金 姝，張 斌，高 彤，扶 雄，黃 強(qiáng),

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640；2.廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司，廣東廣州 511445）

白蕓豆（Phaseolus vulgarisLinn），生物學(xué)名為多花菜豆，富含蛋白質(zhì)、多糖等多種營養(yǎng)成分[1]。目前對白蕓豆的研究主要集中在酶抑制劑、植物凝集素等成分的提取分離及其保健功能等方面[2-3]，加工過程會產(chǎn)生豆皮、豆渣等副產(chǎn)物，白蕓豆皮占全豆顆粒質(zhì)量的7.5%～8.0%，其細(xì)胞壁不溶性碳水化合物富含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等膳食纖維[4]，對其進(jìn)行綜合加工利用具有重要意義。

膳食纖維具有調(diào)節(jié)人體腸道微生物的種群豐度及腸道內(nèi)環(huán)境平衡等重要作用。其中不溶性膳食纖維不僅可以促進(jìn)腸道蠕動，增加排便，也能夠被腸道微生物所酵解，產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），進(jìn)而為腸道細(xì)胞提供營養(yǎng)，保護(hù)腸道健康[5]，近年來已有研究報道了一些果蔬和植物中不溶性膳食纖維的大腸發(fā)酵特性[6-7]。此外，不溶性膳食纖維中通常還含有結(jié)合酚類物質(zhì)，Saura-Calixto等[8]曾報道酚類等抗氧化劑可以以膳食纖維作為載體，通過氫鍵、疏水作用等與其聯(lián)接形成結(jié)合態(tài)酚類化合物，到達(dá)結(jié)腸后經(jīng)腸道菌群發(fā)酵釋放并被進(jìn)一步酵解轉(zhuǎn)化為小分子酚類物質(zhì)，在結(jié)腸內(nèi)發(fā)揮其抗氧化、抗炎等生理活性，幫助保護(hù)腸道健康。

盡管不溶性膳食纖維有諸多益處，但其質(zhì)地粗糙影響口感。通過微波、擠壓、超微粉碎技術(shù)等方法能夠有效改善其理化性質(zhì)，降低界面張力和空間位阻效應(yīng)，提升其口感和應(yīng)用價值。超微粉碎技術(shù)現(xiàn)已用于姜粉、黃芪粉、麥麩膳食纖維等的改性[9-10]，在粉碎的過程還會增加顆粒表面積，促進(jìn)多酚等抗氧化物質(zhì)的溶出釋放[11]。目前已有文獻(xiàn)報道了不同粒徑膳食纖維的發(fā)酵速率及SCFAs 產(chǎn)量等基礎(chǔ)的發(fā)酵動力學(xué)規(guī)律[12-13]，但關(guān)于粒徑對不溶性膳食纖維調(diào)節(jié)腸道菌群組成豐度的影響研究仍不夠充分，因此本研究以白蕓豆皮（whole skin powder，WS）為原料并提取得到其中的含結(jié)合酚不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber-bound phenolics，IB），將兩者分別經(jīng)過普通粉碎和超微粉碎得到不同粒徑的樣品，通過體外發(fā)酵實驗對比不同粒徑WS 和IB 的體外發(fā)酵特性，并探究其對腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用。本文將為后續(xù)對膳食纖維益生元效應(yīng)的研究提供基礎(chǔ)和方向，并可以指導(dǎo)白蕓豆皮的廢物利用和膳食纖維相關(guān)食品保健品的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白蕓豆皮 廣州酒家集團(tuán)利口福食品有限公司提供；低聚果糖 美國Ingredion 公司；中溫α-淀粉酶（EC 號：232-565-6；活性：10000 U/g）、胃蛋白酶（EC 號：232-629-3；活性：3000 U/mg）、胰酶（EC 號：232-468-9；活性：4000 U/g）上海麥克林生化科技股份有限公司；其他試劑或藥品均為分析純。

