張俊鵬，劉文婷，石 甜，王華娟，王宏勛，周 敏,

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430000；2.武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430000）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種常見于河口和海洋環(huán)境的革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌。食用未加工成熟的海產(chǎn)品是人類感染副溶血性弧菌的主要原因[1]。近年來海鮮類食品在市場廣泛流通，導(dǎo)致該菌由沿海向內(nèi)陸傳播蔓延，甚至超過沙門氏菌和志賀氏菌，成為腹瀉的首要病原菌[2]。在過去的幾十年里，由于抗生素的過度使用，副溶血性弧菌中出現(xiàn)了抗生素耐藥性[3]。因此，迫切需要既安全又對消費(fèi)者友好的新的控制方法。

噬菌體是細(xì)菌病毒，在自然界中廣泛存在，目前噬菌體在副溶血弧菌控制方面已有多篇報(bào)道。袁琳等[4]研究了噬菌體SHOU24 對即食對蝦中副溶血性弧菌的抑制效果，結(jié)果表明，經(jīng)噬菌體處理的副溶血性弧菌的生長延滯期增長了4.04 h，噬菌體在常溫條件下能使即食蝦中副溶血性弧菌的濃度下降1 個數(shù)量級，噬菌體SHOU24 可顯著降低即食對蝦中的副溶血性弧菌數(shù)量。鄭小雙等[5]評價(jià)了副溶血性弧菌噬菌體VppMIX 的抑菌效果，結(jié)果顯示在25 ℃恒溫保藏12 h 后，不同劑量噬菌體VppMIX 處理的黃魚樣品中副溶血性弧菌數(shù)量比對照組降低了1.41～4.98 lgCFU/g。可見噬菌體十分適合用于海產(chǎn)品等易腐敗食品中主要病原菌的控制。

目前，已報(bào)道的副溶血性弧菌裂解性噬菌體數(shù)量有限，為了豐富該致病菌的噬菌體庫，本研究以10 株實(shí)驗(yàn)室保存的副溶血弧菌為宿主菌，從湖北省武漢不同地點(diǎn)采集的樣品中分離烈性噬菌體，分析其形態(tài)、裂解譜、一步生長曲線、pH 及溫度穩(wěn)定性等生物學(xué)特征，進(jìn)行基因組比較，并以人工污染的基圍蝦作為模型，研究噬菌體在貯藏溫度下對模擬污染蝦肉的抑菌效果，為開發(fā)噬菌體抑制劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

23 株副溶血弧菌分離株 武漢輕工大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室，其中ATCC17802 為食品源標(biāo)準(zhǔn)菌株，F(xiàn)6、F7、F22、F23 來源于食品，Vp27、Vp33、Vp41、Vp44、460、461、469、470、474、475、485、486、O56、O514 來源于病人，H128、H256、H512 為抗生素誘導(dǎo)株。選取其中10 株細(xì)菌用于分離副溶血弧菌噬菌體；蝦肉樣品 武漢常青花園武商量販、常青花園菜市場、盒馬鮮生（武漢太和里店）；TCBS 瓊脂 青島海博生物技術(shù)有限公司；Agar 瓊脂粉 飛揚(yáng)生物有限公司；酵母提取素、胰蛋白胨 北京瑞達(dá)恒輝公司；氯化鈉、無水乙醇 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；96 孔微量培養(yǎng)板 美國康寧公司；0.22 μL 針頭過濾器 天津津騰公司；一次性注射器 金塔有限公司；DNaseⅠ、RNase A、蛋白酶K Takara 公司。

DRP-9062 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-9053A 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-25 pH 計(jì)、CP214 型電子天平 奧豪斯儀器公司；S4OPL201 超純水機(jī) 上海樂楓科技有限公司；Mini 15K 離心機(jī)杭州奧盛儀器有限公司；DB150L 高壓滅菌鍋 北京亞歐德鵬科技有限公司；CMBR 全自動生長曲線分析系統(tǒng) 芬蘭Bio screen。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噬菌體的分離與純化 取蝦肉樣品25 g 加入225 mL 生理鹽水，均質(zhì)2 min，混合液以5000 r/min離心10 min，取5 mL 上清液加入5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，同時(shí)分別加入100 μL 處于對數(shù)生長期的10 株副溶血弧菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h 后5000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜，濾液經(jīng)10 倍梯度稀釋后與宿主菌混合，使用雙層平板法[6]，37 ℃培養(yǎng)6～8 h 檢測噬菌斑。挑取單個空斑至1 mL SM 緩沖液中，4 ℃過夜，用SM 緩沖液稀釋噬菌體液，取適宜梯度加入宿主菌制成雙層平板，37 ℃培養(yǎng)6～8 h，重復(fù)培養(yǎng)5 次，得到純化噬菌體。

