袁文典, 于麒麟, 張耀斌

(大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室, 遼寧 大連 116024)

0 引 言

在我國農(nóng)業(yè)向規(guī)?；?、專業(yè)化發(fā)展的道路上,農(nóng)作物秸稈和畜禽糞便等廢棄物的處理成為農(nóng)業(yè)前進的桎梏。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2022年的數(shù)據(jù),我國仍有8 700萬噸左右的秸稈未能有效利用[1]。厭氧消化技術(shù)因其能耗低、能量轉(zhuǎn)化率高,除能生產(chǎn)清潔能源沼氣外,發(fā)酵的殘余物沼液、沼渣還可用作有機肥等優(yōu)點,已成為農(nóng)業(yè)廢棄物能源化利用的重要技術(shù)路線,是實現(xiàn)我國“雙碳”目標(biāo)的重要手段之一。秸稈類生物質(zhì)主要成分包括32%～47%的纖維素、19%～27%的半纖維素和5%～24%的木質(zhì)素[2]。然而目前以木質(zhì)纖維素作原料的濕式發(fā)酵水處理技術(shù)仍有一些難題,如以木質(zhì)素為主體的框架阻礙微生物對于秸稈的分解利用,發(fā)酵次產(chǎn)物限制微生物種間電子傳遞等[3]。當(dāng)前,國內(nèi)外的主要解決辦法仍以預(yù)處理為主,如通過蒸汽爆破、酸堿預(yù)處理、真菌預(yù)處理、酶發(fā)酵等物化生手段,使秸稈改性或易利用組分暴露,從而實現(xiàn)后續(xù)厭氧消化的高效運行[4]。然而由此產(chǎn)生的人力、物力與時間空間成本,制約了秸稈濕式厭氧消化技術(shù)推廣。

自然環(huán)境中,白腐菌是秸稈、樹木木質(zhì)素的主要分解者。在氧氣參與下,白腐菌氧化輔酶產(chǎn)生過氧化物,進而在多種過氧化物酶的作用下,進攻木質(zhì)素的苯環(huán)并產(chǎn)生苯氧自由基,誘發(fā)木質(zhì)素裂解[5]。大量研究表明,真菌利用氧氣降解木質(zhì)纖維素時伴隨有醌基氧化還原循環(huán)和腐殖質(zhì)形成[6]。GRINHUT等指出白腐真菌可以促進分解和礦化一些較難腐解的有機物[7]。CHEN利用黃孢原毛平革菌腐熟秸稈并研討不同時間段對堆肥情況的影響,發(fā)現(xiàn)在腐熟過程中,碳氮比降低而腐殖化程度升高[8]。大量研究報道,腐殖質(zhì)由于醌基的存在,可以作為電子穿梭體,增強產(chǎn)甲烷菌群的胞外電子傳遞[9-10]。此外,氧氣也常是促進難分解底物厭氧消化的一種手段,有研究報道微好氧下秸稈厭氧發(fā)酵效果有所提高[11]。

此外,白腐真菌的種類繁多,絕大部分為擔(dān)子菌,少部分為子囊菌,其對木質(zhì)素的降解通常有兩種形式:選擇性和非選擇性。在選擇性降解中,較難被利用的木質(zhì)素可以被優(yōu)先降解,而易被利用的纖維素和半纖維素部分幾乎沒有發(fā)生降解;非選擇性降解中,木質(zhì)纖維素生物質(zhì)所有部分同時發(fā)生降解。TANIGUCHI等發(fā)現(xiàn),在其研究的菌株中(P.chrysosporium、C.subvermispora、Trametesversicolor、Pleurotusostreatus),P.chrysosporium(黃孢原毛平革菌)在選擇性降解木質(zhì)素成分方面最成功,而更高的選擇性也意味著可生化性的最大保留,能為后續(xù)產(chǎn)甲烷菌群留存更多營養(yǎng)物質(zhì)[12]。

