何猛超，鄔子璇，西玉玲，張德中，陳玉蓮，李 坤，井會涵，王鴻博，劉海坡，陳杉彬，韓興林,

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京 100015；3.山東秦池酒業(yè)（集團(tuán)）有限公司，山東濰坊 262600；4.中國酒業(yè)協(xié)會，北京 100831）

中國白酒是最古老的蒸餾酒之一，同時也是中國五千年歷史流傳下來的寶貴財富，在中國傳統(tǒng)文化中扮演著十分重要的角色，深受廣大消費者喜愛[1-2]。貴州高原地區(qū)長期的高溫、高濕環(huán)境為醬香型白酒提供了天然的釀造環(huán)境，通過長期不間斷的釀造醬香型白酒這里逐漸孕育了多種耐熱、耐濕的功能微生物。以茅臺酒為代表的醬香型白酒工藝主要包括：高溫大曲的制備、高溫堆積發(fā)酵、高溫固態(tài)蒸餾、陶壇長期貯存等，其中高溫大曲的質(zhì)量是決定產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[3-4]。隨著近些年來中國白酒所呈現(xiàn)的“醬酒熱”勢頭高居不下，許多茅臺地區(qū)之外的酒廠也開始釀造醬香型白酒，以山東為代表的北方地區(qū)酒廠也在不斷提升自身醬香型白酒品質(zhì)與質(zhì)量，從高溫大曲的制作、酒醅的堆積工藝、酒體貯存與勾調(diào)方面不同程度在改進(jìn)。

目前，行業(yè)對北方地區(qū)和南方地區(qū)所產(chǎn)的高溫大曲群落結(jié)構(gòu)研究比較多，也解析出南北方高溫大曲在微生物方面的差異同時提出相關(guān)改變策略。候強(qiáng)川等[5]通過從細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、功能以及細(xì)菌表型等多個維度來對比茅臺和湖北堯治河高溫大曲之間的差異性，兩種曲共有的細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬、嗜熱放線菌屬、克羅彭斯特菌屬等，但這些菌屬的相對含量在兩種曲里面存在很大差異。何猛超等[6]通過對比茅臺地區(qū)與湖南地區(qū)高溫大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在Alpha 多樣性指數(shù)中，茅臺地區(qū)高溫大曲的細(xì)菌群落豐富度較高，而湖南地區(qū)高溫大曲細(xì)菌群落多樣性較高，兩個地區(qū)細(xì)菌在屬水平差異較大；梁慧珍等[7]通過在高溫大曲中篩選高產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)芽孢桿菌，并對大曲進(jìn)行功能微生物的強(qiáng)化有效提高了高溫大曲吡嗪類物質(zhì)種類；王曉丹等[8]在高溫大曲中篩選地衣芽孢桿菌并添加到窖池中層酒醅中，與對照曲比較，通過5%的菌株添加量，四甲基吡嗪提高了3.30倍，有效提高了粹沙酒的醬香風(fēng)格。目前行業(yè)內(nèi)對不同地區(qū)的高溫大曲研究較多的是分析其微生物群落結(jié)構(gòu)并篩選其功能微生物，以及將功能微生物在酒醅堆積過程中進(jìn)行應(yīng)用，但運用不同芽孢桿菌在北方地區(qū)高溫大曲制作過程中進(jìn)行添加并探究其魯棒性，最終得到適應(yīng)性較優(yōu)的菌株在北方地區(qū)進(jìn)行規(guī)?；\用來提升高溫大曲質(zhì)量的研究較為少見。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種近年來新興的可用于檢測復(fù)雜基質(zhì)樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)物的技術(shù)[9-10]，其優(yōu)勢在于結(jié)合了氣相的強(qiáng)分離能力和離子遷移譜的高靈敏度，可在短時間內(nèi)完成痕量風(fēng)味物質(zhì)的分離和響應(yīng)[11-12]。該方法不要求真空檢測環(huán)境、檢出限低、樣品無需前處理，在食品鑒偽及生產(chǎn)加工過程中的質(zhì)量監(jiān)控中的應(yīng)用日益成熟[13-14]。ZHANG 等[15]通過GC-IMS 檢測了新鮮大曲和成熟大曲中揮發(fā)性有機(jī)化合物組成，結(jié)果表明熟化前后高溫大曲中揮發(fā)性有機(jī)化合物存在顯著差異。HE 等[16]采用GC-IMS 揭示了黑曲霉侵染水稻中揮發(fā)性有機(jī)化合物的動態(tài)變化及其代謝途徑，并建立了基于VOC分析的真菌侵染程度預(yù)測模型。以上研究證明利用GC-IMS 用于高溫大曲中標(biāo)志性代謝物分析和判別的可行性。

