羅穎，李聰，王沛，田莉華，汪輝，周青平，雷映霞

（西南民族大學(xué)四川若爾蓋高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站，四川 成都 610041）

氮素是植物生長、發(fā)育過程中各組織、器官中核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)等的主要組成元素，也是植物抵抗逆境時初級和次生代謝物合成的重要因子［1］。在自然界中，氮素存在的形式可分為有機(jī)氮和無機(jī)氮，而植物的氮素來源主要為無機(jī)氮，無機(jī)氮以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮為主。有研究表明，硝態(tài)氮是土壤中氮素資源的主要形式，且可以被多數(shù)作物所吸收［2］。當(dāng)作物吸收硝態(tài)氮之后會通過一系列氮代謝途徑將其轉(zhuǎn)化為自身可利用的氮素形式，并參與到作物體內(nèi)基本的生理代謝，如氮素同化、蛋白質(zhì)合成等重要過程，而這一系列氮代謝過程會對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)起決定性作用［3］。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，為使作物增產(chǎn)，我國大量施用化肥，使化肥的需求量出現(xiàn)大幅增長，1980 至2014 年間，就從1269.4 萬t 上升到了5995.9 萬t，增長了3.7 倍，年均增長高達(dá)4.67%，我國也成為世界上最大的化肥使用國［4-5］。然而，在自然條件下，氮肥的利用率非常低，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國氮肥利用率約為35%，低于世界40%～60%的水平［6］。由此，相當(dāng)一部分未被利用的氮肥一方面會通過淋溶、揮發(fā)釋放到大氣中導(dǎo)致大氣污染，另一方面，在土壤及水域中殘存的氮素，則會引起土壤酸化和水體富營養(yǎng)化，對土壤環(huán)境造成破壞。同時，過量施用氮肥也大大增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的成本支出［7］。因此，提高作物的氮利用效率，降低氮肥的使用量，減少環(huán)境污染成了亟待解決的問題。對此，我國在2015 年提出了化肥“零增長”行動，并在“十三五”規(guī)劃中提出了“藥肥雙減”的政策。因此，為響應(yīng)國家政策，選育耐低氮作物，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮肥投入就顯得尤為重要，迫在眉睫［8］。

燕麥（Avena sativa）是禾本科（Gramineae）燕麥屬（Avena）一年生草本植物，在世界禾本科作物生產(chǎn)中排名第四位，僅次于小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）［9］。根據(jù)外稃特征，燕麥可以分為皮燕麥和裸燕麥（Avena nuda）。皮燕麥其籽粒被一層堅(jiān)硬的外稃所包被，即使成熟時也不易脫落，是世界主栽類型［10］。皮燕麥起源于地中海沿岸，主要分布在以俄羅斯、芬蘭等為中心的歐洲國家和北美國家這兩大板塊［11-12］。我國種植的皮燕麥大多是從其他國家引進(jìn)，主要種植于我國西北、西南、東北以及青藏高原等地［13］。皮燕麥主要作為飼草作物種植，其鮮草的適口性好、營養(yǎng)價值高，可直接飼喂牛、羊。同時，皮燕麥加工調(diào)制的青干草和青貯飼料，含有較多的粗蛋白、粗脂肪，較低的纖維，是農(nóng)牧區(qū)主要的牧草品種。不僅如此，皮燕麥籽粒蛋白含量高，具有豐富的膳食纖維，能加速人體新陳代謝，可作為粗糧或保健食品［14］。除此之外，皮燕麥具有耐寒抗旱、耐貧瘠、耐適度鹽堿等特點(diǎn)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，皮燕麥無論以飼草或者作為收獲籽粒為種植目標(biāo)，都是農(nóng)牧區(qū)首選的優(yōu)良種質(zhì)資源［15］。