因此,本研究在傳統(tǒng)濕式厭氧消化體系中引入黃孢原毛平革菌(后稱白腐菌),在微氧條件強化秸稈懸浮液濕式發(fā)酵,同時,通過分析共培養(yǎng)體系的代謝過程,探究在不經(jīng)預(yù)處理下木質(zhì)素底物甲烷化的效果與可行性。

1 實驗方法與材料

1.1 實驗材料

接種污泥取自大連某污泥處理廠的厭氧污泥消化罐,污泥含固率約為15%。使用20目篩網(wǎng)將污泥過篩后,用人工廢水活化一周后備用,活化后部分指標(biāo)見表1。人工廢水采用葡萄糖為主要碳源(COD濃度為5 000 mg/L),NH4Cl和KH2PO4作為氮源和磷源(COD∶N∶P=200∶5∶1)。使用酵母浸粉作為維生素和微量元素補充劑,濃度約0.4 g/L。采用NaHCO3調(diào)節(jié)初始pH為7.0～7.2。秸稈收集自江蘇連云港附近某玉米農(nóng)田,機械粉碎后過100目篩,陰涼干燥處保存?zhèn)溆?秸稈部分物性參數(shù)見表2。黃孢原毛平革菌購自北納生物河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心,使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化,在30 ℃培養(yǎng)5 d后,使用無菌水沖刷刮取菌落獲得孢子懸濁液,稀釋至OD600測量值為1.0,加入甘油至比例為30%,-20 ℃保存用作后續(xù)實驗接種。

其余實驗試劑均購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

表1 實驗厭氧污泥初始指標(biāo)

1.2 實驗設(shè)置

實驗采用半連續(xù)模式。在500 mL的雙通絲口瓶中進行,加入50 g厭氧污泥,加去離子水使最終體積為500 mL。兩通一出口連接氣袋采集氣體,另一出口連接軟管收集實驗固液混合物。在實驗第0天與第6天向?qū)嶒灲M投加1 mL上述接種孢子懸浮液,向?qū)φ战M投加1 mL滅菌后孢子懸浮液。每組設(shè)3個平行。實驗設(shè)置水力停留時間(HRT)為30 d,每3 d取樣50 mL,并補充底物進水。取樣時振蕩搖勻后用作后續(xù)分析檢測。配置底物進水采用秸稈作為唯一碳源,NH4Cl和KH2PO4作為氮源和磷源,濃度分別控制在40、2、1 g/L。采用NaHCO3調(diào)節(jié)進水pH為7.0～7.2,同時曝N2控制溶解氧在0.6 mg/L。放入37 ℃恒溫房(專門用作恒溫培養(yǎng)的房間)中進行厭氧消化,以一個水力停留時間段為一個周期,運行2個周期。

表2 實驗秸稈物性參數(shù)

1.3 分析方法

實驗部分指標(biāo)測定方法及儀器詳情見表3。實驗中多糖、蛋白質(zhì)常規(guī)指標(biāo)測定參照水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版);COD的測定方法:取搖勻后的固液混合物,直接測量總體的COD為TCOD,離心后(8 000 r/min,10 min)取其上清液的COD為SCOD,測量儀器為COD快速測定儀,所用試劑為硫酸-硫酸銀和重鉻酸鉀;TS和VS用質(zhì)量法測定;氣體體積用注射器測定,氣體成分及占比通過氣相色譜分析;采用電化學(xué)工作站循環(huán)伏安法(CV)測定污泥的電容性或充放電能力(鉑電極為工作電極,Ag/AgCl為參比電極,鉑電極為對電極)。

三維熒光光譜(EEM)分析使用Agilent Cary Eclipse熒光分光光度計分析,激發(fā)波長Ex=190～560 nm,發(fā)射波長Em=230～600 nm,激發(fā)和發(fā)射波長的狹縫寬度均為10 nm,激發(fā)和發(fā)射波長的掃描間隔分別為2、5 nm,掃描速度為1 200 nm/min。