本論文主要是通過將貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌兩種芽孢桿菌在高溫大曲中進(jìn)行添加強(qiáng)化，并研究不同芽孢桿菌對大曲發(fā)酵能力和風(fēng)味的影響。旨在提高北方地區(qū)高溫大曲的質(zhì)量進(jìn)而提升醬香型白酒的品質(zhì)，同時也為除茅臺地區(qū)以外的醬香產(chǎn)區(qū)的高溫大曲制作提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗選用的菌株（貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌）均由中國食品發(fā)酵研究院有限公司提供；高溫大曲 均來自山東秦池酒業(yè)有限公司，采取九點取樣法收集出倉大曲，粉碎過40 目篩后-20 ℃冰箱保存待測；大曲微生物DNA 試劑盒 Fast DNA?Spin Kit for Soil；無水乙醇、濃硫酸、氫氧化鈉、酚酞、丙酮、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮等 分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯、己酸乙酯等標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；TAE 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；引物上海生物工程股份有限公司；DNA Marker Takara；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；核酸染料Gengreen 上海賽百盛有限公司；土壤DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）Omega Bio-Tek公司；所用的細(xì)菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，霉菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基。

CP1502 電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；HH-S6A 電熱恒溫水浴鍋 北京利偉永興儀器有限公司；PX2 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海賽默生物科技有限公司；DYY5 穩(wěn)壓電泳儀 北京六一儀器廠；GeI Image System Tanon 1600 凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；Illumina MiSeq 高通量測序平臺 美國Illumina 公司；FlavourSpec?1H1-00053 型氣相離子遷移譜：配有LAV、Reporter、Gallery Plot 插件以及內(nèi)置的GC×IMS Library Search NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫 德國G.A.S.公司；CTC-PAL 自動進(jìn)樣裝置瑞士CTC Analytics AG 公司；WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，1 μm）美國RESTEK 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌在強(qiáng)化大曲中的添加方法 將提供的兩株高產(chǎn)吡嗪芽孢桿菌（貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌）用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化并在37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)1 d 至108CFU/mL。每種芽孢桿菌的添加量為10 L 種子液添加到10 t 生曲中，添加時間為在高溫大曲拌料時和水進(jìn)行混合后加入，每種芽孢桿菌各做5 房作為實驗曲，以不添加菌株作為空白對照曲，每個曲房的長×寬×高規(guī)格為9.5 m×3.8 m×4.5 m，地面面積約為36 m2，待出倉后采用五點取樣法即房子的四點取一塊，中心點取一塊進(jìn)行取樣分析。將添加貝萊斯芽孢桿菌的高溫大曲簡稱強(qiáng)化1 號曲，將添加解淀粉芽孢桿菌的高溫大曲簡稱為強(qiáng)化2 號曲，不添加芽孢桿菌的簡稱為對照曲。

1.2.2 高溫大曲中芽孢桿菌、霉菌計數(shù) 芽孢桿菌計數(shù)方法：準(zhǔn)確稱取10 g 樣品，加入裝有90 mL 無菌生理鹽水（0.9% NaCl 溶液）的三角瓶中，振蕩均勻，在80 ℃水浴鍋下放置15 min，充分去除掉其他菌的干擾，再取1 mL 加入無菌水9 mL，以此類推，根據(jù)實際情況逐級稀釋，一般稀釋至10-4～10-6。

霉菌計數(shù)方法：準(zhǔn)確稱取10 g 樣品，置入裝有90 mL 無菌生理鹽水（0.9% NaCl 溶液）的三角瓶中，振蕩均勻，在30 ℃條件下放置30 min，再取1 mL加入無菌水9 mL，以此類推，根據(jù)實際情況逐級稀釋，一般稀釋至10-4～10-6。

分別取100 μL 稀釋液在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，芽孢桿菌在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h，霉菌在35 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h 進(jìn)行菌落數(shù)的計算[17]。