Dhg-9070（A）恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FW80 高速粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；XDW-6B 實驗室專用低溫超微粉碎機(jī)濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司；Mastersizer 3000 馬爾文粒度儀 英國Malvern 公司；EVO18 掃描電子顯微鏡 德國Zeiss 公司；Leica TCS SP5 激光共聚焦掃描顯微鏡 德國Leica Microsystems 公司；STA 8000同步熱分析儀 美國PerkinElmer 公司；BS201S 型電子分析天平 德國 Startorius 公司；MR-Hei-Tec型加熱型磁力攪拌器 德國Heidoiph 公司；LDZh-100KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械公司；HYQX-II 厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；7890A GC-FID 氣相色譜儀 美國Agilent公司；DYY-6C 型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；2720 型PCR 擴(kuò)增儀 美國Applied Biosystems 公司；E6090 型TBS-380 熒光計 北京原平皓生物技術(shù)有限公司；nova seqPE250 高通量測序儀美國 Illumina 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白蕓豆皮（WS）的粉碎改性 將濕豆皮原料清洗并去除雜質(zhì)后放入40 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干48 h，烘干后用高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎[10]，分別過200 目、40 目篩得到WS-200、WS-40，另取干豆皮用超微粉碎機(jī)在振幅5.5 mm、溫度0 ℃的條件下進(jìn)行干法振動式超微粉碎處理，并過500 目篩得到WS-500，將上述樣品裝進(jìn)密封袋，在室溫下儲存于干燥器中備用。

1.2.2 含結(jié)合酚不溶性膳食纖維（IB）的提取及其粉碎改性 IB 的提取參考Go 等[14]的連續(xù)酶法并進(jìn)行部分修改。將100.00±0.01 g WS 加入裝有1000 mL 85%乙醇溶液的燒杯中，在30 ℃下超聲除雜40 min，重復(fù)3 次，并用蒸餾水洗滌3 次。向上述處理的樣品中加入800 mL pH7.5 的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），用分散儀分散，調(diào)節(jié)pH 至1.5，加入3000 U/mg 的胃蛋白酶1.2 g 并在40 ℃下反應(yīng)1 h。將pH 調(diào)節(jié)至7.5 后加入4000 U 的胰酶并在37 ℃下消化4 h。消化后將酶解體系加熱至65 ℃處理40 min。然后加入800 mL 馬來酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），將pH 調(diào)節(jié)至6.9，添加10000 U/g 的中溫α-淀粉酶30 g 后在37 ℃下反應(yīng)16 h。將樣品在4500×g 離心10 min，沉淀用蒸餾水洗滌三次，真空冷凍干燥后得到IB。按上述WS 的粉碎方法將IB 進(jìn)行粉碎處理，得到IB-40、IB-200、IB-500，置于干燥器中備用。

1.2.3 WS 和IB 主要成分的分析 總淀粉含量的測定按照Megazyme K-TSTA 總淀粉檢測試劑盒方法；蛋白質(zhì)含量的測定參考GB 5009.9-2016 的凱氏定氮法；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量的測定參考NY/T 3494-2019 方法；多酚含量的測定參考Hossain等[15]的方法并做適當(dāng)修改，采用福林酚法，按沒食子酸當(dāng)量（mg GAE/g）測定；阿魏酸含量的測定采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16]。

1.2.4 樣品的結(jié)構(gòu)表征

普通高校社區(qū)學(xué)院，是近年來普通高校繼續(xù)教育學(xué)院服務(wù)當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)、開展社區(qū)教育的重要載體。普通高校社區(qū)學(xué)院以社區(qū)成員為主要教育對象，以非學(xué)歷教育培訓(xùn)為主要形式，以滿足社區(qū)成員文化教育需求為基本出發(fā)點和落腳點，具有顯著的公益性質(zhì)。

1.2.4.1 粒徑的測定 將樣品分散于蒸餾水中，用Mastersizer 3000 馬爾文粒度儀測定樣品的平均粒徑和比表面積，采用濕法進(jìn)樣，折射率為1.336[17]，測定時在3000 r/min 轉(zhuǎn)速攪拌、80%功率超聲條件下使樣品在蒸餾水中保持分散均勻。