然而，目前對燕麥抗逆方面的研究，主要集中于鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫以及重金屬脅迫等，對于皮燕麥在低氮脅迫下的研究較少［16-19］。為此，本試驗(yàn)采用水培方式對18 份皮燕麥品種進(jìn)行研究，對皮燕麥在低氮環(huán)境中的形態(tài)及生理變化進(jìn)行探討，為高原地區(qū)篩選出耐低氮燕麥品種，以期減少氮肥的使用量，降低環(huán)境污染，建立可持續(xù)發(fā)展農(nóng)牧業(yè)模式。同時，探討低氮環(huán)境下燕麥的生理響應(yīng)機(jī)制，為后期燕麥耐低氮性的機(jī)制研究提供理論依據(jù)，也為選育耐低氮的牧草種質(zhì)提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用18 份不同皮燕麥品種為試驗(yàn)材料，如表1 所示。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用水培法［20］，于2021 年12 月在西南民族大學(xué)青藏高原研究院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。育苗階段選取籽粒飽滿、健康的種子，用0.1%的次氯酸鈉消毒5 min 后，用蒸餾水沖洗3 次，后采用紙上發(fā)芽法。當(dāng)幼苗萌發(fā)長至三葉期時，選取長勢一致的幼苗定植于水培箱中（70 cm×70 cm×35 cm），并設(shè)全氮和低氮2 個氮濃度處理。每份燕麥品種分別在2 個氮濃度處理中各定植3 孔，每孔定植10 株，設(shè)3 組生物學(xué)重復(fù)，此為第1 組試驗(yàn)材料，用于測定形態(tài)、生物量以及部分光合等指標(biāo)。第1 組試驗(yàn)材料種下的2 d 后，種植第2 組試驗(yàn)材料，18 份燕麥品種同樣在2 個氮濃度處理中各定植3 孔，每孔定植10 株，用于后續(xù)光合指標(biāo)的測定和展開生理指標(biāo)的取樣工作。

使用霍格蘭營養(yǎng)液（海博生物技術(shù)有限公司）水培，其中含有的NO3-濃度分別是全氮（4 mmol·L-1，CK），低氮（0.4 mmol·L-1，LN）。本試驗(yàn)用Ca（NO3）2·4H2O 作為氮補(bǔ)充來源，在低氮處理中，用CaCl2補(bǔ)充缺失的Ca2+，每7 d 更換一次營養(yǎng)液，增氧泵通氣。在22 ℃，相對濕度65%，光照16 h/黑暗8 h 的溫室中脅迫處理21 d 后進(jìn)行各指標(biāo)的測定。

每組試驗(yàn)材料脅迫21 d 后，剪取燕麥新鮮葉片0.1 g，每0.1 g 為一次生物學(xué)重復(fù)，每個處理取3 次生物學(xué)重復(fù)。葉片用錫紙包裹放入液氮中進(jìn)行冷凍，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存。保存的樣品用于硝態(tài)氮（NO3--N）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等指標(biāo)的測定，硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）使用新鮮葉片測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀指標(biāo) 將燕麥從水培箱中完整取出，取3 株單株，設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)。用卷尺測量其株高（plant height，PH）、根長（root length，RL），隨后從莖基部剪開，再進(jìn)行地上部分鮮重（shoot fresh weight，SFW）和地下部分鮮重（root fresh weight，RFW）測定，而后將植株鮮樣放入105 ℃的烘箱中殺青0.5 h，再在65 ℃的環(huán)境中烘干至恒重。取出測定地上部分干重（shoot dry weight，SDW）和地下部分干重（root dry weight，RDW），并計(jì)算根冠比（root-shoot ratio，RSR）（根冠比=地下部分干重/地上部分干重）。

1.3.2 生理指標(biāo) 在光合有效輻射為1200 μmol·m-2·s-1，大氣CO2濃度為400 μmol·m-1，葉片溫度為22 ℃的條件下，于上午9：00～12：00，下午14：00～17：00 用美國 LI-COR 公司生產(chǎn)的Li-6800 光合作用全自動測量系統(tǒng)測定葉片中部的光合指標(biāo)，包括凈光合速率（photosynthesis rate，Pn）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）、胞間CO2濃度（internal CO2concentration，Ci）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）的測定。