1.2.3 大曲理化指標(biāo)檢測 不同類型高溫大曲的理化指標(biāo)（水分、糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力、酸度等）依據(jù)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》測定[18]。

1.2.4 大曲微生物群落組成檢測

1.2.4.1 總DNA 的提取 稱取不同類型高溫大曲5.0 g 用液氮速凍后迅速研磨。大曲總DNA 提取方法按照土壤DNA 提取試劑盒操作說明書[18-19]。為了保證所提取的基因組的濃度及純度對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化，對細(xì)菌16S rRNA 基因的V3-V4 高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為338F/806R（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3/5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3），擴(kuò)增體系為：DNA 模板 10 ng，10xPCR緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，5 μmol/L 正向和反向引物各0.8 μL，體系用ddHO 補充至20 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。對真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1）進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為ITS5F/ITS1R

（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3/5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3），擴(kuò)增體系為：DNA 模板10 ng，10xPCR 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5 U/μL DNA 聚合酶0.4 μL，5 μmol/L 正向和反向引物各0.8 μL，體系用ddHO 補充至20 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性6 min，接著進(jìn)入循環(huán): 94 ℃變性45 s、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸120 s，共循環(huán)35 次，72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.4.2 高通量測序 將檢測合格樣品送往蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司，通過高通量測序（Illumina Miseq PE250）平臺進(jìn)行高通量測序。

1.2.5 大曲揮發(fā)性有機(jī)物的檢測

1.2.5.1 氣相色譜-離子遷移譜分析條件 大曲粉末混勻后稱取1 g 于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，封蓋備用，每個樣品設(shè)置2 次平行。

進(jìn)樣條件：頂空進(jìn)樣體積500 μL；孵育時間10 min；孵育溫度50 ℃；孵育轉(zhuǎn)速500 r/min；高純度氮氣（≥99.999%）為載氣；進(jìn)樣針溫度85 ℃；清洗時間0.5 min。

GC 分析條件：WAX 30 m ID: 0.53 mm 石英毛細(xì)管柱，柱溫60 ℃；載氣：高純度氮氣（≥99.999%）；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，10 min 內(nèi)線性增至10 mL/min，20 min 內(nèi)線性增至100 mL/min，運行時間30 min。

IMS 分析條件：漂移管長度98 mm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純度氮氣（≥99.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源為β射線（氚，3H）；模式：正離子。

物質(zhì)定性分析方法：GC-IMS 檢測結(jié)果為三維信號吸收峰圖譜，采用儀器配套的Vocal 軟件結(jié)合其配置的NIST 氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫和G.A.S 自建IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫對二維譜圖中物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Reporter、Gallery Plot 插件生成二維、三維峰譜圖和有機(jī)物指紋圖譜并進(jìn)行樣品間的差異對比；采用The Unscrambler X 10.3 進(jìn)行PCA 分析并制圖；采用SIMCA 14.1 進(jìn)行正交偏最小二乘回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 強(qiáng)化大曲理化指標(biāo)分析

醬香型高溫大曲的理化指標(biāo)中的水分、酸度、液化力和糖化力反映醬香型大曲是否成熟；發(fā)酵力和酯化力是醬香型大曲的生化性能，反映了醬香型高溫大曲品質(zhì)。

從表1 中數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，試驗組與對照曲的理化指標(biāo)存在差異。其中，大曲的水分是衡量大曲質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一，三種高溫大曲的水分均在11%左右，總體上符合低于13%的醬香型高溫大曲的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同高溫大曲理化指標(biāo)分析Table 1 Analysis of physical and chemical indexes of Daqu at different high temperature

液化力和糖化力的高低與大曲中微生物的生長繁殖有一定的關(guān)聯(lián)性，尤其是霉菌。測得的三種大曲的糖化力和液化力中，強(qiáng)化1 號曲和強(qiáng)化2 號曲與對照曲存在顯著性差異（P＜0.05），可能原因是通過添加一定量的芽孢桿菌，促進(jìn)了霉菌的數(shù)量，進(jìn)而提高了大曲的糖化力和液化力。