1.2.4.2 微觀形貌的觀察 掃描電子顯微鏡觀察：分別取少量樣品于粘有導(dǎo)電膠的樣品臺上，經(jīng)過吹掃使其均勻分布，在真空狀態(tài)下，使用離子濺射鍍膜儀對其進(jìn)行噴金，樣品制備好后放入儀器內(nèi)，在800×放大倍數(shù)下觀察樣品。加速電壓為15 kV，工作距離（WD）為7.3 mm 左右；激光共聚焦顯微鏡觀察：室溫下在避光的環(huán)境中觀察不同樣品中結(jié)合酚。其中儀器的參數(shù)設(shè)置為：在10×物鏡下，使用405 Diode 激光源，并將發(fā)射波長設(shè)置為440～470 nm[18]。拍攝明場和熒光場疊加視角的照片。

1.2.5 體外發(fā)酵實驗

1.2.5.1 體外發(fā)酵條件 參考Wang 等[6]的方法進(jìn)行并作適當(dāng)修改。配制碳酸-磷酸鹽緩沖液，將其與實驗所需的其他材料一起放入高壓滅菌鍋中于121 ℃下滅菌20 min。然后趁熱向碳酸-磷酸鹽緩沖液中加入半胱氨酸鹽酸鹽并通入二氧化碳去除氧氣，放入?yún)捬跸溥^夜。準(zhǔn)確稱取干基50 mg 的WS 和IB 樣品于帶有橡膠塞的厭氧小瓶中，低聚果糖（fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）和不添加任何碳水化合物的厭氧瓶分別用作陽性和空白對照，然后與緩沖液一同轉(zhuǎn)入?yún)捬跸?。發(fā)酵所用的糞便樣本取自三位年齡介于20～30 歲之間、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）均在正常范圍內(nèi)（18.5 kg/m2＜BMI＜25 kg/m2）的健康志愿者，志愿者提前簽署知情同意書。在實驗當(dāng)天收集新鮮糞便樣品于無菌試管中并立即轉(zhuǎn)移到厭氧箱中，將三名志愿者的糞便混合與碳酸鹽-磷酸鹽緩沖液以1:3（w/v）的比例混合，然后通過四層紗布過濾得到糞便接種物溶液。將1 mL 糞便接種物溶液和4 mL 碳酸-磷酸鹽緩沖液分別加入?yún)捬跗恐?，用橡皮塞和鋁蓋封口后置于37 ℃水浴鍋中振蕩培養(yǎng)發(fā)酵并計時。

1.2.5.2 產(chǎn)氣量的測定 分別在發(fā)酵4、8、12、24和48 h 后，從水浴鍋中取出厭氧瓶，用帶有刻度的注射器扎入橡膠塞，根據(jù)注射器的位移刻度量測量發(fā)酵產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)。隨后打開橡膠塞停止厭氧微生物繼續(xù)反應(yīng)，然后分別收集發(fā)酵后的上清液和沉淀物并保存在-80 ℃以備后續(xù)測試。

1.2.5.3 短鏈脂肪酸含量的測定 解凍發(fā)酵后的上清液，利用氣相色譜法[19]分析樣品中短鏈脂肪酸的含量。將上清液在16000×g 轉(zhuǎn)速下離心10 min，吸取800 μL 上清液與200 μL 內(nèi)標(biāo)混合物（含50 mmol/L 4-甲基戊酸）于無菌離心管中混合均勻。通過配備有FID 檢測器的氣相色譜儀分析短鏈脂肪酸的種類和含量，所用色譜柱為極性ZB-FFAP 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。柱溫箱初始溫度設(shè)置為80 ℃，以8 ℃/min 的速度升到192 ℃，并在192 ℃下保持3 min。前進(jìn)樣口和前檢測器的溫度設(shè)置為230 ℃，以1 mL/min 的恒定流速輸送氮氣作為載體。根據(jù)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖中各類短鏈脂肪酸的保留時間確定樣品中短鏈脂肪酸的種類，再以脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品中4-甲基戊酸為內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)脂肪酸的峰面積之比為矯正因子，根據(jù)樣品中各短鏈脂肪酸的相對峰面積進(jìn)行定量。