氮代謝相關(guān)酶活性測定：硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）均參照微量法試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定，待各指標(biāo)樣品處理后，NR、GOGAT、GDH 在340 nm 波長下進(jìn)行吸光度讀值，GS 在540 nm 下進(jìn)行吸光度讀值。

活性氧（ROS）含量測定：超氧陰離子（O2·-）含量和過氧化氫（H2O2）含量的測定均參照微量法試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），超氧陰離子含量吸取處理液后上清液于530 nm 處測定吸光度值。H2O2含量在415 nm 處測定吸光度值并進(jìn)行計(jì)算。

以下指標(biāo)測定參考張志良等［21］的試驗(yàn)方法。硝態(tài)氮（NO3--N）含量測定采用水楊酸比色法；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定；可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定；可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮比色法測定。

1.4 耐低氮性綜合評價

首先對低氮脅迫下皮燕麥的21 項(xiàng)指標(biāo)的耐低氮系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，比較各指標(biāo)間的相關(guān)性。而后將18 份燕麥材料的21 個指標(biāo)進(jìn)行主成分降維分析并提取出耐低氮綜合因子，最后采用隸屬函數(shù)法和系統(tǒng)聚類法進(jìn)行耐低氮性綜合評價。

1.4.1 各材料綜合指標(biāo)耐低氮系數(shù) 耐低氮系數(shù)=低氮脅迫下指標(biāo)的均值/對照指標(biāo)的均值。

1.4.2 各材料綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值

式中：Xj表示第j個綜合指標(biāo)；Xmin表示第j個綜合指標(biāo)最小值；Xmax表示第j個綜合指標(biāo)最大值。

1.4.3 各材料綜合指標(biāo)權(quán)重

式中：Wj表示第j個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度即權(quán)重；Pj為各基因型第j個綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率。

1.4.4 各材料耐低氮性綜合評價

式中：D值為各基因型在低氮脅迫條件下由綜合指標(biāo)評價所得的耐低氮性綜合評價值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，運(yùn)用SPSS 完成試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行T-test 檢驗(yàn)，而后計(jì)算出耐低氮系數(shù)并進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、隸屬函數(shù)分析，使用Origin 進(jìn)行各指標(biāo)相關(guān)性熱力圖、聚類熱力圖的繪制，其中聚類熱力圖是基于最長距離和歐式平方距離法進(jìn)行的層次聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮脅迫下皮燕麥農(nóng)藝性狀的變化

低氮脅迫下，各品種的株高均呈下降趨勢，其中甜燕2 號下降的最多（27.36%），其次是槍手（21.19%），并且甜燕2 號和槍手在低氮脅迫下的株高與全氮處理下的株高均呈顯著性差異（P<0.05），下降最少的是太陽神（0.42%），差異性不顯著（P>0.05）。18 個品種中，邊鋒、莫妮卡、甜燕70、青海444、青海甜燕麥的根長有不同程度的上升，其中青海444 上升最多（43.94%），青海甜燕麥上升了42.32%；其余13 份品種的根長均呈下降趨勢，甜燕2 號下降最多（55.93%），青燕2 號下降了54.78%。根冠比中，除青引1 號、槍手、燕王、青燕2 號、青燕1 號這5 個品種外，其余品種的根冠比均上升，青海444 的根冠比上升的最多，上升了1.5 倍，其次領(lǐng)袖上升了85.71%，槍手的降幅最大（36.36%），其次是青燕2 號（33.33%）。另外，植物的干物質(zhì)量可反映植物的氮利用效率，在低氮脅迫下，皮燕麥的地上部分鮮重、干重均下降，地下部鮮、干重變化趨勢不一致，邊鋒、青海444、魅力、領(lǐng)袖、青海甜燕麥、牧王的地下部生物量均上升，其余品種的地下部生物量均受到抑制（表2）。

表2 低氮脅迫下各皮燕麥品種的生長變化Table 2 Effects of low nitrogen stress on the growth of different oat cultivars