酯化力、發(fā)酵力作為高溫大曲生化功能的動態(tài)指標(biāo)，目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)對高溫大曲的兩個指標(biāo)作出明確規(guī)定。三種大曲的酯化力和發(fā)酵力中，強(qiáng)化2 號曲與強(qiáng)化1 號曲、對照曲存在顯著性差異（P＜0.05），可見芽孢桿菌的添加對于大曲酯化力和發(fā)酵力也有一定的影響，尤其是對強(qiáng)化2 號曲影響較大，因為醬香型高溫大曲的發(fā)酵力、酯化力與微生物的種類、數(shù)量和代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，特別是產(chǎn)酯酵母、酒精酵母，強(qiáng)化2 號曲中可能酵母菌屬的占比稍高而使酯化力、發(fā)酵力高于強(qiáng)化1 號曲及對照曲。

大曲的酸度也是衡量大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)。三種大曲中對照曲的酸度最高為1.39 mmol/10 g，其次是添加強(qiáng)化2 號曲的酸度為1.33 mmol/10 g，添加強(qiáng)化1 號曲的酸度最低為1.21 mmol/10 g，通過添加一定量的芽孢桿菌有效地提高了高溫大曲的酶活，并通過提高原料的利用率進(jìn)而降低了大曲的酸度。

2.2 強(qiáng)化大曲微生物指標(biāo)分析

2.2.1 不同高溫大曲微生物菌落計數(shù)結(jié)果 從表2可以看出，通過添加一定比例的不同芽孢桿菌，三種高溫大曲中強(qiáng)化1 號曲、強(qiáng)化2 號曲與對照曲的芽孢桿菌數(shù)、霉菌數(shù)之間存在顯著性差異（P＜0.05）。從實驗結(jié)果可以看出通過外源添加一定量的芽孢桿菌數(shù)，能夠有效增加北方地區(qū)酒廠的高溫大曲的芽孢桿菌數(shù)，在芽孢桿菌的數(shù)量級上能初步達(dá)到茅臺地區(qū)的水平。其次，通過外源添加芽孢桿菌后，能夠影響其他微生物的群落結(jié)構(gòu)，本實驗以霉菌的變化作為參考，因為在高溫大曲制作過程中由于制作溫度較高，大多數(shù)酵母不耐受高溫都會死掉，只有耐高溫的細(xì)菌尤其是芽孢桿菌，還有就是霉菌能夠存活下來，所以以霉菌作為參考。可以看出，強(qiáng)化1 號曲的霉菌數(shù)最高，能達(dá)到1.3×108CFU/g 左右，其次是強(qiáng)化2 號曲霉菌數(shù)，能達(dá)到1.1×108CFU/g 左右，而對照曲的霉菌數(shù)最低為1.0×107CFU/g 左右。

表2 不同高溫大曲微生物菌落計數(shù)Table 2 Analysis of microbial colony number of Daqu at different high temperature

2.2.2 高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.2.1 高溫大曲細(xì)菌落結(jié)構(gòu)分析 三種高溫大曲中的細(xì)菌種類及相對豐度在屬水平上的分析結(jié)果見圖1。

不同高溫大曲的細(xì)菌種類、群落豐度等方面是不同的。通過添加不同菌種的高溫大曲與對照高溫大曲在細(xì)菌屬水平上（＞1%）見表3。

表3 不同高溫大曲屬水平主要細(xì)菌（%）Table 3 Main bacteria at different levels of high temperature Daqu (%)

三種高溫大曲的細(xì)菌在屬水平上的豐度和群落結(jié)構(gòu)是各不相同的。從圖1 和表3 可以看出三種高溫大曲的優(yōu)勢細(xì)菌屬（＞1%）的主要微生物有糖多孢菌屬、枝芽孢桿菌屬、克羅彭斯特菌屬、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬、假諾卡氏菌屬、威斯氏菌屬、乳桿菌屬、海洋桿菌屬、葡萄球菌屬等，這也是醬香型高溫大曲常見的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。其中強(qiáng)化1 號曲中的芽孢桿菌屬占比為18.92%，強(qiáng)化2 號曲中的芽孢桿菌屬占比為21.68%，而對照曲中的芽孢桿菌屬占比僅僅為7.48%從三種高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)芽孢桿菌屬豐度占比可以看出，強(qiáng)化1 號曲、強(qiáng)化2 號曲中的芽孢桿菌的占比明顯高于對照曲，該結(jié)果與芽孢桿菌數(shù)的計數(shù)結(jié)果相一致，可見通過添加一定比例的芽孢桿菌能夠增加北方地區(qū)酒廠自制高溫大曲的芽孢桿菌屬的數(shù)量及豐度占比。