1.2.5.4 DNA 提取和測序 解凍發(fā)酵后的沉淀物，參考試劑盒QIAamp?DNA Stool Mini Kit 的使用說明，將沉淀樣品在13000 r/min 下離心10 min，棄去上清液，使用磷酸鹽緩沖液將下層沉淀均質(zhì)化，然后將其轉(zhuǎn)移到盛有裂解液的管中，進(jìn)行DNA 提取。從沉淀樣品中提取細(xì)菌總DNA，儲存在-20 ℃下等待分析使用。通過分光光度計測定提取的DNA 濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度。選擇16S rRNA的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，整個反應(yīng)在Thermocycler PCR 系統(tǒng)中進(jìn)行，其主要程序包括：98 ℃下預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共包含25～27 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物使用Agencourt AMPure Beads 試劑盒進(jìn)行純化，其濃度通過雙鏈DNA定量檢測試劑盒測定。使用MiSeq Reagent Kit V3 試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，在Illumina MiSeq 平臺上機(jī)進(jìn)行雙端測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以重復(fù)測量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 19.0 版本對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)差異分析，采用Duncan 多重檢測綜合評價試驗組之間的差異（P＜0.05）。使用GraphPad Prism 7.0 版本進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 WS 和IB 的主要成分

WS 和IB 中的主要成分如表1 所示。WS 中的主要成分是不溶性膳食纖維，主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等[5]，其中纖維素和半纖維素含量較高，分別為28.64%±2.01%和32.65%±0.93%，木質(zhì)素的含量最低，僅為1.37%±1.40%。此外WS 中還含有19.49%的淀粉。經(jīng)過連續(xù)酶法提取得到的IB 中淀粉和蛋白質(zhì)的含量明顯降低了（分別為4.01%和0.51%），而纖維素的純度提高了約30.57%，說明中溫α-淀粉酶、蛋白酶和胰酶有效除去了WS 中的淀粉、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提高了不溶性膳食纖維的純度，該結(jié)果與刺梨果渣[6]的研究結(jié)果較為一致。WS 中多酚物質(zhì)的含量為1.848 mg GAE/g，而IB 中多酚含量相對較低，為1.598 mg GAE/g，且IB 中阿魏酸含量也降低了24.8 μg/g，這是由于在提取IB 的過程中除去了部分游離酚類物質(zhì)，造成阿魏酸等多酚含量的損失。

表1 WS 和IB 的主要成分Table 1 Main components of WS and IB

2.2 膳食纖維粒徑分布及比表面積

白蕓豆皮及其膳食纖維的粒徑分布如圖1 和表2 所示，從圖中可以出，所有樣品均只有一個明顯的粒徑分布峰，說明樣品顆粒尺寸分布較為均勻，且不同目數(shù)的樣品分別在20、110、500 μm 存在一個主峰，平均粒徑分布差異較為明顯。WS 和IB 的體積平均粒徑經(jīng)過普通粉碎后分別從575.00、480.67 μm 降到127.67、111.33 μm，經(jīng)過超微粉碎改性后的WS-500 和IB-500 則分別可以達(dá)到33.00、28.27 μm 左右（表1）。相同粒徑級分的WS 和IB其比表面積也有所不同，WS-40 的比表面積僅為18.24 m2/kg，顯著低于IB-40 的41.84 m2/kg（P＜0.05），這是由于WS 結(jié)構(gòu)完整，含有淀粉等成分，而IB 中大量的纖維狀結(jié)構(gòu)使其具有更大的比表面積[5]。隨著粒徑的減小，WS 和IB 的比表面積逐漸增大，值得注意的是WS-500 的比表面積顯著大于IB-500（P＜0.05），這可能是由于超微粉碎過程劇烈的撞擊破壞了IB 的微粒結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部的纖維狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[20]，比表面積的增大能夠使其具有更好的持水性、持油性、抗氧化活性等理化性質(zhì)[10]。

表2 不同樣品的粒徑分布和比表面積Table 2 Particle size and specific surface area of different samples