1.2.2 噬菌體效價(jià)測定 純化的噬菌體液進(jìn)行10 倍稀釋，將10-5、10-6及10-7的噬菌體液100 μL 分別與100 μL 對數(shù)期的宿主菌混合，利用雙層平板法[6]觀察噬菌斑的個數(shù)。

噬菌體效價(jià)（PFU/mL）=噬菌斑數(shù)量×稀釋倍數(shù)×10

1.2.3 噬菌體透射電鏡觀察 參考Ramírez-Orozco等[7]方法，采用磷鎢酸負(fù)染法進(jìn)行透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)，并利用軟件Digital Micrograph Demo 3.9.1測量噬菌體頭部直徑和尾長。

1.2.4 噬菌體宿主譜測定 使用點(diǎn)斑法測定噬菌體的宿主譜[8]，取3.7 mL LB 半固體培養(yǎng)基加入0.1 mL宿主菌（109CFU/mL），顛倒混勻后傾倒在固體培養(yǎng)基上，待凝固后，滴加噬菌體懸液（109PFU/mL）10 μL，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～12 h，觀察裂解圈的形成。

1.2.5 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）按照不同的MOI 值（0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000）將噬菌體與宿主菌混合，對不同MOI 值的噬菌體效價(jià)進(jìn)行測定[6]，效價(jià)最高的MOI值則為噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)。

1.2.6 噬菌體的一步生長曲線 將噬菌體原液與宿主菌以最佳感染復(fù)數(shù)混合，在37 ℃水浴鍋中溫浴10 min，使噬菌體盡可能多地吸附到宿主菌上。將混合液4 ℃、8000 r/min 離心2 min，棄上清液使用等體積LB 培養(yǎng)基（3% NaCl）重懸，重懸2 次，取1 mL重懸液加入到9 mL LB 培養(yǎng)基（3% NaCl）。從0 min開始，每隔10 min 取500 μL 于4 ℃、8500 r/min 離心2 min，測定噬菌體效價(jià)[6]。

1.2.7 噬菌體的熱穩(wěn)定性 提前準(zhǔn)備不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）的水浴鍋，將噬菌體原液稀釋到107PFU/mL，取1 mL 噬菌體原液于1.5 mL 離心管中，將離心管放入不同溫度的水浴鍋中溫浴。從0 min開始，每隔30 min 測定離心管中噬菌體效價(jià)[6]。

1.2.8 噬菌體的pH 穩(wěn)定性 提前準(zhǔn)備不同pH 的PBS 緩沖液，將100 μL 噬菌體效價(jià)為107PFU/mL的噬菌體原液加入到900 μL 預(yù)先準(zhǔn)備好的不同pH的PBS 緩沖液中，使得混合后體系的最終pH 分別為（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13），于37 ℃水浴鍋中溫浴2 h。使用雙層平板法測定噬菌體效價(jià)[6]。

