高渝霞,楊 新

(1.豐都縣人民醫(yī)院病理科,重慶 408200;2.中國(guó)人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心病理科,重慶 400042)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤,復(fù)發(fā)率較高[1]。臨床上常用的檢查方法包括尿脫落細(xì)胞病理學(xué)檢查(簡(jiǎn)稱(chēng)尿檢)和膀胱鏡檢查,但尿檢的靈敏度較低[2-3],且對(duì)于較早期的少量異型細(xì)胞并不足以通過(guò)形態(tài)學(xué)給予診斷。膀胱鏡檢查費(fèi)用昂貴,又具有侵入性,且對(duì)于微小的腫瘤病灶依然難以發(fā)現(xiàn)[4]。故臨床期待尋找一種靈敏度、特異度均較高且無(wú)創(chuàng)的膀胱癌診斷方法。DNA染色是一種病理科常規(guī)的染色技術(shù),用Feulgen 染色法可顯示DNA的含量,用于腫瘤的診斷和研究,有助于判斷腫瘤的良惡性及分化程度,并評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后。對(duì)于泌尿系統(tǒng)腫瘤DNA含量檢測(cè)是一項(xiàng)較新型的檢測(cè)方法[5],檢測(cè)的標(biāo)本類(lèi)型可以是尿脫落細(xì)胞、常規(guī)手術(shù)切除組織等。本研究利用尿脫落細(xì)胞進(jìn)行DNA 含量檢測(cè),專(zhuān)門(mén)挑選常規(guī)尿檢陰性的患者進(jìn)行比對(duì)分析,探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年6月在中國(guó)人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心住院且病理科尿檢3次為非陽(yáng)性的患者56例,其中男37例,女19例,中位年齡62.3歲(25.0～86.0歲)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡25～86歲;(2)行膀胱術(shù);(3)行組織病理學(xué)檢查;(4)患者及家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):尿脫落細(xì)胞病理學(xué)檢查確診為膀胱癌。

1.2 方法

1.2.1薄層白片制作

取清晨起床后第1次尿的中后段100 mL送檢病理科。取50 mL 500×g離心10 min,棄上清液,再取50 mL,重復(fù)離心,至肉眼可觀察到底部沉淀。向沉淀中加5 mL緩沖液,振蕩均勻,轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中 500×g離心5 min,棄上清液。加0.5～1.0 mL緩沖液,振蕩均勻,制成重懸細(xì)胞液,用于蘇木素-伊紅(HE)染色制片和Feulgen染色制片,HE染色制片采用沉降法液基細(xì)胞制片技術(shù)(liquid-based preparations,LBP):取300～500 μL重懸細(xì)胞液,滴到直徑為13 mm的沉降倉(cāng),靜置30 min,倒掉上清液,滴無(wú)水乙醇1 mL固定細(xì)胞,倒掉,再滴無(wú)水乙醇1 mL再次固定,倒掉,制成薄層白片。Feulgen染色制片采用離心甩片法:取1 mL重懸細(xì)胞液,滴入甩片倉(cāng),調(diào)整離心甩片機(jī)轉(zhuǎn)速至4 000 r/min,離心4 min(要求在低倍鏡下細(xì)胞緊湊平鋪,不重疊,高倍鏡下可見(jiàn)8～12個(gè)上皮細(xì)胞),取出玻片,即制成薄層白片。

1.2.2HE染色

LBP法所制細(xì)胞薄層白片蘇木素染色1 min,水洗,無(wú)水乙醇脫水2 min×3次,0.5%伊紅染色30 s,無(wú)水乙醇脫水2 min×3次,自然風(fēng)干,封片。片子由1名住院醫(yī)師初診,1名主治醫(yī)師復(fù)診,1名副主任醫(yī)師對(duì)疑難標(biāo)本會(huì)診。診斷結(jié)果按照2022版《尿液細(xì)胞學(xué)巴黎報(bào)告系統(tǒng)》[6],將“未查見(jiàn)腫瘤細(xì)胞”“未見(jiàn)癌細(xì)胞”尿液巴黎2類(lèi)劃為陰性,“查見(jiàn)極個(gè)別非典型異型細(xì)胞”“不確定”尿液巴黎3類(lèi)劃為不確定,“癌”“可疑癌”尿液巴黎4類(lèi)及以上劃為陽(yáng)性。

