熊紹風(fēng),熊小偉,彭國平,王 昆,方 洋,呂燕妮△

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,南昌 330000;2.南昌大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,南昌 330000;3.江西應(yīng)用科技學(xué)院,南昌 330100)

腎細胞癌是一種起源于腎小管上皮細胞的癌癥,在腎惡性腫瘤中占比高達90%以上[1],且統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),腎細胞癌占所有成人惡性腫瘤的3.79%,被認為是最致命的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一[2-3]。腎細胞癌除了具有異常的糖原代謝特征外,癌細胞中還會出現(xiàn)大量的脂質(zhì)積累、侵襲和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[4-5],因此腎細胞癌在組織學(xué)上被定義為脂質(zhì)積累和儲存的代謝疾病[6-7]。然而,腎細胞癌異常脂質(zhì)代謝的分子機制和意義尚不清楚。此外,肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化也被認為是腎細胞癌的危險因素[8-10]。

近幾年,研究者們又把褐變這一觀念引入腫瘤“瘦身”方面,通過調(diào)控腫瘤細胞中脂質(zhì)的褐變,使得腫瘤組織成為一個“自己燃燒自己”的“瘦身”狀態(tài),達到抑制腫瘤生長、發(fā)展的作用[11]。大量研究證實,自噬的發(fā)生與癌癥息息相關(guān)。自噬途徑及其相關(guān)的通路被認為是治療癌癥的潛在干預(yù)靶點。鑒于腎細胞癌是以一種脂質(zhì)積累和儲存的代謝疾病,本課題組把噬脂及脂質(zhì)褐變與腎細胞癌的發(fā)生緊密連在一起。因此,本研究旨在闡明鳶尾素對腎細胞癌的影響及作用機制,探究噬脂與脂質(zhì)褐變在鳶尾素影響腎細胞癌發(fā)展中的積極作用,通過一系列研究,可豐富對抗癌癥的作用機理,也為現(xiàn)階段新出現(xiàn)腫瘤“瘦身”概念及想法提供堅實的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù),現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

實驗用人腎細胞腺癌細胞(ACHN)株購自武漢普諾賽生命科技有限公司(CL-0021)。

1.1.2試劑

β-Actin鼠多克隆抗體(TA-09)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;PGC-1α兔單克隆抗體(ab106814)、UCP-1兔單克隆抗體(ab234430)均購自美國Abcam公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海吐露港生物科技有限公司(22107);SYBR Green(FP201)購自天根生化科技(北京)有限公司;TRIzol試劑(15596026)購自美國Invitrogen公司;實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)引物、PGC-1α和UCP-1的敲除慢病毒及相應(yīng)的控制載體均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司;胎牛血清購自美國Gbico公司;DMEM培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1檢測鳶尾素對ACHN細胞存活率的影響

將ACHN均勻接種于96孔培養(yǎng)皿,分為6組,即對照組和鳶尾素20、50、100、200、400 nmol/L組,處理細胞48 h后,采用CCK-8測定細胞存活率。

1.2.2檢測鳶尾素對ACHN細胞噬脂、褐變、自噬及凋亡的影響

將ACHN均勻接種于培養(yǎng)皿,分為4組,即對照組和鳶尾素20、50、100 nmol/L組,處理細胞48 h后采用Western blot檢測PGC-1α和UCP-1蛋白表達情況;采用qRT-PCR測定Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、PGC-1α、UCP-1和PRDM16 mRNA表達情況;采用細胞自噬染色(MDC)檢測自噬小體情況;采用劃痕實驗檢測細胞修復(fù)愈合情況;采用油紅O染色檢測噬脂情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.3qRT-PCR檢測mRNA表達情況

PCR擴增引物均有由上海吉凱生物有限公司合成,引物序列見表1,逆轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR操作參照試劑盒說明書進行。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4Western blot檢測相關(guān)蛋白表達情況

將不同處理組的細胞中加入細胞裂解液(RIPA裂解液∶PMSF為100∶1)置于冰上裂解15 min,之后測定蛋白濃度,根據(jù)定量結(jié)果進行制樣,將上樣緩沖溶液加入細胞裂解液中并煮沸10 min,隨后采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳分離,隨后濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上,濕轉(zhuǎn)完成后使用10%脫脂牛奶封閉2 h,加一抗4℃孵育過夜,TBST洗膜5遍,二抗常溫孵育2 h,TBST洗膜后用電化學(xué)發(fā)光法進行檢測。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