1.2.9 噬菌體全基因組提取和功能基因分析 噬菌體全基因組提取采用苯酚-氯仿法，具體步驟參考文獻(xiàn)[9]。委托上海澤塔公司對提取的噬菌體474x1基因組進(jìn)行全基因組測序，并對噬菌體基因組進(jìn)行拼接，得到完整的基因組序列。使用DNA Statistics（http://www.geneinfinity.org/sms/sms_dnastats.html）對噬菌體基因組序列進(jìn)行分析，包括四種堿基的組成比例、GC 平均含量。使用JSpeciesWS（https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/）對從NCBI 數(shù)據(jù)庫上下載的10 株弧菌噬菌體全基因組完整序列進(jìn)行平均核苷酸同一性（ANI）統(tǒng)計(jì)，得到矩陣。使用微生信在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_matrix_heatmap_064）繪制熱圖。使用RAST 在線注釋工具（https://rast.nmpdr.org/）對全基因序列進(jìn)行基因預(yù)測。使用tRNAscan-SE（https://www.swmath.org/software/8005）在線工具預(yù)測全基因組中有無tRNA 基因。使用NCBI 數(shù)據(jù)庫的BLASTn 對預(yù)測的各個基因進(jìn)行逐個檢索分析，推測其基因功能。用BRIG（0.95）軟件繪制基因組圈圖。使用VFDB數(shù)據(jù)庫（https://www.mgc.ac.cn/VFS/）預(yù)測噬菌體474x1 基因組中可能存在的毒力基因，使用CARD數(shù)據(jù)庫（https://card.mcmaster.ca/）預(yù)測基因組中可能存在的抗生素抗性基因。使用MEGA 7.0 軟件建立基于末端酶大亞基的進(jìn)化樹，分析噬菌體474x1 的親緣性。

1.2.10 噬菌體對基圍蝦中副溶血性弧菌的抑制作用參考葛強(qiáng)等[10]的實(shí)驗(yàn)步驟稍作改進(jìn)，將購買的新鮮蝦去殼，用無菌刀將蝦肉切為1 cm×1 cm 的樣品，重約1 g，將肉樣煮沸30 min 后置于無菌平皿中。在樣品中接種100 μL 1.0×105lgCFU/mL 副溶血性弧菌474，于超凈臺中風(fēng)干10 min 使其吸附后用封口膜封住，作為對照組。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)在副溶血性弧菌474 吸附后另外分別接種100 μL 1.0×108lgCFU/mL（MOI=1000）和100 μL 1.0×109lgCFU/mL（MOI=10000）的噬菌體懸液，常溫條件下靜置10 min 使其吸附后用封口膜封住。將樣品置于4 ℃，在第0、3、6、9、12 h 分別取樣，將樣品放入10 mL 離心管中，加入5 mL 生理鹽水，3000 r/min 離心10 min，使蝦肉沉淀，取上清液進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋，取1 mL 稀釋液采用平板計(jì)數(shù)法檢測蝦肉中副溶血性弧菌的菌量，從而檢測噬菌體的抑菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 計(jì)算數(shù)據(jù)平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差、Origin 2022 進(jìn)行折線圖繪制和IBM SPSS Statistics 23 的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌噬菌體形態(tài)學(xué)特征

以副溶血弧菌474 菌株為宿主菌從海鮮市場基圍蝦樣品中成功分離出1 株裂解性較強(qiáng)副溶血弧菌噬菌體，命名為474x1。培養(yǎng)后474x1 可在474 菌株的菌苔上形成清晰、透明的噬菌斑，直徑1.5～2 mm（圖1）。電鏡下觀察噬菌體的頭部呈六邊形，直徑約70.8 nm，尾長約18.3 nm。具有典型的有尾噬菌體目短尾病毒科病毒形態(tài)特征（圖2）。

圖1 副溶血弧菌噬菌體474x1 噬菌斑形態(tài)Fig.1 Plaque morphology of V.parahaemolyticus phage 474x1

圖2 副溶血弧菌噬菌體474x1 透射電鏡形態(tài)Fig.2 Transmission electron microscope morphology of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.2 副溶血弧菌噬菌體474x1 宿主譜

副溶血弧菌噬菌體474x1 宿主譜如表1。噬菌體474x1 能夠裂解23 株副溶血弧菌中的19 株（19/23=82.61%），表明噬菌體474x1 對耐藥副溶血弧菌具有良好的裂解能力。

表1 副溶血弧菌噬菌體474x1 宿主譜Table 1 Host range of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.3 副溶血弧菌噬菌體474x1 最佳感染復(fù)數(shù)

表2 為副溶血弧菌噬菌體474x1 效價(jià)測定結(jié)果。當(dāng)MOI 為0.01 時(shí)，噬菌體效價(jià)達(dá)到最大為9.66 lgPFU/mL，說明噬菌體474x1 在感染副溶血弧菌474 時(shí)，噬菌體與宿主菌的數(shù)量的比值為0.01 時(shí)，可增殖最多的噬菌體。