1.2.3Feulgen染色

Feulgen染色是一種DNA染色,所制細(xì)胞薄層白片染色后可用DNA定量圖像分析儀自動(dòng)分析,自動(dòng)出具結(jié)果。Feulgen染色步驟:離心甩片法所制細(xì)胞薄層白片,垂直放入95%乙醇染缸中固定10 min,再轉(zhuǎn)入無(wú)水乙醇固定15 min,在320 mL甲醇+60 mL甲醛+20 mL冰醋酸的混合液中分化15 min,水漂洗5～6次。5 mol/L鹽酸60 min,水漂洗5～6次。DNA染液染色約67 min(根據(jù)染液配制時(shí)間長(zhǎng)短,可進(jìn)行調(diào)整,需在25 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中避光操作),水漂洗5～6次。95%乙醇脫水2 min,伊紅染色約15 s(具體時(shí)間根據(jù)染液使用情況定)。95%乙醇浸泡(2次,2 min/次)洗去多余染液,無(wú)水乙醇(2次,2 min/次)進(jìn)一步洗去多余染液并脫水,晾干,封片。片子由1名住院醫(yī)師初診,1名主治醫(yī)師復(fù)診,1名副主任醫(yī)師對(duì)疑難標(biāo)本會(huì)診。

1.2.4DNA圖像分析

本研究采用武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司的全自動(dòng)掃描分析系統(tǒng),根據(jù)細(xì)胞著色深淺、形態(tài)、面積、積分光密度(integrated optical density,IOD),分析其DNA含量。這里的DNA含量不是絕對(duì)值,是一個(gè)相對(duì)值,標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照細(xì)胞為同張玻片上的100個(gè)正常上皮細(xì)胞,對(duì)每張玻片上6 000個(gè)以上細(xì)胞核進(jìn)行掃描,掃描細(xì)胞的變異系數(shù)(coefficient of variantion,CV)<5%。DNA含量檢測(cè)以DNA指數(shù)(DNA index,DI)來(lái)表示,DI 1～<2為正常細(xì)胞,不正常細(xì)胞的情況有以下3種:(1) DI>2.5的細(xì)胞;(2)DI=2的細(xì)胞,即在M期,細(xì)胞數(shù)大于被檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的10%(正常細(xì)胞M期約占整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的5%～10%);(3)出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞峰。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示,比較行χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 尿檢結(jié)果與組織病理學(xué)診斷結(jié)果比較

56例患者中,尿檢陰性35例,其中16例組織病理學(xué)診斷為陽(yáng)性,19例為陰性;尿檢不確定21例,其中17例組織病理學(xué)診斷為陽(yáng)性,4例為陰性。尿檢與組織病理學(xué)診斷一致率(即準(zhǔn)確度)為33.93%(19/56)。

2.2 DNA含量檢測(cè)與組織病理學(xué)診斷結(jié)果比較

組織病理學(xué)診斷為陽(yáng)性的33例患者中, DNA含量檢測(cè)陽(yáng)性17例(真陽(yáng)), DNA含量檢測(cè)陰性16例(假陰);組織病理學(xué)診斷為陰性的23例患者中,DNA含量檢測(cè)陽(yáng)性8例(假陽(yáng)),DNA含量檢測(cè)陰性15例(真陰);故DNA含量檢測(cè)的靈敏度為51.52%(17/33),特異度為65.22%(15/23),準(zhǔn)確度為57.14%(32/56),高于尿檢準(zhǔn)確度,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 DNA含量檢測(cè)、尿檢與組織病理學(xué)診斷比較

尿檢陰性的35例患者中,DNA含量檢測(cè)陽(yáng)性 9例,其中組織病理學(xué)診斷陽(yáng)性4例,組織病理學(xué)診斷陰性5例;DNA含量檢測(cè)陰性26例,其中組織病理學(xué)診斷陽(yáng)性12例,組織病理學(xué)診斷陰性14例。尿檢不確定的21例中,DNA含量檢測(cè)陽(yáng)性16例,其中組織病理學(xué)診斷陽(yáng)性13例,組織病理學(xué)診斷陰性3例;DNA含量檢測(cè)陰性5例,組織病理學(xué)診斷陽(yáng)性4例,組織病理學(xué)診斷陰性1例。DNA含量檢測(cè)在尿檢陰性患者中的靈敏度和特異度分別為25.00%(4/16)、73.68%(14/19);在不確定患者中的靈敏度和特異度分別為76.47%(13/17)、25.00%(1/4)。

