離及固定化酶的儲藏穩(wěn)定性 將游離酶和固定化酶分別置于4 ℃環(huán)境中儲藏1 個月，每5 d測定酶活力，以儲藏當(dāng)天（第0 d）的酶活力定義為100%，計算出各儲藏天數(shù)的相對酶活。

1.2.5 固定化酶在催化乙酰丙酸與十二醇酯化反應(yīng)中的應(yīng)用 按照王立暉等[20]的方法，向無溶劑體系中，加入摩爾比為1:10 的乙酰丙酸及十二醇，測定4 h 內(nèi)，乙酰丙酸在不同反應(yīng)溫度（35、40、45、50、55 ℃）下的轉(zhuǎn)化率。在最佳反應(yīng)溫度下，改變乙酰丙酸和十二醇的摩爾比（1:2.5、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25），測定4 h 內(nèi)乙酰丙酸的轉(zhuǎn)化率。在上述最優(yōu)條件下，測定乙酰丙酸在不同反應(yīng)時間（3、6、9、12、15、18、21、24 h）下的轉(zhuǎn)化率。

1.2.6 酶水解活性的測定 利用改進(jìn)的棕櫚酸對硝基苯酯（p-NPP，5.0 mg/mL）的方法對脂肪酶的水解活性進(jìn)行測定[21]。在3 mL 的PBS 緩沖液（0.02 mol/L，pH7.0）中，加入200 μL 的游離酶（或0.022 g 固定化酶）和200 μL 的p-NPP。混勻后在50 ℃下反應(yīng)10 min，過濾取上清液，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后，使用酶標(biāo)儀測定上清液在410 nm 處的吸光值。根據(jù)上清液中對硝基苯酚（p-NP）的含量，確定游離酶（或固定化酶）的水解酶活。酶活力（U）定義為：單位時間內(nèi)（min），釋放單位產(chǎn)物（1 nmol）所需的酶量，定義為1 個酶活單位。固定化酶酶活（U/g-載體）定義為：單位時間內(nèi)（min），單位載體（g）上，釋放單位產(chǎn)物（1 nmol）所需的酶量。

1.2.7 乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率的測定 利用熱乙醇法，分別測定反應(yīng)前后乙酰丙酸含量，按照公式（1）計算乙酰丙酸的轉(zhuǎn)化率[20]。

式中，A0為反應(yīng)前乙酰丙酸含量，A1為反應(yīng)后乙酰丙酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品設(shè)置三組平行，利用Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 22.0 進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的表征

2.1.1 載體的掃描電鏡圖與能譜分析 通過圖1 的掃描電鏡圖可以看出，與PGMA 相比，PGMA-OH表面形貌沒有發(fā)生明顯的變化，是粒徑大小為1 μm的光滑的微球。在微球表面進(jìn)行聚多巴胺/聚乙烯亞胺涂覆之后，微球表面產(chǎn)生了細(xì)小的顆粒，使其表面變得粗糙。由能譜圖（圖2）可知，與PGMA 相比，PGMA-OH 的C 元素含量由69.99%提高到77.50%，N 元素含量為0.44%，O 元素含量由30.01%下降到22.06%，這可能是因為，PGMA 中環(huán)氧基在酸性條件下開環(huán)之后在其表面產(chǎn)生豐富的羥基[22]，導(dǎo)致C、O、N 元素含量發(fā)生變化。聚多巴胺/聚乙烯亞胺修飾PGMA-OH 能在其表面引入更加豐富的氨基[23]，因此與PGMA-OH 相比，PGMA-OH@PDA/PEI 的C 元素含量由77.50%上升到84.67%，N 元素含量由0.44%上升到0.83%，而O 元素含量由22.06%下降到14.50%，證明了聚多巴胺/聚乙烯亞胺的成功涂覆。

圖1 PGMA（a）、PGMA-OH（b）與PGMA-OH@PDA/PEI（c）的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of PGMA (a),PGMA-OH (b) and PGMAOH@PDA/PEI (c)

圖2 PGMA、PGMA-OH 與PGMA-OH@PDA/PEI 的能譜圖Fig.2 EDS images of PGMA,PGMA-OH and PGMAOH@PDA/PEI