紅外分析時,泥樣放入冷凍干燥機中,加蓋冷凍干燥20 h,冷凍干燥條件:壓力1.0 Pa,溫度-54 ℃。采用Thermo Nicolet IS50高級傅里葉變換紅外光譜儀,掃描范圍4 000～400 cm-1,掃描32次,分辨率4 cm-1。

半連續(xù)實驗結(jié)束后,收集實驗組對照組反應(yīng)器內(nèi)的污泥樣品,采用高通量16S rRNA的焦磷酸測序來分析微生物的群落結(jié)構(gòu)。污泥樣品的脫氧核糖核酸(DNA)利用土壤快速DNA提取試劑盒提取,隨后分別對古菌和細(xì)菌的V3-V4與真菌的ITS區(qū)16S rRNA序列,區(qū)進行PCR擴增。匯集和純化后的PCR產(chǎn)物采用IlluminaTruSeqDNA文庫的制備方案進行構(gòu)建并利用IlluminaHiseq2000測序儀進行測序。

表3 部分指標(biāo)分析方法及儀器

2 結(jié)果與討論

2.1 白腐菌共培養(yǎng)對厭氧發(fā)酵秸稈降解的影響

第1周期前10 d,實驗組SCOD更高,最高達到1 200 mg/L(圖1),這可能是由于白腐菌優(yōu)先利用反應(yīng)器中的微量氧氣,從而減少污泥中兼性菌的耗氧分解,保留了更多的營養(yǎng)物質(zhì);而在后20 d中,實驗組和對照組差異較小,SCOD上升緩慢,從373.2 mg/L增加到477.0 mg/L,而TCOD不斷上升。這可能是秸稈液化困難,難以被利用,導(dǎo)致總有機物積累。其原因可能有二:(1)厭氧污泥難以利用秸稈,這與以往研究中厭氧發(fā)酵處理秸稈只有15%～25%的降解率相符[13];(2)反應(yīng)器設(shè)計溶解氧量0.6 mg/L,白腐菌在氧氣不足時增殖緩慢,因此在實驗初期(1～30 d),實驗組與對照組并沒有表現(xiàn)出較大差距。

第2周期實驗組對秸稈的降解效果明顯優(yōu)于對照組。從第31天開始,實驗組表現(xiàn)出在TCOD和SCOD上的差異,并且差異逐漸擴大。實驗45 d后差異逐漸穩(wěn)定,此時實驗組TCOD去除率為36.7%,較對照組(27.4%)提高了34.7%。同時,實驗組SCOD((830.6±1.6)mg/L)也比對照組((734.7±17.2)mg/L)提升13%。未投加白腐菌時,厭氧菌群可能利用秸稈結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈裸露的多糖纖維素進行厭氧發(fā)酵[14]。此外有研究報道,厭氧腸道微生物也可降解部分秸稈木質(zhì)素,降解率一般在23%～37%,這與對照組TCOD的降解率相符[15]。投加白腐菌后,實驗組白腐菌繁殖并利用微量氧氣裂解秸稈中木質(zhì)素復(fù)合體,從而使更多纖維素、半纖維素等易利用組分暴露,促進其降解。這與自然情況下白腐菌對于木質(zhì)素降解規(guī)律相符。此外,實驗組秸稈降解率在第42天后難以繼續(xù)提高,可能原因是氧氣不足。

圖1 厭氧發(fā)酵混合物有機物濃度變化曲線Fig. 1 Concentration change curve of organic mixture in anaerobic digestion