表2 副溶血弧菌噬菌體474x1 的最佳感染復(fù)數(shù)Table 2 Multiplicity of infection of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.4 副溶血弧菌噬菌體474x1 一步生長曲線

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)體系中噬菌體效價(jià)的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制噬菌體的一步生長曲線。如圖3 所示，噬菌體474x1 的潛伏期為10 min，裂解期為10～90 min，裂解末期噬菌體效價(jià)達(dá)到8.81 lgPFU/mL，裂解量為115 PFU/cell。

圖3 副溶血弧菌噬菌體474x1 一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.5 副溶血弧菌噬菌體474x1 熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性

噬菌體對溫度的敏感性如圖4 所示，474x1 在30～50 ℃的范圍內(nèi)活性穩(wěn)定，70 ℃時(shí)其活性迅速下降，30 min 被完全滅活；60 ℃孵育1 h 后效價(jià)可減少1 個數(shù)量級。474x1 的效價(jià)在pH4～11 之間均較穩(wěn)定，但pH＞11 和pH＜4 條件下孵育2 h 后活性喪失（圖5）。

圖4 副溶血弧菌噬菌體474x1 熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of V.parahaemolyticus phage 474x1

圖5 副溶血弧菌噬菌體474x1 pH 穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.6 副溶血弧菌噬菌體474x1 全基因組DNA 的提取

使用苯酚-氯仿法提取了噬菌體474x1 全基因組DNA，用超微量分光光度計(jì)測定提取的噬菌體474x1 DNA 終濃度為220 ng/mL 且OD260/280為1.88，說明提取出的DNA 濃度適宜且含有的雜質(zhì)較少，滿足測序要求。

噬菌體474x1DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖6 所示，可以發(fā)現(xiàn)DNA 電泳條帶單一無其它條帶，且DNA 分子量較大，說明完整地提取出了噬菌體474x1 的基因組DNA。

圖6 噬菌體474x1 的全基因組提取Fig.6 Extraction of whole genome DNA of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.7 副溶血弧菌噬菌體474x1 全基因組分析

噬菌體474x1 的基因組長度為47830 bp，堿基分布情況為A（30.42%）、T（29.16%）、C（20.45%）、G（19.96%），GC 平均含量為40.41%。噬菌體474x1全基因組序列BLASTn 比較結(jié)果顯示，噬菌體474x1 與副溶血弧菌噬菌體Vp41s3（索引號：MZ0 73369.1）有較高的同源性，同源性99.06%，覆蓋率為77%。但與其他弧菌噬菌體同源性均小于80%，如與霍亂弧菌噬菌體ICP2（索引號：HQ641345.1）同源性為78.55%，與創(chuàng)傷弧菌噬菌體Saratov-15（索引號：MT767883.1）同源性為78.45%。ANI 熱圖顯示474x1 與副溶血弧菌噬菌體Vp41s3 同源性最高（同一性×覆蓋率=73%），但與其他噬菌體基因組同源性均小于50%（圖7）。

圖7 平均核苷酸同源性熱圖Fig.7 Average nucleotide identity heatmap

2.8 副溶血弧菌噬菌體474x1 基因組功能基因注釋

使用RAST 在線注釋工具進(jìn)行功能基因注釋。結(jié)果顯示，噬菌體474x1 基因組共有69 個開放閱讀框（open reading frame，ORFs），其中有24 個ORFs位于正鏈上，45 個ORFs 位于負(fù)鏈上。基因組長度為47830 bp，最長的ORFs 為4245 bp，最短的僅126 bp，平均長度643 bp。ORFs 總長為44376 bp，占全長的92.78%。經(jīng)BLAST 比對，推測出的69個ORFs 中有14 個ORFs 已確定功能。通過這些特征基因功能將其分為4 個模塊，包括DNA 復(fù)制與調(diào)控模塊（ORF29、ORF35、ORF36、ORF39、ORF45、RF47、ORF49、ORF51、ORF54、ORF55）、DNA包裝模塊（ORF4、ORF5）、結(jié)構(gòu)模塊（ORF1）、附加功能模塊（ORF32）。除了這14 個具有特定功能的基因外，其他的ORFs 都為假定蛋白，約占79.71%，其基因組圖譜如圖8 所示。采用tRNAscan-SE 篩查全基因組中無tRNA 基因，表明474x1 依賴宿主翻譯。通過VFDB 數(shù)據(jù)庫和CARD 數(shù)據(jù)庫預(yù)測噬菌體474x1 基因組不含毒力基因與抗生素抗性基因。因此，該結(jié)果表明噬菌體474x1 應(yīng)用于食源性致病菌防控的安全性。