2.1.2 載體的紅外光譜圖 通過圖3a 的紅外光譜圖可以看出，1724 cm-1是PGMA 中-C＝O 的特征吸收峰，848 和907 cm-1是環(huán)氧基的特征吸收峰[24]。圖3b中，3456 cm-1是-OH 的彎曲振動峰，與圖3a 相比，該峰強度顯著增強，說明反應(yīng)形成了更多的-OH，且848 和907 cm-1處環(huán)氧基特征峰的消失，表明環(huán)氧基成功開環(huán)，這些均證明載體的表面水解成功[24]。通過圖3c 可以看出，2944 cm-1為-CH2-鍵的特征峰，苯環(huán)骨架的特征吸收峰出現(xiàn)在1629 cm-1處[23]，這些結(jié)果表明，聚多巴胺/聚乙烯亞胺成功地涂覆在PGMAOH 表面。

圖3 PGMA（a）、PGMA-OH（b）及PGMA-OH@PDA/PEI（c）的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of PGMA (a),PGMA-OH (b) and PGMAOH@PDA/PEI (c)

2.1.3 載體的 Zeta 電位分析 當(dāng) pH 為 7.0 時，與PGMA-OH 相比，PGMA-OH@PDA/PEI 電勢值由-10.30±1.83 mV 變?yōu)?13.67±0.55 mV，當(dāng)pH 為8.0時，與PGMA-OH 相比，PGMA-OH@PDA/PEI 電勢值由-11.56±0.80 mV 變?yōu)?16.97±1.72 mV。電勢值的變化可能與貽貝仿生功能化修飾有關(guān)，聚乙烯亞胺帶有正電荷，而多巴胺帶有更多負(fù)電荷[10]，共沉積時二者共同作用導(dǎo)致PGMA-OH 表面帶有較多負(fù)電荷。Zeta 電位分析結(jié)果同樣證明聚多巴胺/聚乙烯亞胺成功地涂覆在PGMA-OH 表面。

2.2 固定化酶制備工藝優(yōu)化

2.2.1 固定化溫度 從圖4 可以看出，當(dāng)固定化溫度為20 ℃時，固定化酶的酶活較低，這可能是因為低溫時席夫堿反應(yīng)的反應(yīng)速率較慢[25]。與25 ℃相比，當(dāng)固定化溫度為30 ℃時，固定化酶酶活顯著升高（P＜0.05），達(dá)到284.40±5.91 U/g-載體。繼續(xù)升高溫度至40 ℃，可能由于溫度對脂肪酶的酶分子構(gòu)象產(chǎn)生了影響[26]，導(dǎo)致固定化酶酶活降低。因此，選擇固定化溫度為30 ℃進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖4 固定化溫度對固定化酶酶活的影響Fig.4 Effect of immobilization temperature on immobilized enzyme activity

2.2.2 固定化pH 從圖5 可以看出，固定化pH 處于5.0 至7.0 范圍內(nèi)，固定化酶酶活隨pH 的增加而升高，在pH 為7.0 時，達(dá)到最高值，且顯著高于pH為5.0 和6.0 的酶活數(shù)據(jù)（P＜0.05）。進(jìn)一步提高pH至9.0，固定化酶酶活明顯降低，這可能是因為pH 的變化導(dǎo)致部分酶失活，這與田家英等[27]的研究結(jié)果類似。因此，選擇固定化pH7.0 進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖5 固定化pH 對固定化酶酶活的影響Fig.5 Effect of immobilization pH on immobilized enzyme activity

2.2.3 固定化時間 從圖6 可以看出，隨著固定化時間的增加，固定化酶酶活呈現(xiàn)先上升后下降的變化規(guī)律。當(dāng)固定化時間為5 h 時，酶活達(dá)到346.55±2.62 U/g-載體，顯著高于固定化時間為3 h 或4 h 的酶活數(shù)據(jù)（P＜0.05）。當(dāng)固定化時間為7 h 時，固定化酶的酶活顯著下降（P＜0.05）。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于時間的增加，酶分子與PDA/PEI 涂層發(fā)生共價結(jié)合的比例提高，因此酶活呈現(xiàn)出上升趨勢；當(dāng)酶與載體的連接位點達(dá)到飽和后，即使繼續(xù)增加固定化時間，酶分子暴露出的活性位點也非常有限甚至減少，故而酶活表現(xiàn)出下降趨勢[28]。因此，選擇固定化時間為5 h 進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖6 固定化時間對固定化酶酶活的影響Fig.6 Effect of immobilization time on immobilized enzyme activity