根據(jù)試劑盒說明書要求,把不同處理組的細胞上清液分為空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔、對照孔,按步驟依次加入各種試劑,最后采用流式細胞儀測定。

1.2.6劃痕實驗檢測細胞愈合和修復(fù)情況

ACHN接種于6孔板中,待細胞生長融合至90%時,根據(jù)實驗?zāi)康脑谂囵B(yǎng)孔內(nèi)加入不同濃度的藥物或聯(lián)合藥物處理48 h后,用200 μL滅菌槍頭在培養(yǎng)孔內(nèi)劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入無血清培養(yǎng)基并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡下觀察細胞愈合距離的變化檢測ACHN的細胞遷移情況。

1.2.7油紅O染色檢測噬脂情況

將處理好的細胞,用PBS溶液清洗2遍,加入新配制的10%多聚甲醛固定20 min,用PBS溶液清洗2遍,后加入油紅O染料,37 ℃恒溫箱染色30 min;用PBS清洗2遍,置于倒置顯微鏡下觀察其染色情況,拍照記錄。除此之外,還需用100%異丙醇洗脫細胞內(nèi)的染料以進行定量,通過紫外分光光度計測量510 nm處的吸光度(A)值,記錄數(shù)據(jù)。

1.2.8檢測PGC-1α在鳶尾素抑制ACHN細胞生長中的關(guān)鍵作用

將ACHN均勻接種于培養(yǎng)皿,分為4組,即對照組、鳶尾素100 nmol/L組、鳶尾素100 nmol/L+sh-NC組、鳶尾素100 nmol/L+sh-PGC-1α組,處理細胞48 h后采用熒光顯微鏡觀察病毒感染情況;采用qRT-PCR測定PGC-1α、UCP-1和PRDM16 mRNA表達情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.9檢測UCP-1在鳶尾素抑制ACHN細胞生長中的關(guān)鍵作用

將ACHN均勻接種于培養(yǎng)皿,分為4組,即對照組、鳶尾素100 nmol/L組、鳶尾素100 nmol/L+sh-NC組、鳶尾素100 nmol/L+sh-UCP-1組,處理細胞48 h后采用熒光顯微鏡觀察病毒感染情況;采用qRT-PCR測定PGC-1α、PRDM16和UCP-1基因mRNA表達情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 鳶尾素對ACHN細胞存活率及褐變的影響

經(jīng)過20、50和100 nmol/L鳶尾素處理48 h后,ACHN細胞存活率無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)鳶尾素濃度增至200和400 nmol/L時,細胞存活率呈明顯降低趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)鳶尾素處理48 h后,PGC-1α、UCP-1表達水平升高(P<0.05),且具有濃度依賴性,100 nmol/L鳶尾素處理后PGC-1α和UCP-1的表達增加最明顯,見圖1。

A:CCK-8試劑檢測鳶尾素處理細胞48 h后細胞的存活率;B:Western blot檢測棕色化相關(guān)蛋白的表達情況;C:qRT-PCR檢測棕色化相關(guān)基因mRNA表達情況;D:對Western blot結(jié)果進行定量分析;a:P<0.05,與對照組比較。

2.2 鳶尾素對ACHN細胞凋亡及遷移的影響

細胞凋亡結(jié)果顯示,鳶尾素能夠促進ACHN的細胞凋亡(P<0.05)。劃痕實驗顯示,鳶尾素抑制ACHN的細胞遷移(P<0.05),見圖2。

A:流式細胞術(shù)檢測鳶尾素處理后細胞凋亡情況;B:流式結(jié)果統(tǒng)計分析計算細胞凋亡率;C:鳶尾素處理細胞48 h后進行劃痕實驗,24 h后觀察細胞的遷移情況(50×);D:對劃痕實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析計算細胞遷移率;a:P<0.05,與對照組比較。