2.2 白腐菌共培養(yǎng)對厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響

第一個周期的前20 d,實驗組累計產(chǎn)生了511.5 mL甲烷,略高于對照組(470.9 mL)。效果僅微弱提升可能是由于部分秸稈在白腐菌增殖過程中被分解利用,但總體由于白腐菌正處于從孢子向菌絲體轉(zhuǎn)變的增殖階段,與實驗組差異較小。24 d后,實驗組產(chǎn)甲烷性能與對照組表現(xiàn)出差距,甲烷日產(chǎn)量不斷提高(圖2(a))。45～60 d,實驗組平均日甲烷產(chǎn)量為(109.7±8.3) mL,底物甲烷產(chǎn)率為75.76 mL/g VS,較對照組((75.6±6.2)mL、52.21 mL/g VS)提升了45%。

圖2 甲烷產(chǎn)量曲線Fig. 2 Methane yield curves

甲烷產(chǎn)率提高比例高于降解率的提高比例,推測是由于白腐菌除了通過分解秸稈提供額外的營養(yǎng)物外,還利用了其他途徑刺激產(chǎn)甲烷過程?？赡艿脑驗榘赘到饽举|(zhì)素的代謝產(chǎn)物更好地促進了產(chǎn)甲烷體系的代謝途徑。根據(jù)GUILLéN的研究,木質(zhì)素經(jīng)白腐菌代謝后產(chǎn)生的產(chǎn)物中醌基的含量提高,而醌基則作為電子穿梭體的核心官能團可加快產(chǎn)甲烷菌群的胞外電子傳遞,進而促進產(chǎn)甲烷代謝,提高甲烷產(chǎn)量[16-17]。本文2.4節(jié)將進一步測定醌基的相對含量。由甲烷累計產(chǎn)量(圖2(b))可知,實驗組在60 d運行中累計產(chǎn)生1 750.5 mL甲烷,而對照組累計產(chǎn)生了1 279.3 mL甲烷,提高了36.8%。

2.3 電化學(xué)測量循環(huán)伏安曲線

圖3顯示了共培養(yǎng)污泥的循環(huán)伏安曲線(CV)測量結(jié)果。圖3(a)是初期污泥與實驗結(jié)束后實驗組和對照組的污泥電活性測量結(jié)果。圖中非線性可逆氧化還原電流是污泥電活性組分由于充放電過程引起的,而循環(huán)伏安曲線的積分面積對應(yīng)共培養(yǎng)污泥的電容[18]。

圖3 共培養(yǎng)污泥的循環(huán)伏安曲線Fig. 3 Cyclic voltammetric curves of co-cultured sludge

實驗?zāi)┢诠才囵B(yǎng)污泥所對應(yīng)的氧化還原電流最大,為7.44 μA/cm,其比電容也最大8.26×10-5F,初始污泥和末期對照組污泥2個樣品的最大電流值與比電容分別為2.64 μA/cm與4.64×10-5F和2.00 μA/cm與2.92×10-5F。在電容方面,實驗?zāi)┢谖勰嘞噍^于實驗開始時提升了78.0%,相較于對照組提升182.9%。推斷出,白腐菌與污泥共培養(yǎng)有助于污泥的電容提高,并可能參與促進胞外電子傳遞。相較之下,對照組電容反而減小,可能是污泥原有電活性物質(zhì)的流失造成的,也與上文對照組末期甲烷產(chǎn)量不佳的表現(xiàn)一致。

此外,實驗組循環(huán)伏安曲線出現(xiàn)了明顯的氧化還原峰,氧化峰位于0.478 mV,還原峰位于-0.571 mV。從圖3(b)觀察,總體上峰型對稱,且在不同掃描速度下氧化還原峰位置不變,說明實驗組末期污泥中存在可逆的氧化還原物質(zhì),存在白腐菌通過代謝產(chǎn)生電活性物質(zhì)促進厭氧產(chǎn)甲烷的可能性。根據(jù)氧化還原峰電位以及兩者差值推測可能歸類于腐殖質(zhì)[9,19-20]。此外,在20 mV/s的掃速下,反掃過程還原峰與氧化峰并不對稱,說明污泥中存在不可逆的還原性組分,這可能與木質(zhì)素代謝產(chǎn)物相關(guān)。