2.4 不同級(jí)別患者尿脫落細(xì)胞DNA含量檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

在組織病理學(xué)診斷為高級(jí)別膀胱癌的8例患者中,DI>2.5的患者6例(75.00%),1例細(xì)胞數(shù)高達(dá)627個(gè)(圖1);在組織病理學(xué)診斷為低級(jí)別膀胱癌的25例患者中,DI>2.5的患者11例(44.00%),1例出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞峰;在組織病理學(xué)診斷為陰性23例中,DI>2.5的患者8例(34.78%)。

圖1 DNA含量檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

尿液在腎臟形成,流經(jīng)腎小管、腎盂、輸尿管、膀胱,最后由尿道排出,故尿液中混入了泌尿系統(tǒng)各部位的脫落細(xì)胞,同時(shí)由于尿液中細(xì)胞易發(fā)生退變,且細(xì)胞本身存在細(xì)胞形態(tài)非典型性特點(diǎn),時(shí)常給細(xì)胞學(xué)診斷帶來(lái)困難,漏診頗多。DNA含量檢測(cè),并不是一種新興技術(shù),但是在泌尿系統(tǒng)腫瘤方面的研究較少。

有研究顯示,非整倍體現(xiàn)象在正常情況下非常罕見(jiàn),是癌癥的標(biāo)志特征之一[7]。細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí),M期(有絲分裂期)發(fā)生錯(cuò)誤,造成染色體的不穩(wěn)定性和非整倍性[8-10]。近年研究發(fā)現(xiàn), DNA倍體分析在諸多惡性腫瘤的鑒別診斷中具有良好的應(yīng)用價(jià)值,如宮頸癌[11]、口腔癌[12-13]等。1992年之前在美國(guó)主要盛行流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行評(píng)估[14],但1993年的一篇研究利用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)分析了膀胱癌石蠟標(biāo)本DNA含量,確立了自動(dòng)化圖像分析的地位,該技術(shù)也可應(yīng)用于尿液沉淀物的涂片或經(jīng)尿道切除的腫瘤切片[15]。本研究采用國(guó)內(nèi)武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司的全自動(dòng)圖像分析儀進(jìn)行分析[16-18],對(duì)DNA采用Feulgen染色,國(guó)內(nèi)此技術(shù)在肺癌[19-22]、宮頸癌[23-26]等諸多癌癥中已取得良好效果。

本研究前期成果證實(shí),DNA含量檢測(cè)聯(lián)合尿檢,可明顯提高尿路上皮癌的檢出率[27]。國(guó)內(nèi)亦有很多研究證實(shí)了DNA倍體檢測(cè)可提高早期癌變的診斷率,并能客觀評(píng)估癌癥的惡性程度,聯(lián)合尿檢能有效減少漏診率[28-29]。本研究重點(diǎn)分析尿檢結(jié)果不能佐證臨床可疑膀胱癌的患者,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,尿檢為陰性和不確定的56例患者中,經(jīng)組織病理學(xué)診斷確診為膀胱癌的患者33例,證明尿檢存在很大漏檢。DNA含量檢測(cè)陽(yáng)性的患者25例中有17例組織病理學(xué)確診為真陽(yáng)。之所以存在DNA含量檢測(cè)檢出率高于尿檢,很大一部分原因可能是細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)目的對(duì)數(shù)改變先于形態(tài)學(xué)改變,故較早期的癌變很難用肉眼根據(jù)形態(tài)學(xué)做出正確評(píng)估。假陰患者可能與腫瘤的部位有關(guān),如果腫瘤部位較深,脫落的腫瘤細(xì)胞不足或當(dāng)次尿液中并沒(méi)有癌細(xì)胞,故不易檢出。

綜上所述,尿脫落細(xì)胞DNA含量檢測(cè)可通過(guò)對(duì)染色體倍數(shù)的測(cè)定診斷出病變,對(duì)腫瘤細(xì)胞的良惡性鑒別做出判斷,尤其在懷疑膀胱癌患者但尿檢陰性和不確定患者中,DNA含量檢測(cè)可為臨床提供一個(gè)補(bǔ)充依據(jù),有效減少尿檢的漏檢率,具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。