2.3 鳶尾素對ACHN細胞自噬及噬脂的影響

與對照組比較,鳶尾素的加入使得自噬相關(guān)Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ mRNA表達水平明顯升高(P<0.05),p62 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。油紅O染色結(jié)果顯示,鳶尾素在ACHN中以濃度依賴方式促進細胞噬脂,在100 nmol/L的鳶尾素中脂滴最少,噬脂最明顯(P<0.05),見圖3。

A:qRT-PCR檢測鳶尾素處理后自噬相關(guān)基因mRNA的表達情況;B:油紅O染色檢測鳶尾素處理對細胞脂滴聚集的影響(40×);C:酶標(biāo)儀檢測A510值;a:P<0.05,與對照組比較。

2.4 PGC-1α在鳶尾素抑制ACHN細胞生長中的關(guān)鍵作用

PGC-1α?xí)魅貘S尾素對ACHN的影響,見圖4。

A:熒光觀察慢病毒sh-PGC-1α感染效果(100×);B:qRT-PCR檢測慢病毒sh-PGC-1α感染后棕色化相關(guān)基因mRNA表達情況;C:流式細胞術(shù)檢測慢病毒sh-PGC-1α感染對鳶尾素處理細胞后細胞凋亡的影響;D:對流式細胞術(shù)檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析計算細胞凋亡率;E:劃痕實驗檢測慢病毒sh-PGC-1α感染對鳶尾素處理細胞后的細胞遷移的影響(50×);F:對劃痕實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析計算細胞遷移率;a:P<0.05,與對照組比較;b:P<0.05,與鳶尾素100 nmol/L組比較。

2.5 UCP-1在鳶尾素抑制ACHN細胞生長中的關(guān)鍵作用

UCP-1制會削弱鳶尾素對ACHN的影響,見圖5。

3 討 論

腫瘤微環(huán)境中的癌細胞,在腫瘤發(fā)展過程中營養(yǎng)可得性不斷變化,常常利用脂質(zhì)代謝來獲取能量、生物膜成分,以便于支持其快速增殖、存活、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移及對腫瘤微環(huán)境影響和癌癥治療的響應(yīng)所需的信號分子[12-13],因此,脂質(zhì)代謝異常成為癌癥中最明顯的代謝改變之一,不可忽視,現(xiàn)已證實脂質(zhì)代謝異常與腎細胞癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌和直腸癌發(fā)展密切相關(guān)[14-17],腎細胞癌被定義為脂質(zhì)積累和儲存的代謝性疾病,僅2018年全球就出現(xiàn)了40萬新病例和17.5萬死亡病例(全球癌癥觀測站)。現(xiàn)已證實,異常的脂質(zhì)積累和儲存為腎細胞癌的發(fā)展提供必不可少的提供能量支持。

正常情況下,米/褐色脂肪細胞屬于沉睡靜息狀態(tài),但在特定的條件下如機體受到寒冷刺激[18]或運動時[8],白色脂肪細胞可以轉(zhuǎn)化為米/褐色脂肪細胞,這一過程被稱之為“褐變”,褐變過程中會伴隨著棕色化標(biāo)記物(PGC-1α、UCP-1、PRDM16)的增加[19-21]。PGC-1α是能量代謝和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,與糖尿病和肥胖的代謝紊亂有關(guān),有研究報道,與正常組織相比,腎細胞癌組織中PGC-1α表達降低,數(shù)據(jù)顯示患者預(yù)后不良與癌癥基因組圖譜(TCGA-KIRC)中PGC-1α表達降低有關(guān),且PGC-1α在腎細胞癌中的下調(diào)與疾病進展密切相關(guān)[22]。UCP-1又名增溫素,能夠促進線粒體解耦聯(lián)氧化磷酸化,抑制細胞線粒體膜上三磷酸腺苷(ATP)的合成,促進機體產(chǎn)熱而不依賴ATP,以此增強生理狀態(tài)下機體的產(chǎn)熱反應(yīng)。腫瘤“瘦身”是一種新的概念,即具有異常脂質(zhì)的腫瘤細胞有效消耗脂質(zhì)來抑制腫瘤的發(fā)展,而不產(chǎn)生額外的ATP[11]。有研究報道,PLCL1在腎細胞癌中下調(diào),當(dāng)恢復(fù)腎細胞癌細胞中PLCL1表達時通過增加UCP-1的泛素化可明顯抑制腫瘤進展,減少異常脂質(zhì)積聚,因此PLCL1/UCP-1介導(dǎo)的脂質(zhì)褐變對腎細胞癌細胞有促進“瘦身”并消耗異常的脂質(zhì)堆積作用,從而抑制腎細胞癌的進展?，F(xiàn)已證實UCP-1介導(dǎo)的脂質(zhì)褐變能夠促進腎癌細胞“瘦身”進而抑制腫瘤進展[23]。