2.4 傅里葉紅外透射檢測

圖4 共培養(yǎng)污泥紅外透射圖譜Fig. 4 Infrared transmission spectra of co-cultured sludge

根據(jù)以往對于白腐菌降解木質(zhì)素的代謝過程的相關(guān)研究,白腐菌的過氧化物酶利用過氧化物基團進攻木質(zhì)素的苯環(huán),促使其向苯氧自由基轉(zhuǎn)變,進而誘發(fā)苯環(huán)的裂解。同時由3種單體對羥基苯基(p-hydroxyphenyl, H)、愈創(chuàng)木酰(Guaiacyl, G)和紫丁香酰(Syringyl, S)構(gòu)成的木質(zhì)素,存在大量的醚鍵,一般分為β-O-4型、β-β型、β-5型,又以β-O- 4型為主要連接方式[21]。白腐菌的多種過氧化物酶可作用于這些醚鍵,解除木質(zhì)素復(fù)合體的交聯(lián)。因此從紅外圖譜中可以看到,相較于對照組,實驗組醚鍵振動峰的信號有所下降,說明木質(zhì)素復(fù)合體中醚鍵斷裂,交聯(lián)結(jié)構(gòu)分解;同時1 650 cm-1處峰值的提高說明醌基組分提高,這與白腐菌降解木質(zhì)素時會形成醌類物質(zhì)的研究相一致。KAWAI等的文章中報道了漆酶能將β-1型木質(zhì)素分解形成2,6-二甲氧基-1,4-苯醌,這也與循環(huán)伏安檢測的結(jié)果一致[22]。

2.5 三維熒光光譜分析

對不同天數(shù)的實驗組和對照組污泥進行三維熒光光譜(EEM)表征,如圖5所示,從上至下分別為0、20、40和60 d的結(jié)果。根據(jù)CHEN等的研究,EEM譜圖可分為5個區(qū)域(表4)[23]。已有研究表明,黃腐酸類物質(zhì)(區(qū)域Ⅲ)與腐殖酸類物質(zhì)(區(qū)域Ⅴ)相比,分子質(zhì)量相對較低,芳香度和氧化程度上都弱于腐殖酸,但在生物可利用性上表現(xiàn)更好[24]。

圖5 實驗各階段污泥EEM譜圖Fig. 5 EEM of sludge at various stages of the experiment

表4 EEM譜圖區(qū)域劃分及代表物質(zhì)

隨時間推移,總體趨勢為從代表芳香性蛋白組分的Ⅰ、Ⅱ區(qū)向代表腐殖質(zhì)的Ⅲ、Ⅴ區(qū)轉(zhuǎn)化;而與微生物代謝產(chǎn)物相關(guān)聯(lián)的Ⅳ區(qū)的整體熒光信號是減弱的;也注意到前20 d中,代表腐殖酸的Ⅴ區(qū)的熒光信號都有不同程度的下降。在這一段培養(yǎng)期間,一方面污泥中攜帶的有機物在不斷被消耗,代謝產(chǎn)物不斷向腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)變;另一方面污泥世代時間短于水力停留時間,導(dǎo)致了生物量的下降,微生物代謝產(chǎn)物濃度降低。

以實驗組與對照組之間的對比分析,差異表現(xiàn)在兩方面:一方面,運行時實驗組代表黃腐酸類物質(zhì)的Ⅲ區(qū)熒光信號顯著高于對照組,意味著實驗組確實有更多的黃腐酸類物質(zhì)生成,白腐菌刺激了底物腐殖化;另一方面,運行20 d后,代表腐植酸類物質(zhì)的Ⅴ區(qū),只在實驗組中出現(xiàn)熒光信號強度回升,代表腐殖質(zhì)物質(zhì)又有所增加。根據(jù)已有研究表明,白腐菌確實參與了自然界中的腐殖化過程。根據(jù)PAUL等的研究,白腐菌可以加速堆肥腐殖化,能以植物殘體中的木質(zhì)素降解產(chǎn)物為骨架,先縮合形成黃腐酸,之后芳香度不斷提高向腐殖酸方向演化,這與實驗組EEM譜圖的變化過程是一致的[25]。對照組因為難以將秸稈液化,厭氧消化和腐殖化過程緩慢。