2.3 膳食纖維微觀形貌

六種樣品的微觀形貌如圖2 所示。從圖中可以看出，白蕓豆皮（WS）的微觀結(jié)構(gòu)較為完整致密，還有少量塊狀和球形顆粒，可能是豆皮中存在的淀粉等成分。而經(jīng)過連續(xù)酶法提取得到的不溶性膳食纖維（IB）中難以觀察到球狀的顆粒，說明連續(xù)酶法操作除去了豆皮中的淀粉、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，且IB 呈海綿狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有較多明顯的孔隙和通道，結(jié)構(gòu)疏松，與Zhang 等[21]觀察到的銀耳不溶性膳食纖維的形貌較為接近。隨著粒徑的降低，樣品顆粒明顯減小，WS-500 有較多的片狀結(jié)構(gòu)，有部分黏連；而IB-500 則有部分呈條形結(jié)構(gòu)，與IB-40 和IB-200 相比發(fā)生了明顯的破碎和裂解，這是由于在超微粉碎過程中的高速剪切、沖擊和研磨使得樣品劇烈碰撞，粒徑急劇減小[22]。比表面積的增大將使其在進(jìn)入結(jié)腸后提高腸道微生物對其的附著性和生物可及性，增強(qiáng)其可發(fā)酵特性[23]。

圖2 不同樣品的掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy image of different samples

六種樣品的激光共聚焦掃描顯微圖見圖3，圖中可觀察到不同粒徑大小樣品中所含結(jié)合酚的存在情況。阿魏酸是結(jié)合酚中的一種重要的酚酸，廣泛存在于植物中，且通常與細(xì)胞壁多糖等大分子物質(zhì)相結(jié)合，在405 nm 的激發(fā)波長下，阿魏酸能夠自發(fā)綠色熒光[24]。從圖中可以出，WS 和IB 兩種樣品中均存在一定含量的阿魏酸，IB 中的熒光較WS 稍弱，可能是在提取IB 過程中部分游離阿魏酸被除去。隨著粒徑的減小，兩類樣品中的綠色熒光都更為明顯，說明粉碎過程阿魏酸容易裸露于顆粒表面，分散更為均勻。因此，超微粉碎可以提高多酚的生物可及性，與文獻(xiàn)報道一致，即超微粉碎處理能夠破壞微粒結(jié)構(gòu)，促進(jìn)更多小分子活性物質(zhì)的溶出[22]。

圖3 不同樣品的激光共聚焦掃描顯微鏡圖Fig.3 Laser confocal scanning microscopy image of different samples

2.4 膳食纖維體外發(fā)酵產(chǎn)氣量和發(fā)酵速率

發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣量通?？梢宰鳛榘l(fā)酵速率的指標(biāo)[25]。圖4 展示了不同粒徑樣品在48 h 體外發(fā)酵過程中的產(chǎn)氣量。陽性對照FOS 產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率最高，短時間迅速產(chǎn)生較多的氣體容易引起腹脹等不適癥狀[19]。與FOS 相比，WS 和IB 中主要是不溶性膳食纖維等不易被酵解的成分，故樣品的產(chǎn)氣量相對較低，發(fā)酵速率較為平緩，這種緩慢的持續(xù)性發(fā)酵使得底物能夠逐漸進(jìn)入遠(yuǎn)端結(jié)腸并在此提供短鏈脂肪酸等能量和營養(yǎng)物質(zhì)[26]。

圖4 不同樣品體外發(fā)酵48 h 過程中的產(chǎn)氣情況Fig.4 Gas production during 48 h in vitro fecal fermentation time course

IB 的產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率均低于WS，即IB 比未處理的WS 具有更好的慢發(fā)酵特性，這是由于在WS 中淀粉等其他易被酵解的組分含量較高。從粒徑大小分析，WS 和IB 組內(nèi)三個樣品的產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率均為500 目＞200 目＞40 目，即粒徑越大的底物發(fā)酵速率越慢，而粒徑越小的底物因為具有更大的比表面積，即有更大的微生物-基質(zhì)界面[13]，且表面較為多孔、粗糙，更容易被腸道微生物附著和利用，發(fā)酵速率相對較快。