自噬是指在饑餓和損傷等應(yīng)激條件下細胞在雙層膜中形成自噬體,然后自噬體與溶酶體融合形成自溶體,降解內(nèi)容物,為細胞生存提供能量的適應(yīng)性過程[24]。已被證實自噬抑制了腎細胞癌的增殖[25],LncRNA SCAMP1通過miR-429調(diào)控ZEB1/JUN和自噬,促進氧化應(yīng)激下兒童腎細胞癌的發(fā)生[26]。

2012年,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種新的肌肉因子——鳶尾素[27],它是由FNDC5裂解產(chǎn)物,經(jīng)蛋白水解酶剪切后形成的多肽片段,由112個氨基酸殘基多肽片段組成,分子量為12×103,其氨基酸序列在大多數(shù)哺乳動物中高度保守,是一種與運動相關(guān)的、可調(diào)節(jié)糖脂代謝的新型肌肉因子,具有改善胰島素抵抗、促進白色脂肪棕色化、減輕體重等作用,是很具前景的代謝性疾病防治靶點。近些年研究證實鳶尾素主要在糖尿病、肥胖等代謝性疾病和癌癥方面發(fā)揮作用[28-30]。

本課題組試圖通過加入鳶尾素,探討其能否通過噬脂與脂質(zhì)褐變消除異常脂質(zhì)沉積,進而抑制ACHN細胞生長發(fā)展的目的。隨著鳶尾素濃度的增加,PGC-1α和UCP-1蛋白表達逐漸增加,表明鳶尾素引起PGC-1α和UCP-1蛋白表達變化呈現(xiàn)劑量依賴性;流式結(jié)果顯示,鳶尾素的濃度增加,腫瘤細胞的凋亡率逐漸升高;利用劃痕實驗來探討鳶尾素對腫瘤細胞遷移的影響,結(jié)果顯示鳶尾素可明顯抑制細胞遷移。此外,本研究進一步探討鳶尾素各濃度在引起自噬和噬脂中的影響,Western blot結(jié)果顯示,自噬相關(guān)Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ mRNA表達水平明顯降低,與此同時,p62 mRNA表達水平明顯升高,表明鳶尾素可促進細胞自噬。油紅O染色結(jié)果進一步佐證了鳶尾素可促進噬脂,減少細胞脂肪的異常沉積,這就有可能使得細胞“瘦身”增加腫瘤細胞凋亡。為了進一步探究PGC-1α和UCP-1在腫瘤細胞中的作用,構(gòu)建PGC-1α和UCP-1慢病毒并將其轉(zhuǎn)染進細胞中,發(fā)現(xiàn)鳶尾素可增加腫瘤細胞凋亡并抑制細胞遷移,但下調(diào)PGC-1α和UCP-1的表達之后,上述作用被逆轉(zhuǎn),證實PGC-1α和UCP-1在鳶尾素抑制ACHN進展中發(fā)揮的關(guān)鍵性作用。

綜上所述,鳶尾素能夠明顯抑制ACHN細胞遷移和增殖,且增加了ACHN細胞凋亡,這一作用的產(chǎn)生與激活噬脂和脂質(zhì)褐變密切相關(guān),其機制可能與下調(diào)PGC-1α和UCP-1蛋白在細胞的表達有關(guān)。本課題組通過探究鳶尾素對ACHN的影響及PGC-1α、UCP-1的關(guān)鍵性作用,為臨床的治療腎細胞癌提供了一定的理論依據(jù)和新的方向。但局限的是,目前只在細胞水平證明鳶尾素對腎細胞癌的影響,在動物水平是否有同樣的結(jié)果還需要進一步驗證。