圖8 噬菌體474x1 的基因組圖譜Fig.8 Genomic map of phage 474x1

2.9 副溶血弧菌噬菌體474x1 進(jìn)化樹分析

基于噬菌體474x1ORF4 末端酶大亞基構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖9 所示，副溶血弧菌噬菌體474x1 與副溶血弧菌噬菌體Vp41s3（短尾噬菌體）在同一個進(jìn)化分支上，另外與霍亂弧菌噬菌體ICP2，創(chuàng)傷弧菌噬菌體Saratov-12、Saratov-15 形成一簇，有著很近的親緣關(guān)系。

圖9 基于末端酶大亞基構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree constructed based on terminal enzyme large subunit

2.10 噬菌體對基圍蝦中副溶血性弧菌的抑制作用

蝦肉在4 ℃放置12 h，副溶血弧菌濃度變化如圖10A 所示。在放置期間，接種5 lgCFU/mL 細(xì)菌的對照組菌量沒有明顯增長，從第0 h 的3.73 lgCFU/mL 下降到第12 h 的3.55 lgCFU/mL。實(shí)驗(yàn)組的菌量相比于對照組在12 h 內(nèi)均有明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），MOI=1000 實(shí)驗(yàn)組在第3 h 相較對照組菌量下降了0.39 lgCFU/mL，MOI=10000 實(shí)驗(yàn)組在第12 h 相較對照組菌量下降了0.92 lgCFU/mL，具有極顯著性差異（P＜0.01）。

圖10 副溶血弧菌噬菌體474x1 對蝦肉中副溶血弧菌抑菌效果實(shí)驗(yàn)Fig.10 Bacteriostatic effect of phage 474x1 on V.parahaemolyticus in prawn meat

蝦肉在25 ℃放置12 h，副溶血弧菌濃度變化如圖10B 所示。在放置期間，接種5 lgCFU/mL 細(xì)菌的對照組菌量呈穩(wěn)步增長的趨勢，在第12 h 增長到5.66 lgCFU/mL。實(shí)驗(yàn)組的菌量相比于對照組在12 h 內(nèi)均有明顯下降，MOI=1000 實(shí)驗(yàn)組在第6 h 相較對照組菌量下降了1.04 lgCFU/mL，MOI=10000在第6 h 相較對照組菌量下降了1.82 lgCFU/mL，具有極顯著性差異（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)已有學(xué)者相繼分離出副溶血弧菌烈性噬菌體，丁云娟等[11]從水產(chǎn)品市場的污水中分離出來一株烈性噬菌體qdvp001，彭勇等[12]從青島岸邊海水中分離出兩株副溶血弧菌噬菌體VPp2、VPp3。本實(shí)驗(yàn)室周敏等[13]從海鮮內(nèi)臟、污水中分離出一株烈性噬菌體F23s1。本實(shí)驗(yàn)也從基圍蝦樣品中分離出寬譜噬菌體474x1，對研發(fā)生物抑菌劑有重要價(jià)值。

本研究中，宿主譜的結(jié)果表明474x1 能夠裂解23 株耐藥副溶血弧菌中的19 株，表現(xiàn)出較寬的裂解譜范圍，宿主譜的差異可能是由于細(xì)菌細(xì)胞表面存在的受體的差異影響了噬菌體的吸附[14]。此外，噬菌體吸附具有高度特異性，這也意味著噬菌體對其他細(xì)菌是無害的，特別是那些有益的菌群。這也表明，474x1可以在未來用于防治特定的細(xì)菌性疾病，如弧菌病。