2.5 短鏈脂肪酸的組成和濃度分析

在大腸發(fā)酵過程中膳食纖維等底物會被腸道微生物發(fā)酵降解而產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸（SCFAs），SCFAs 可以降低結(jié)腸內(nèi)環(huán)境的pH，改善腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)，減少腸道粘膜的損傷，維持腸道健康[27]，所以其濃度可以用來表征膳食纖維的益生元活性[7]。不同粒徑樣品在48 h 體外發(fā)酵過程中短鏈脂肪酸的產(chǎn)量如圖5 所示，從圖中可以看出，WS 的產(chǎn)酸量均高于IB，兩組樣品隨著粒徑減小，產(chǎn)酸量提高，與產(chǎn)氣情況一致。FOS 作為陽性對照，乙酸產(chǎn)量始終最高，24 h 和48 h 時丙酸和丁酸的產(chǎn)量也顯著高于樣品組（P＜0.05）。與FOS 相比，前12 h 內(nèi)不同粒徑的WS 和IB 在產(chǎn)丙酸方面都有一定優(yōu)勢，從圖中可以看到前12 h 六種樣品的丙酸產(chǎn)量均高于FOS，該結(jié)果與之前的報道較為一致[6]，這是由于丙酸主要由膳食纖維中的葡萄糖、木糖、甘露糖等發(fā)酵而來，丙酸鹽能夠抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，還是一種有效的肝臟糖異生底物，對代謝健康產(chǎn)生積極影響[28]。不同粒徑IB 在丁酸產(chǎn)量上沒有明顯差異，而不同粒徑WS 丁酸產(chǎn)量差異顯著（P＜0.05），WS-500的丁酸產(chǎn)量顯著高于WS-200 和WS-40，造成兩組樣品差異的原因可能與其淀粉含量有關(guān)，IB 中淀粉含量較WS 中低（表1），而生淀粉顆粒在發(fā)酵過程中對丁酸產(chǎn)量的增加具有重要貢獻(xiàn)[19]，WS 粒徑越小，發(fā)酵速度越快，到達(dá)發(fā)酵平臺的時間越早，可以為微生物利用乙酸和乳酸交互共生提供足夠的時間，從而產(chǎn)生更多的丁酸[13]。

圖5 不同樣品體外發(fā)酵48 h 過程中產(chǎn)乙酸（A）、丙酸（B）、丁酸（C）和總酸（D）的情況Fig.5 Acetate (A),propionate (B),butyrate (C) and total SCFA(D) production during 48 h in vitro fecal fermentation time course

2.6 腸道菌群組成豐度

通過16s rRNA 基因測序，定量分析體外發(fā)酵48 h 后腸道菌群分別在門水平（A）和屬水平（B）上的組成豐度，結(jié)果如圖6 所示。從門水平上看，與空白組相比，F(xiàn)OS 顯著促進(jìn)了Actinobacteria 的豐度，而WS和IB 則對Bacteroidetes 豐度的增值效果更為明顯，同時也一定程度上促進(jìn)了Firmicutes 的相對豐度。FOS 作為陽性對照，具有公認(rèn)的益生元效應(yīng)，可以促進(jìn)多種Actinobacteria 的豐度[19]。從粒徑大小的對比來看，在WS 組中，隨著粒徑減小，F(xiàn)irmicutes 的相對豐度也逐漸增高，這一現(xiàn)象在IB 組中有一些差異，IB-200 組Firmicutes 的豐度高于IB-40，但I(xiàn)B-500 組中Firmicutes 的豐度反而有所下降，而Actinobacteria 的豐度顯著增加了，推測超微粉碎改性得到的IB-500 比表面積更大，更適合具有粘附能力的Actinobacteria 所粘附利用，從而快速生長[29]。

圖6 不同樣品體外發(fā)酵48 h 后腸道菌群在門水平（A）和屬水平（B）上的物種組成豐度Fig.6 Microbial community composition at the phylum level（A）and genus level（B）after 48 h in vitro fecal fermentation