2.2.2.2 高溫大曲真菌落結(jié)構(gòu)分析 三種高溫大曲中的真菌種類及相對豐度在屬水平上的分析結(jié)果見圖2。

圖2 不同高溫大曲在屬水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Fungus structure of different high temperature Daqu at the genus level

不同高溫大曲的真菌種類、群落豐度等方面是不同的。通過添加不同菌種的高溫大曲與對照高溫大曲在真菌屬水平上（＞1%）見表4。

表4 不同高溫大曲屬水平主要真菌（%）Table 4 Main fungus at different levels of high temperature Daqu (%)

通過外源添加一定量的芽孢桿菌后，不僅對高溫大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有擾動現(xiàn)象，且同時影響了真菌的群落結(jié)構(gòu)。從圖2 和表4 可以看出，三種高溫大曲的優(yōu)勢真菌屬（＞1%）的微生物主要為熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬、曲霉屬。其中強(qiáng)化1 號曲的優(yōu)勢真菌屬為熱子囊菌屬，豐度占比為50.88%，而強(qiáng)化2 號曲和對照曲的優(yōu)勢真菌屬為嗜熱真菌屬，豐度占比分別為55.90%、56.63%。通過在高溫大曲制作過程中添加芽孢桿菌后，真菌群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，且添加不同種類的芽孢桿菌對真菌的群落結(jié)構(gòu)是不同的，強(qiáng)化2 號曲中的嗜熱真菌屬水平上與對照曲的占比相似，但強(qiáng)化1 號曲中的嗜熱真菌屬占比降低，曲霉增加，從這里可以看出添加解淀粉芽孢桿菌后對高溫大曲的真菌群落中優(yōu)勢真菌屬的豐度擾動較小。

從表2、表3、表4 結(jié)果可以看出，在添加貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌后對原有高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變且芽孢桿菌屬的數(shù)量及豐度占比也得到了明顯增加，其他細(xì)菌、真菌在群落豐富度上發(fā)生了微小的變動。此外，通過芽孢桿菌計數(shù)、高通量數(shù)據(jù)可以看出，強(qiáng)化2 號曲中的芽孢桿菌數(shù)和豐度明顯比強(qiáng)化1 號曲的高，所以可以初步判斷通過添加一定量的解淀粉芽孢桿菌后更適合在北方地區(qū)的高溫大曲中適應(yīng)性馴化繁殖。

2.3 強(qiáng)化大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

2.3.1 添加不同菌大曲GC-IMS 譜圖分析 圖3 和圖4 分別為運用儀器配置的Reporter 插件分析獲得的不同大曲GC-IMS 三維譜圖和二維譜圖，圖中的橫坐標(biāo)代表離子遷移時間，縱坐標(biāo)代表氣相保留時間，垂直方向高度代表對應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)的離子吸收峰強(qiáng)度。從圖3 可直觀看出大曲揮發(fā)性組分在保留時間400～1800 s 范圍內(nèi)存在明顯差異，由于三維圖譜分析不便，因此取俯視圖（圖4）進(jìn)行差異對比。以紅色豎線為反應(yīng)離子峰（RIP 峰），RIP 峰右側(cè)的每個點代表1 種揮發(fā)性有機(jī)物，信號峰越趨近于白色表示濃度越小，紅色表示濃度較大，顏色越深表示濃度越大。圖4 中最左側(cè)對照曲對應(yīng)二維圖中的信號峰數(shù)量較少，且顏色較淺，而右側(cè)兩種強(qiáng)化曲中的信號峰數(shù)量和總體強(qiáng)度相比于對照曲均有顯著增加，證明添加功能菌后的高溫大曲中揮發(fā)性代謝物更加豐富。

圖3 不同高溫大曲的GC-IMS 三維譜圖Fig.3 Three dimensional spectrum of GC-IMS of different high temperature Daqu

圖4 不同高溫大曲中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-IMS 譜圖Fig.4 GC-IMS patterns of volatile compounds in different high temperature Daqu