MOI 指的是噬菌體與宿主菌的比率。不同的噬菌體感染和殺滅細(xì)菌的方式不同，因此具有不同的最佳MOI。例如兩株副溶血性弧菌裂解噬菌體VB_VPS_BA3 和VB_VPS_CA8，最佳MOI 為0.1[15]。Ibrahim 等[16]對一株能夠裂解溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌的烈性噬菌體PhVh6 測定的最佳MOI為1。在本研究中，噬菌體增殖的最佳MOI 為0.01，表明以較低數(shù)量噬菌體感染宿主菌時(shí)，最終能獲得高效價(jià)的噬菌體，在生產(chǎn)中可用較低的成本得到大量噬菌體。

研究噬菌體的一步生長曲線可以發(fā)現(xiàn)噬菌體的生長規(guī)律[17]。挑選出潛伏期短裂解量大的噬菌體，對提高工業(yè)生產(chǎn)有巨大意義。474x1 的潛伏期與噬菌體VppYZU92[5]相似，后者的潛伏期較短為10 min，裂解量為35 PFU/cell。另一株噬菌體VppYZU64的潛伏期較長為35 min，但裂解量為150 PFU/cell[5]。在本研究中，474x1 的潛伏期較短且裂解量偏大，為10 min 和115 PFU/cell，十分適合規(guī)?；苽?。

在各種脅迫條件下對噬菌體效價(jià)穩(wěn)定性的測定結(jié)果有助于為噬菌體在細(xì)菌控制中的應(yīng)用提供參考[18-19]。在本研究中，測定了噬菌體對溫度和pH 的抵抗力，以確定這些噬菌體對副溶血性弧菌感染的生防效果。溫度是影響噬菌體存活的一個重要因素[20]。它在噬菌體的附著、穿透和增殖過程中起著重要作用[21]。在本研究中，474x1 在50 ℃下穩(wěn)定，在60 ℃孵育1 h 后效價(jià)下降，在70 ℃以上30 min 后完全失活，當(dāng)應(yīng)用于食品粗加工環(huán)境中時(shí)，它仍然可以存活。此外，環(huán)境的酸堿度會影響噬菌體的穩(wěn)定性[19]。據(jù)報(bào)道，低pH 影響噬菌體聚集，降低其在細(xì)菌細(xì)胞上的吸附能力[22]。474x1 在較寬的pH 范圍保持高效價(jià)，與vap04 相似[23]。

本實(shí)驗(yàn)選擇了2 種貯藏溫度，其中，4 ℃代表保藏溫度，25 ℃代表室溫。4 ℃下副溶血弧菌菌量均低于25 ℃下同一時(shí)間點(diǎn)菌量，這可能是因?yàn)榈蜏貢种聘比苎【纳L。隨著貯藏時(shí)間的延長，25 ℃下MOI=1000 和MOI=10000 實(shí)驗(yàn)組中的菌量均明顯下降，在第12 h 時(shí)實(shí)驗(yàn)組中副溶血性弧菌數(shù)量分別比對照組降低0.18、0.87 lgCFU/mL，說明噬菌體474x1 能夠顯著（P＜0.01）抑制宿主菌的生長，但不能完全殺滅副溶血弧菌。高璐[23]在噬菌體對魚汁的抑菌實(shí)驗(yàn)中，三株噬菌體Vmp03、Vpp07、Vap04 在魚汁分別對其宿主菌均有一定的抑制能力。在25 ℃條件下，經(jīng)過Vmp03 處理后的實(shí)驗(yàn)組相較對照組的菌量在第8 h 下降約2 lgCFU/mL；經(jīng)過Vpp07、Vap04 處理后的實(shí)驗(yàn)組相較對照組的菌量在第6 h 下降約1 lgCFU/mL。本實(shí)驗(yàn)在25 ℃下MOI=1000，MOI=10000 的實(shí)驗(yàn)組相較對照組在第6 h 時(shí)菌量分別下降1.04、1.82 lgCFU/mL，抑菌效果和高璐的研究相似。

綜上所述，474x1 是一株新的副溶血性弧菌噬菌體。該噬菌體裂解譜寬、裂解量大、潛伏期短。它在高溫下失活，但在60 ℃以下表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，能耐受寬范圍的pH，在食品中也有良好的抑菌效果，由于缺乏抗生素抗性基因和毒力基因，474x1 在不久后將會用來防控水產(chǎn)品副溶血性弧菌。