2.2 低氮脅迫下皮燕麥光合作用的變化

所有供試皮燕麥的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）在低氮脅迫下均呈下降趨勢（表3）。其中牧王的Pn下降幅度最大（64.52%），并且牧王在低氮脅迫下的Pn與全氮處理下的Pn呈顯著性差異（P<0.05），青燕1 號的Pn下降的最少（3.32%），其試驗(yàn)前后的Pn差異性不顯著（P>0.05）；牧王的Tr降幅同樣最大（77.61%），美達(dá)的降幅最?。?7.14%）；供試皮燕麥的Ci降幅不明顯，下降最多的是青燕1 號（18.27%）；莫妮卡的Gs降幅最大（76.47%），其次是牧王（75.00%），燕王下降的最少（7.69%）。

2.3 低氮脅迫下皮燕麥硝態(tài)氮的變化

低氮脅迫下，不同皮燕麥品種的硝態(tài)氮含量均處于下降狀態(tài)，下降幅度不盡相同，對照組和處理組變化呈極顯著差異（P<0.01）（圖1）。其中下降較多的3 個品種為青引1 號（76.12%）、駿馬（74.24%）、青海444（71.41%）。魅力下降的最少（19.12%），蒙燕1 號下降了32.84%，其他品種的變化趨于一致。且對照組中青燕1號的硝態(tài)氮含量最多，青燕2 號的硝態(tài)氮含量最少，低氮處理后除蒙燕1 號、槍手、魅力的硝態(tài)氮含量稍高，其余品種的硝態(tài)氮含量基本在同一水平。

圖1 不同皮燕麥品種的硝態(tài)氮含量在低氮脅迫下的變化Fig.1 Changes of nitrate nitrogen content in different oat cultivars under low-nitrogen stress

2.4 低氮脅迫下皮燕麥氮代謝相關(guān)酶的變化

在低氮脅迫下，供試皮燕麥品種的硝酸還原酶（NR）活性呈不同程度的下降趨勢，且差異顯著（P<0.05）（圖2）。其中太陽神的NR 活性下降的最多（63.46%），蒙燕1 號下降了59.73%。青燕2 號下降的最少（16.48%），其次是青引1 號下降了16.65%。對照組的18 份皮燕麥中，牧王、駿馬自身的NR 活性高于其他皮燕麥品種；且在低氮處理后，牧王和駿馬的NR 活性在所試皮燕麥品種中依然能維持較高水平。

圖2 不同皮燕麥品種的硝酸還原酶活性在低氮脅迫下的變化Fig.2 Changes of nitrate reductase activity of different oat cultivars under low-nitrogen stress

低氮處理下，除燕王的谷氨酰胺合成酶（GS）活性有所上升外，其余皮燕麥的GS 活性均有不同程度的下降；駿馬下降的最多（92.72%），青海444 下降的最少（3.47%），美達(dá)也僅下降了8.48%（圖3）。說明青海444 和美達(dá)在低氮脅迫下同化氨的能力下降的最少。

圖3 不同皮燕麥品種的谷氨酰胺合成酶活性在低氮脅迫下的變化Fig.3 Changes of glutamine synthetase activity of different oat cultivars under low-nitrogen stress

低氮脅迫處理組谷氨酸合成酶（GOGAT）活性與對照組相比均有不同程度的升高，呈顯著性差異（P<0.05）。低氮處理后青燕1 號的GOGAT 活性上升得最多，上升了3.6 倍，其次是青引1 號，上升了約2 倍，青燕2號、駿馬、甜燕70、領(lǐng)袖、牧王均上升了自身的一倍多。太陽神上升得最少（24.20%），甜燕2 號上升了25.23%，其余品種的變化趨于一致（圖4）。

圖4 不同皮燕麥品種的谷氨酸合成酶活性在低氮脅迫下的變化Fig.4 Changes of glutamate synthase activity of different oat cultivars under low-nitrogen stress