2.3.2 揮發(fā)性有機(jī)物定性分析 表5 為利用GC-IMS分析大曲中揮發(fā)性有機(jī)物的定性結(jié)果，根據(jù)分析軟件中自帶的NIST 數(shù)據(jù)庫和德國G.A.S 公司建立的IMS 遷移時間數(shù)據(jù)庫，對譜圖中的有機(jī)物信號峰進(jìn)行準(zhǔn)確的二維定性分析。表中化合物名稱后綴的M、D 和P 分別代表有機(jī)物單體、二聚體和三聚體。從不同大曲樣品中共鑒定出共73 個信號吸收峰，56 種揮發(fā)性有機(jī)物，主要包括醇類、酮類、醛類、酯類、吡嗪類及其他類別。其中吡嗪類物質(zhì)7 種，醇類13 種，酮類12 種，醛類8 種，酯類9 種和其他類7 種。其中吡嗪類物質(zhì)作為醬香型白酒的關(guān)鍵香味物質(zhì)同時也是白酒中的健康因子，為酒體提供了馥郁的烘焙和堅果香氣[20-21]。丙醛等醛類物質(zhì)的氣味閾值較低，可為發(fā)酵食品提供特殊風(fēng)味[22]。同時檢出的酯類物質(zhì)作為白酒中重要的風(fēng)味組分，有助于形成酒體中柔美的花果香氣[23]。為了觀察不同種大曲中風(fēng)味組分的差異，利用Vocal 軟件中的Gallery Plot 插件生成指紋圖譜，對各樣品圖譜中同個位置的信號峰進(jìn)行對比。

表5 GC-IMS 分析高溫大曲中的揮發(fā)性有機(jī)物Table 5 Analysis of volatile components in high temperature Daqu by GC-IMS

2.3.3 揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜 圖5 從上至下為對照曲、強(qiáng)化1 號曲和強(qiáng)化2 號曲的揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜，每一行顯示二維圖譜中的94 個信號吸收峰，每個樣品平行2 次，每一列表示同一物質(zhì)在不同樣品中的信號峰。從圖5 中可以看出不同大曲之間的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量和組成均存在顯著差異。紅色A 框內(nèi)選中的是強(qiáng)化2 號曲中的特征性代謝物，包括2-甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、乙酸己酯、環(huán)戊酮、環(huán)己酮、仲辛醇、異丙醇等。B 區(qū)域中的正戊醛、正己醛、苯甲醛、糠醛、2,3-戊二酮、羥丙酮、正己醇、1-戊醇、丁酸己酯、乙酸丁酯等化合物在強(qiáng)化1 號曲中的含量顯著高于2 號曲和對照曲。C 區(qū)域框選了在對照曲中信號最強(qiáng)的物質(zhì)，包括2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和丙醛二聚體。綠色框選中的D 區(qū)域為同時在兩種強(qiáng)化曲中含量顯著較高的信號區(qū)域，包括2-乙?；拎?、仲辛酮、叔丁醇、硫丙烯和異戊烯醛。

圖5 不同高溫大曲中揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜Fig.5 Gallery plot fingerprint of volatile compounds in different high temperature Daqu

大曲自身含有的揮發(fā)性有機(jī)物是多種微生物代謝反應(yīng)的結(jié)果，在很大程度上受到復(fù)雜微生物群落的影響。由圖5 可知，強(qiáng)化2 號曲的特征性代謝物與對照曲和1 號曲相比含有更加豐富的吡嗪類物質(zhì)，表明向相同基質(zhì)大曲中外源添加一定量的芽孢桿菌后，解淀粉芽孢桿菌在北方地區(qū)環(huán)境下表現(xiàn)出更強(qiáng)的產(chǎn)吡嗪能力。根據(jù)GC-IMS 指紋圖譜分析結(jié)果，添加解淀粉芽孢桿菌的強(qiáng)化2 號曲在北方條件下培養(yǎng)成熟后呈現(xiàn)出更豐富的風(fēng)味輪廓，其中投產(chǎn)前大曲自身含有的多種吡嗪是白酒中重要的呈味組分同時也是近年來備受關(guān)注的健康因子。

2.3.4 主成分分析與偏最小二乘回歸分析 圖6a 為根據(jù)指紋圖譜中定性出物質(zhì)的特征信號區(qū)域的吸收峰體積進(jìn)行主成分分析得分圖，結(jié)果顯示不同曲樣本組間分離明顯，前兩個主成分的總分離貢獻(xiàn)率達(dá)到99%，其中PC1 和PC2 的值分別為72%和27%，基于GC-IMS 得到的代謝物信號吸收峰可以對不同強(qiáng)化大曲進(jìn)行有效聚類。