2.2.4 初始酶活 由圖7 可以看出，當(dāng)初始酶活為337.76 U/mL 時，固定化酶活達(dá)到444.05±0.87 U/g-載體。進(jìn)一步增加初始酶活至562.93 U/mL，固定化酶酶活顯著下降（P＜0.05），這是因為初始酶活為337.76 U/mL 時，載體的反應(yīng)位點可能被酶分子完全占據(jù)，繼續(xù)增加初始酶活，造成酶與載體的空間位阻增加，發(fā)生酶促反應(yīng)時酶和底物接觸不完全，因而導(dǎo)致酶活降低[23]。因此，選擇初始酶活為337.76 U/mL進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖7 初始酶活對固定化酶酶活的影響Fig.7 Effect of initial lipase activity on immobilized enzyme activity

2.2.5 載體添加量 如圖8 所示，當(dāng)載體添加量從0.05 g 增加至0.20 g 時，由于酶與載體的連接位點增加[13]，固定化酶酶活顯著提高（P＜0.05），達(dá)到444.19±2.26 U/g-載體。繼續(xù)增加載體添加量至0.25 g，酶活顯著降低（P＜0.05）。這可能因為，當(dāng)固定化體系中載體含量較高時，載體與酶分子間的共價作用減弱，從而導(dǎo)致酶活下降[28]。因此，選擇載體添加量為0.20 g來進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖8 載體添加量對固定化酶酶活的影響Fig.8 Effect of carrier addition on immobilized enzyme activity

2.3 固定化酶的表征

通過圖9 可以看出，2944 cm-1處-CH2-鍵的特征峰減弱，并且固定化脂肪酶之后，1276、1167 及1042 cm-1衍射峰強度增加，表明脂肪酶與PGMAOH@PDA/PEI 存在著相互作用力，結(jié)合圖3，實驗結(jié)果證明PGMA-OH@PDA/PEI 成功固定化脂肪酶。

圖9 PGMA-OH@PDA/PEI 及固定化酶的紅外光譜圖Fig.9 FT-IR spectra of PGMA-OH@PDA/PEI and immobilized enzyme

2.4 游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 游離及固定化酶的最佳反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 由圖10 可知，游離酶的最佳反應(yīng)溫度為40 ℃，固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為50 ℃。對固定化酶而言，與50 ℃相比，60 ℃其酶活顯著下降至89.28%（P＜0.05），與60 ℃相比，70 ℃固定化酶酶活差異不顯著（P＞0.05）。對游離酶而言，與40 ℃相比，反應(yīng)溫度為50、60 及70 ℃酶活顯著下降（P＜0.05）。這是因為，將酶固定在載體上時，PDA/PEI 涂層能穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)，因此固定化酶對高溫表現(xiàn)出較高的抵抗力，實驗結(jié)果與林海蛟等[29]的研究結(jié)果相似。同時，最佳反應(yīng)溫度的提高也有利于固定化酶的實際工業(yè)化生產(chǎn)[30]。

圖10 游離酶及固定化酶的最佳反應(yīng)溫度Fig.10 Optimum reaction temperature of free and immobilized enzyme

由圖11 可知，在50 ℃下，固定化酶在前6 h 內(nèi)能保留初始酶活的60%以上，而游離酶在40 ℃放置同樣的時間，僅為初始酶活的40%。與0 h 相比，在50 ℃放置8 h 后，固定化酶的酶活顯著下降（P＜0.05），此時固定化酶有47.61%的相對酶活，而游離酶在40 ℃放置8 h 后酶活顯著下降（P＜0.05）為初始酶活的36.58%。從結(jié)構(gòu)上看，當(dāng)酶的活性中心長時間暴露在較高溫度下時，酶分子從有序結(jié)構(gòu)到無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變是引起酶失活的主要原因[31]。與游離酶相比，固定化酶中的酶分子被限制在載體表面，載體表面對酶分子空間結(jié)構(gòu)的限制效應(yīng)，可以使固定化酶保持良好的活性構(gòu)象，避免因溫度變化而導(dǎo)致失活[32]。