谷氨酸脫氫酶（GDH）在低氮脅迫下呈下降趨勢，下降幅度較大的3 個品種為駿馬>青海甜燕麥>莫妮卡（76.80%>72.04%>54.58%），下降幅度最小的是燕王（5.29%），其次是美達(dá)（5.58%）（圖5）。通過對照組與試驗(yàn)組的對比可以發(fā)現(xiàn)，燕王在未受到脅迫時，其自身的GDH 活性就相對較高，低氮脅迫后，燕王的GDH 活性為低氮組中最高的。

圖5 不同皮燕麥品種的谷氨酸脫氫酶活性在低氮脅迫下的變化Fig.5 Changes of glutamate dehydrogenase activity of different oat cultivars under low-nitrogen stress

2.5 低氮脅迫下皮燕麥活性氧、丙二醛的變化

在低氮脅迫下，所有試驗(yàn)品種的超氧陰離子（O2·-）含量均呈上升趨勢，其中甜燕70 的上升幅度最大（120.98%），其次是青海甜燕麥（89.87%），青引1 號（88.30%），青燕1 號變化最?。?.34%）。試驗(yàn)品種的過氧化氫（H2O2）含量變化整體呈上升趨勢，且差異顯著（P<0.05），上升幅度最為明顯的是青海甜燕麥（140.12%），美達(dá)上升了100%，蒙燕1 號和青引1 號變化不明顯，分別上升了4.79%、4.94%（圖6）。

圖6 不同皮燕麥品種的活性氧含量在低氮脅迫下的變化Fig.6 Changes of active oxygen content of different oat cultivars under low-nitrogen stress

所有試驗(yàn)品種的丙二醛（MDA）含量在低氮脅迫下也均有不同程度地升高（圖7），上升幅度最大的是青燕2號（64.62%），其次是魅力（60.65%）和甜燕2 號（51.84%），青海444 上升的最少（1.69%）。

圖7 不同皮燕麥品種的丙二醛含量在低氮脅迫下的變化Fig.7 Changes of MDA content of different oat cultivars under low-nitrogen stress

2.6 低氮脅迫下皮燕麥滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

低氮脅迫下，試驗(yàn)品種的可溶性蛋白（SP）含量均下降。甜燕2 號的下降幅度最大（70.78%），青燕1 號下降了62.44%，美達(dá)下降了59.78%，駿馬下降的最少（1.69%），青引1 號下降了6.59%。與此同時，可溶性糖（SS）含量也呈下降趨勢。邊鋒下降了59.07%，駿馬和青燕2 號分別下降了54.25%、51.68%，二者的降幅較一致；槍手變化最?。?.17%），青海甜燕麥下降6.98%，其余品種的降幅趨于一致（圖8）。

圖8 不同皮燕麥品種的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在低氮脅迫下的變化Fig.8 Changes of osmotic adjustment substances of different oat cultivars under low nitrogen stress

2.7 各指標(biāo)耐低氮系數(shù)相關(guān)性分析

對植物在逆境脅迫下的耐性評價，通常采用耐性系數(shù)，耐性系數(shù)越高代表植物耐受能力就越強(qiáng)，反之就越弱。本試驗(yàn)中皮燕麥各形態(tài)、生理指標(biāo)變化趨勢不盡相同，為避免皮燕麥自身的固有差異，運(yùn)用1.4.1 中的公式計(jì)算了能準(zhǔn)確反映皮燕麥各指標(biāo)變化的耐低氮系數(shù)（表4）。所試皮燕麥的株高、地上部鮮重、凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度、硝態(tài)氮含量、硝酸還原酶活性、谷氨酸脫氫酶活性、可溶性蛋白、可溶性糖含量的耐低氮系數(shù)均小于1，超氧陰離子、過氧化氫、丙二醛等指標(biāo)的耐低氮系數(shù)均大于1?；谝陨希瑢?8 份試驗(yàn)材料的7 項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)和14 項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析（圖9），結(jié)果表明有16 對指標(biāo)間存在相關(guān)性，其中12 對指標(biāo)呈極顯著相關(guān)（P<0.01）。地下部干重（RDW）與地下部鮮重（RFW）、地上部鮮重（SFW）、根冠比（RSR）、根長（RL）均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），其中根冠比（RSR）與地下部干重（RDW）的相關(guān)系數(shù)最高，為0.89，地上部鮮重（SFW）與可溶性蛋白（SP）、谷氨酸合成酶（GOGAT）與胞間CO2濃度（Ci）、谷氨酰胺合成酶（GS）與可溶性蛋白（SP）均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），其中GS 與SP 的相關(guān)系數(shù)最低，為-0.63。