圖6 三種高溫大曲的主成分分析和正交偏最小二乘結(jié)果Fig.6 Principal component analysis and OPLS-DA of three different high temperature Daqu

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）結(jié)合了正交信號[24]和PLS-DA 來篩選差異變量，是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法。圖6b 為OPLS-DA 的Biplot圖，結(jié)合了得分和載荷信息，位于觀測值附近的變量在對應(yīng)樣品中含量較高。從圖中可知14（2,5-二甲基吡嗪）、15（2,6-二甲基吡嗪）和68（丙醛）對于區(qū)分對照曲有較大貢獻(xiàn)；4（乙酸-D）、16（3-羥基-2-丁酮）、19（羥丙酮）、40（異丁醇-D）、47（硫代呋喃）和48（仲丁醇-D）是強(qiáng)化1 號曲中的特征性代謝物；8（仲辛醇）、9（2-乙基-6-甲基吡嗪）、11（（E）-3-己烯-1-醇）、13（2,3-二甲基吡嗪）、17（3-羥基-2-丁酮）、22（乙酸己酯）和29（環(huán)戊酮）是分離強(qiáng)化2 號曲的關(guān)鍵揮發(fā)性有機(jī)物。Biplot 圖所得結(jié)果與指紋圖譜基本保持一致。

變量重要性投影值（variable importance in project，VIP）可以反映各組分對模型分類的貢獻(xiàn)程度[25]，將VIP＞1 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，各化合物的VIP 值結(jié)果見圖6c。篩選出13 種VIP 值大于1 的對分類貢獻(xiàn)度較大的代謝物，按照VIP 值由高到低排序包括環(huán)己酮、2-乙?；拎?、乙酸、硫丙烯、異丁醇、異戊醇、環(huán)戊酮、仲辛酮、3-辛酮、乙醇、丙醛、正丁醛和3-羥基-2-丁酮，其中環(huán)己酮、環(huán)戊酮、仲辛酮、硫丙烯和2-乙?；拎壕趶?qiáng)化2 號曲中含量較高。此外本研究還進(jìn)行了OPLS-DA 模型驗證（置換檢驗n=200），如圖6d 所示。R2=0.561、Q2=-1.23，右側(cè)的R2和Q2均高于左側(cè)，且Q2與y 軸交于負(fù)半軸，說明該模型可靠不存在過擬合現(xiàn)象。

3 結(jié)論

通過本研究可以看出在制作高溫大曲時添加芽孢桿菌是提升北方醬酒產(chǎn)區(qū)高溫大曲質(zhì)量一種有效策略。本試驗主要是添加一定比例的貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌兩種來自茅臺地區(qū)高溫大曲的優(yōu)勢芽孢桿菌后，分析結(jié)果表明在高溫大曲中微生物系統(tǒng)魯棒性的情況存在下，從整體上看強(qiáng)化1 號曲、強(qiáng)化2 號曲在各項指標(biāo)（理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)、揮發(fā)性有機(jī)物）都明顯優(yōu)于對照曲，其次是添加解淀粉芽孢桿菌的強(qiáng)化2 號曲在理化指標(biāo)、芽孢桿菌數(shù)及豐度占比、風(fēng)味物質(zhì)組成的方面都明顯優(yōu)于添加貝萊斯芽孢桿菌的強(qiáng)化1 號曲及對照曲；利用GCIMS 對添加不同芽孢桿菌大曲粉末進(jìn)行分析檢測，共鑒定出56 種揮發(fā)性有機(jī)物，其中包含7 種吡嗪類物質(zhì)并根據(jù)指紋圖譜判斷強(qiáng)化2 號曲中吡嗪類物質(zhì)種類和含量顯著高于強(qiáng)化1 號曲和對照曲，同時也可以看出解淀粉芽孢桿菌更加適合在除茅臺地區(qū)之外的北方醬香白酒產(chǎn)區(qū)繁殖生長，這對于提升北方地區(qū)自制高溫大曲的質(zhì)量及白酒品質(zhì)的提升具有一定的參考價值。