2.6 微生物群落分析

取運行結(jié)束實驗組污泥進行16S rRNA鑒定,在屬層面進行分析(圖6)。

圖6 實驗組末期污泥微生物豐度圖Fig. 6 Plot of microbial abundance at the end of the experimental group

在真菌層面分析顯示,投加的P.chrysosporium占有真菌相對豐度的5.8%,說明黃孢原毛平革菌確實在共培養(yǎng)體系中穩(wěn)定存在。污泥中占主導(dǎo)地位的是Tarzetta,其相對豐度為60.8%,根據(jù)HYDE等的研究表明該菌可以腐殖化朽木,同時與脲酶的活性有顯著的正相關(guān)[26-27];其原因或許是共培養(yǎng)體系胞外酶降解發(fā)酵形成了尿素,為該細(xì)菌提供了代謝底物。

在古菌層面,占主導(dǎo)地位的是Methanothrix與Conexivisphaera菌,其相對豐度分別為41.0%與36.8%。據(jù)報道,Methanothrix主要以乙酸裂解途徑產(chǎn)生甲烷,此外Methanothrix有種間直接電子傳遞(DIET)能力,在互氧代謝中可以借助DIET利用有機物產(chǎn)甲烷[20],而Conexivisphaera菌是一種嗜酸嗜熱古菌,并且具有硫鐵還原能力[28]。這2種菌的大量存在說明污泥中存在圍繞胞外呼吸的微生物活動,很可能存在DIET過程[29]。

在細(xì)菌層面,Levilinea是占主導(dǎo)地位的菌屬,相對豐度為27.1%。其與相對豐度占比為6.7%的Longilinea菌屬經(jīng)常被一起提及,歸因于它們降解喹啉和吲哚的能力[30]。同時Levilinea也作為丙酸鹽氧化細(xì)菌與Methanothrix配合一起被報道,推測共培養(yǎng)體系并非以短鏈揮發(fā)性脂肪酸為主要底物進行厭氧產(chǎn)甲烷,而是以木質(zhì)素開環(huán)后形成的長鏈脂肪酸為底物。這些細(xì)菌菌屬豐度的提高,有利于共培養(yǎng)菌群降解秸稈代謝產(chǎn)物中含氮雜環(huán)類物質(zhì)。

3 結(jié) 論

本研究將黃孢原毛平革菌與傳統(tǒng)厭氧污泥在微氧情況下共培養(yǎng),實現(xiàn)了在不經(jīng)預(yù)處理情況下對秸稈木質(zhì)素濕式發(fā)酵利用,證明了共培養(yǎng)體系的可行性。一方面,通過在微氧下構(gòu)建白腐菌和產(chǎn)甲烷菌復(fù)合菌群,形成了新的共培養(yǎng)污泥群落,同時促進了秸稈的液化、腐殖化;另一方面,白腐菌對秸稈的木質(zhì)素復(fù)合體的解聚開環(huán)中形成的大量醌基和類腐殖質(zhì)物質(zhì)有助于產(chǎn)甲烷菌群的胞外電子傳遞過程,推動了厭氧產(chǎn)甲烷。然而,黃孢原毛平革菌引入后群落的代謝仍需要進一步研究,特別是氧氣參與下木質(zhì)素的解聚與腐殖質(zhì)的形成機理和細(xì)菌古菌與真菌的互作共生機制仍不充分。這些發(fā)現(xiàn)有望為木質(zhì)素的高效生物精煉利用提供參考信息。