在屬水平上，F(xiàn)OS 對Bifidobacterium豐度的促進(jìn)尤為明顯，這與之前的報道一致。Bifidobacterium作為一種重要的腸道有益菌可以促進(jìn)碳水化合物酵解轉(zhuǎn)化形成乳酸和乙酸[30]，這應(yīng)該是FOS 組具有較高的乙酸和丙酸含量的原因。與空白組相比，WS和IB 均促進(jìn)了Bacteroides的相對豐度，且WS 的促進(jìn)效果要優(yōu)于IB，Bacteroides是人體腸道菌群中一類最基本的降解多糖的菌屬，具有非常廣泛的糖化作用，能夠有效酵解部分難以消化的膳食纖維[6]。與WS 相比，IB 的優(yōu)勢顯示在對Ruminococcaceae ruminococcus和Lachnospira兩種菌屬豐度水平的促進(jìn)上，其中Ruminococcaceae ruminococcus可以發(fā)酵不溶性膳食纖維中的纖維二糖和纖維素并產(chǎn)生乙酸和丁酸[6]。從粒徑角度分析，WS 和IB 兩組樣品對Bacteroides的促進(jìn)效果均呈現(xiàn)出粒徑越小，促進(jìn)效果越好的趨勢。值得注意的是，與WS-200 和IB-200 相比，在WS-500 和IB-500 組中均觀察到Ruminococcaceae ruminococcus和Lachnospira相對豐度的降低，尤其是Lachnospira，這可能說明不同的菌屬對于底物粒徑的選擇有不同的偏好[31]，Lachnospira可能更偏向于利用粒徑適中的底物。此外，IB-500 對Bifidobacterium豐度也有一定的促進(jìn)作用，且該效果明顯高于IB-40 和IB-200。益生菌菌株與膳食纖維的相互作用是其發(fā)揮益生效果的一個重要因素，Bifidobacterium對膳食纖維有很大的粘附力，對纖維素的粘附機(jī)制主要涉及疏水相互作用和靜電相互作用[32]，因此IB-500 可能因其粒徑較小，比表面積較大，增強(qiáng)了其與Bifidobacterium的粘附作用，進(jìn)一步顯著促進(jìn)了Bifidobacterium的豐度。

2.7 ASV 水平腸道菌群豐度分析

各樣品在體外發(fā)酵48 h 后腸道菌群中最豐富的ASVs 和關(guān)鍵ASV（綠色顯示）的組成差異在聚類熱圖（圖7）中進(jìn)行了更直觀的展示。與空白組相比，F(xiàn)OS 明顯提高了ASV9013、ASV8209、ASV13871 和ASV189 這四個ASV 的相對豐度。6 個樣品組的顏色區(qū)域與空白組和FOS 組相比均有明顯不同，表明WS 和IB 的酵解顯著改變了腸道菌群的組成。從圖中可以注意到WS 和IB 的發(fā)酵在降低了ASV18112、ASV21919、ASV9013、ASV542 和ASV8209 幾個ASV 的同時顯著提高了unidentified Lachnospiraceae ASV168 和 unidentified Clostridiales ASV16610、ASV4234 和ASV4936 的相對豐度（P＜0.05）。兩組樣品相比，WS 還促進(jìn)了BacteroidesASV26058、ASV6075、ASV9536 的相對豐度，IB 則顯示出對unidentified Lachnospiraceae ASV26400、LachnospiraASV13961 以 及RuminococcusASV6393 等ASV 的促進(jìn)。隨著粒徑的減小，WS 和IB 組中ASV168、ASV16610、ASV4234 和ASV4936 等幾個ASV 的熱圖顏色均越深，說明粒徑越小，WS 和IB 對上述ASV 的豐度增加越顯著（P＜0.05）。值得注意的是，unidentified Lachnospiraceae ASV26400和LachnospiraASV13961 兩個ASV 的豐度變化有所不同，WS-500 和IB-500 相比于WS-200 和IB-200均使其相對豐度顯著下降（P＜0.05），這也與屬水平上觀察到的現(xiàn)象相符，這可能是由于Lachnospira中的不同種科類其對于底物顆粒大小有不同的偏好[31]。與之相反，只有WS-500 和IB-500 的發(fā)酵促進(jìn)了BacteroidesASV13871 的相對豐度，且IB-500 的促進(jìn)效果更為顯著（P＜0.05），粒徑較大的40 目組和200 目組均沒有促進(jìn)效果，前期研究表明，B.uniformis會趨向于在較小顆粒的玉米麩皮顆粒上聚集[31]。此外，只有IB-500 顯著提高了BifidobacteriumASV189 的相對豐度，這與屬水平上IB-500 顯著促進(jìn)Bifidobacterium相對豐度的結(jié)果一致，表明不同種屬的腸道微生物對底物的粒徑有不同的偏好。

圖7 不同樣品體外發(fā)酵48 h 后腸道菌群ASV 水平物種豐度熱圖Fig.7 Heatmap of the microbial community composition at ASV level after 48 h in vitro fecal fermentation