圖11 游離酶及固定化酶的溫度穩(wěn)定性Fig.11 Thermal stabilities of free and immobilized enzyme

2.4.2 游離及固定化酶的最佳反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性

由圖12 可知，游離酶最佳反應(yīng)pH 為7.0，而固定化酶為8.0。對游離酶而言，與pH 為7.0 相比，pH增加至8.0、9.0、10.0 及11.0 時酶活顯著下降（P＜0.05），對固定化酶而言，與pH 為8.0 相比，pH 增加至9.0、10.0 及11.0 時酶活顯著下降（P＜0.05）。通過Zeta 電位分析，在固定化條件下（pH 為7.0），載體表面存在很多負(fù)電荷，電勢值為-13.67±0.55 mV，載體表面電荷分布不均會引起pH 的變化[33]。由于載體表面帶負(fù)電，會吸引反應(yīng)體系中的陽離子，造成固定化酶周圍H+濃度升高，呈酸性，為維持反應(yīng)體系中微環(huán)境的動態(tài)平衡，整個反應(yīng)體系要向堿性方向移動，因此固定化酶的最佳反應(yīng)pH 提高至8.0。同時，Suo 等[32]使用磁性ZIF-90 固定化脂肪酶，所得固定化酶最佳反應(yīng)pH 提高至7.5，而游離酶為7.0。除此之外，Zheng 等[23]在固定化柚苷酶的過程中發(fā)現(xiàn)，強酸和強堿會破壞酶與底物結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)，使二者不能有效結(jié)合，造成酶活的下降。

圖12 游離酶及固定化酶的最佳反應(yīng)pHFig.12 Optimum reaction pH of free and immobilized enzyme

由圖13 可知，與 pH 為 7.0 相比，在 pH 為 6.0的緩沖液中放置2 h 后，游離酶與固定化酶的酶活顯著下降（P＜0.05），均保持在各自初始酶活的60%左右。而在 pH 為分別為 9.0、10.0 及 11.0 的緩沖液中放置相同的時間，游離酶與固定化酶酶活均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，但固定化酶的pH 穩(wěn)定性強于游離酶，這可能是由于載體為酶分子提供了相對穩(wěn)定的微環(huán)境，可以更好地維持酶分子的空間構(gòu)象而有效保持酶活[34]。

圖13 游離酶及固定化酶的pH 穩(wěn)定性Fig.13 pH stabilities of free and immobilized enzyme

2.4.3 游離及固定化酶的最佳反應(yīng)時間 如圖14 所示，與反應(yīng)時間5 min 相比，當(dāng)反應(yīng)時間為10 min時，游離酶及固定化酶的酶活顯著上升（P＜0.05）。與反應(yīng)時間為10 min 相比，當(dāng)反應(yīng)時間增加至15 min，游離酶酶活顯著下降（P＜0.05）。進(jìn)一步延長反應(yīng)時間至25 min，游離酶及固定化酶的酶活均呈下降趨勢。這可能是由于PDA/PEI 涂層與酶的共價結(jié)合能夠保護(hù)酶活性中心[35]，因此固定化酶酶活的下降趨勢較游離酶緩慢，最優(yōu)條件下固定化酶酶活為484.42±5.97 U/g-載體。

圖14 游離酶及固定化酶的最佳反應(yīng)時間Fig.14 Optimum reaction time of free and immobilized enzyme

2.4.4 固定化酶的重復(fù)利用性 如圖15 所示，與第1 次循環(huán)相比，經(jīng)過5 次循環(huán)使用后，固定化酶酶活顯著下降（P＜0.05），但仍保留有50%以上的初始酶活。Maharani 等[36]以二氧化硅固定化脂肪酶，在5 次循環(huán)后，固定化酶酶活僅保留最初酶活的30.28%。劉振山等[37]制備出的脂肪酶雜化納米花在5 次循環(huán)之后僅能保持40%左右的酶活力。這些實驗結(jié)果表明，可能是由于多次攪拌、洗滌，使得酶分子從載體上脫落，造成固定化酶酶活的損失[38]。而本研究中的固定化酶在循環(huán)使用8 次后，仍保留有初始酶活的39.22%，說明貽貝仿生修飾策略能有效提高固定化酶的重復(fù)利用性。

圖15 固定化酶的重復(fù)利用性Fig.15 Reusability of immobilized enzyme

2.4.5 游離及固定化酶的儲藏穩(wěn)定性 如圖16 所示，與儲藏0 d 相比，固定化酶在4 ℃條件下儲存30 d后，其酶活顯著下降（P＜0.05），但仍有初始酶活的54.52%，而儲存后的游離酶酶活僅為初始酶活的33.63%。儲藏過程中，與游離酶相比，固定化酶酶活的變化趨勢較緩慢，這可能是因為載體表面貽貝仿生涂層對脂肪酶存在束縛作用，在長期儲存過程中保持了其活性構(gòu)象，可以有效減少儲藏過程中酶分子的失活[38]。

圖16 游離酶及固定化酶的儲藏穩(wěn)定性Fig.16 Storage stabilities of free and immobilized enzyme

2.5 固定化酶在催化乙酰丙酸與十二醇酯化反應(yīng)中的應(yīng)用

2.5.1 反應(yīng)溫度對乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率的影響 從圖17可以看出，乙酰丙酸的轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。與35 ℃相比，當(dāng)反應(yīng)溫度升高到40 ℃時，乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率顯著上升至52.96%（P＜0.05），這可能是因為溫度的升高促進(jìn)了產(chǎn)物合成[39]。而當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)增加到45、50、55 ℃，乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率下降，與40 ℃相比具有顯著性差異（P＜0.05）。溫度的升高可能造成固定化酶出現(xiàn)了一定程度的變性甚至失活，最終導(dǎo)致乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率降低。

圖17 反應(yīng)溫度對乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.17 Effect of reaction temperature on the conversion of levulinic acid

2.5.2 乙酰丙酸與十二醇的摩爾比對乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率的影響 從圖18 可以看出，與摩爾比為1:2.5 相比，摩爾為1:5 時，乙酰丙酸的轉(zhuǎn)化率由40.93%顯著提高至54.64%（P＜0.05），這主要是因為酯化反應(yīng)朝著正反應(yīng)的方向進(jìn)行。而繼續(xù)增加十二醇的含量，反應(yīng)體系中的固定化酶分子構(gòu)象發(fā)生了變化[20]，導(dǎo)致乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率降低。

圖18 乙酰丙酸與十二醇摩爾比對乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.18 Effect of the molar ratio of levulinic acid to n-laury alcohol on the conversion of levulinic acid

2.5.3 反應(yīng)時間對乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率的影響 由圖19可知，隨著反應(yīng)時間延長到21 h，乙酰丙酸的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，此時最大的乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率為75.94%。繼續(xù)延長反應(yīng)時間至24 h，與21 h 的實驗數(shù)據(jù)相比，此時乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率差異不顯著（P＞0.05）。因此，本實驗所得固定化酶催化條件為反應(yīng)溫度40 ℃、乙酰丙酸/十二醇的摩爾比1:5、反應(yīng)時間21 h，與王立暉等[20]的研究結(jié)果（構(gòu)建核殼結(jié)構(gòu)磁性樹枝狀纖維形有機硅材料，用于南極假絲酵母脂肪酶B 的固定化研究，所得固定化酶在50 ℃、乙酰丙酸/十二醇的摩爾比1:10、反應(yīng)時間22 h 條件下，催化乙酰丙酸的轉(zhuǎn)化率為85.05%）相比，本研究制備得到固定化酶在較低的催化溫度和較少的十二醇用量條件下，用較短的反應(yīng)時間，達(dá)到了較高的轉(zhuǎn)化率，不僅反應(yīng)條件溫和，且在一定程度上減低了反應(yīng)成本，具有良好的應(yīng)用前景。

圖19 反應(yīng)時間對乙酰丙酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.19 Effect of reaction time on the conversion of levulinic acid

3 結(jié)論

本研究通過探索載體與酶分子之間的構(gòu)效關(guān)系，實現(xiàn)了固定化酶的高效制備并應(yīng)用于催化酯化反應(yīng)。使用掃描電鏡觀察聚多巴胺/聚乙烯亞胺共沉積前后PGMA-OH 表面的變化，并用能譜檢測聚多巴胺/聚乙烯亞胺共沉積前后PGMA-OH 微球C、N、O 元素含量的變化，采用紅外光譜分析共沉積前后及固定化前后PGMA-OH 表面官能團(tuán)的變化，以證明PGMA-OH@PDA/PEI 的成功制備并成功固定化脂肪酶，Zeta 電位結(jié)果表明PGMA-OH@PDA/PEI 在pH 為7.0 時電勢值為-13.67±0.55 mV。最佳酶固定化條件為：固定化溫度為30 ℃，固定化pH 為7.0，固定化時間為5 h，初始酶活為337.76 U/mL，載體添加量為0.2 g。使用該固定化策略，固定化酶的最佳反應(yīng)溫度為50 ℃，最佳反應(yīng)pH 為8.0，最佳反應(yīng)時間為10 min，最優(yōu)條件下固定化酶酶活為484.42±5.97 U/g-載體。與游離酶相比，固定化酶的穩(wěn)定性有了明顯提高，在重復(fù)使用8 次之后，固定化酶仍有39.22%的初始酶活。進(jìn)一步將固定化酶用于催化乙酰丙酸與十二醇的酯化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)75.94%，通過固定化載體的設(shè)計構(gòu)建，為脂肪酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了新的技術(shù)路線和數(shù)據(jù)支持。