2.8 腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的PCA 圖分析

針對上述不同樣品體外發(fā)酵48 h 后腸道微生物群落的差異，PCA 圖（圖8）給出了更為直觀的主成分分析結(jié)果。前兩個主成分捕獲了81.25%的微生物群落變異（PC1：56.98%，PC2：24.27%）。FOS 與BifidobacteriumASV9013 顯著相關(guān)（P＜0.05），與前述分析一致。WS 組和IB 組相比，相同粒徑下的IB 對PhascolarctobacteriumASV559 和RuminocccusASV6393 的貢獻(xiàn)均比WS 更大，這可能是由于IB 中的膳食纖維純度更高，更有利于促進(jìn)有益菌的生殖，即具有更好的益生效應(yīng)[33]。從粒徑大小分析，WS-40 與 WS-200 以及 IB-40 與 IB-200 在 PCA圖中均沒有顯著分離，都與ASV26400、ASV559、ASV6393 有關(guān)；而WS-500 和IB-500 則產(chǎn)生了明顯的分離，說明粒徑的急劇減小對于微生物群落變異有顯著的影響，與Yao 等[13]對多種不同粒徑膳食纖維（谷物、豆類、堅果、蔬菜、水果和麩皮）的研究結(jié)果一致，即不同粒徑底物的發(fā)酵結(jié)果不同，且粒徑對不同化學(xué)成分膳食纖維底物的發(fā)酵結(jié)果的影響也不一致。粒徑接近的WS-500 和IB-500 就產(chǎn)生了不同的發(fā)酵結(jié)果，WS-500 與unidentified Lachnospiraceae ASV168 和unidentified Clostridiales ASV4234 高度相 關(guān)，而 IB-500 則 與BacteroidesASV13871 和BifidobacteriumASV189 高度相關(guān)，具有更為顯著的益生效果。其中Bacteroides不僅能夠通過多糖利用位點（polysaccharide utilization loci，PULs）來編碼多糖降解系統(tǒng)的基因簇來降解半纖維素等，還可以使用PUL 機(jī)制參與與其相鄰微生物Eubacterium ramulus之間的交互共生關(guān)系[34]。由于IB 含有結(jié)合酚，所以當(dāng)Bacteroides利用其多糖部分將葡萄糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化為丁酸的同時還能促使Eubacterium ramulus降解黃酮類化合物，這種PUL 介導(dǎo)的種間互生過程不僅有利于腸道微生物獲得所需的營養(yǎng)物質(zhì)，對人類腸道健康也可能起到有益的作用[35]。相同粒徑大小的IB 較WS 具有更好的、更為明確的益生元活性，促進(jìn)有益菌的生殖，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖8 不同樣品體外發(fā)酵48 h 后腸道菌群ASV 水平的主成分分析Fig.8 PCA analysis of the microbial community composition at ASV level after 48 h in vitro fecal fermentation

3 結(jié)論

經(jīng)過超微粉碎后，WS 和IB 的粒徑急劇減小，比表面積顯著增大，其中的結(jié)合酚更均勻地分散于顆粒表面。體外發(fā)酵實驗證明了WS 和IB 都具有慢發(fā)酵性，可以產(chǎn)生豐富的乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，其發(fā)酵速率和產(chǎn)酸量均隨著粒徑的減小而提高，且WS的發(fā)酵速率和產(chǎn)酸量均高于對應(yīng)粒徑的IB。菌群組成分析發(fā)現(xiàn)粒徑越小的WS 和IB 對Bacteroides豐度的促進(jìn)效果也越顯著，但是部分有益菌對底物粒度表現(xiàn)出不同的偏好，其中Lachnospira傾向于在較大粒徑的樣品組中增殖。IB 中膳食纖維的純度更高，使得相同粒徑分級下IB 對腸道菌群組成的正向調(diào)控作用比WS 更為顯著，可以促進(jìn)Bacteroides、Bifidobacterium和Ruminococcaceae ruminococcus等有益菌的相對豐度。底物成分和粒徑大小會共同決定發(fā)酵結(jié)果，在實際應(yīng)用中應(yīng)該選擇膳食纖維含量更高的底物，并通過粉碎方法適當(dāng)降低其粒徑以獲得更好的益生效應(yīng)。