表4 18 份皮燕麥材料各綜合指標(biāo)耐低氮系數(shù)Table 4 The comprehensive index of 18 oat cultivars is resistant to low nitrogen coefficient

圖9 18 份皮燕麥材料低氮脅迫下各指標(biāo)耐低氮系數(shù)相關(guān)性分析Fig.9 Correlation analysis of low-nitrogen tolerance coefficient of each index under low nitrogen stress of 18 oat cultivars

2.8 皮燕麥各指標(biāo)主成分分析

從相關(guān)性分析可以看出，雖然所測指標(biāo)間存在一定聯(lián)系但相關(guān)程度不一致，且大量信息重疊，影響耐低氮性評價效果。因此采用主成分降維的方法對18 份皮燕麥材料的21 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。將累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于80%且特征值≥1 作為判別條件，可提取7 項(xiàng)主成分因子（表5）。主成分1（PC1）的特征值為4.658，貢獻(xiàn)率為22.181%；主成分2（PC2）的特征值為2.702，貢獻(xiàn)率為12.869%；主成分3（PC3）的特征值為2.559，貢獻(xiàn)率為12.187%；主成分4（PC4）的特征值為2.291，貢獻(xiàn)率為10.907%；主成分5（PC5）的特征值為2.049，貢獻(xiàn)率為9.755%；主成分6（PC6）的特征值為1.561，貢獻(xiàn)率為7.433%；主成分7（PC7）的特征值為1.180，貢獻(xiàn)率為5.620%。前7 個主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)80.952%，具有較好的代表性，與燕麥苗期耐低氮性具有直接聯(lián)系，可作為評價燕麥苗期耐低氮性的綜合指標(biāo)。

表5 各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 5 Coefficients and proportion rates of various comprehensive indicators

第1 主成分中貢獻(xiàn)率較大的是地下部干重（RDW）和地上部分生物量，主要反映了低氮脅迫后燕麥的生物量變化，在低氮脅迫下維持較高的生物量水平能反映出品種的耐低氮性；第2 主成分中谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）的貢獻(xiàn)率較高，GS 和GDH 活性反映了植物的氮代謝效率，低氮脅迫下燕麥幼苗的氮代謝能力越強(qiáng)，其耐低氮性也越強(qiáng)；第3 主成分中貢獻(xiàn)率較大的是氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr），在低氮脅迫下維持較高的光合水平也能反映品種的耐低氮性；第4 主成分中過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2·-）的貢獻(xiàn)率較大，反映了燕麥的抗氧化能力，低氮環(huán)境下植物細(xì)胞內(nèi)活性氧含量越低，表明其抗氧化能力越強(qiáng)，耐低氮性也就越強(qiáng)；第5 主成分中可溶性蛋白（SP）和地下部鮮重（RFW）的貢獻(xiàn)率較大，反映了滲透調(diào)節(jié)能力以及積累有機(jī)物的能力，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可表明細(xì)胞受到脅迫后的調(diào)節(jié)能力，滲透調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)，其耐低氮性越強(qiáng)；第6 主成分中硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）的貢獻(xiàn)率較大，與第2 主成分反映的能力一致；第7 主成分中谷氨酸脫氫酶（GDH）和株高（PH）的貢獻(xiàn)率較大，與第1、2 主成分反映的能力一致。綜合7 個主成分分析結(jié)果，燕麥的生物量、氮代謝效率因子、光合因子、抗氧化能力因子、滲透調(diào)節(jié)因子可作為燕麥苗期耐低氮性評價的綜合指標(biāo)。

2.9 隸屬函數(shù)分析及綜合評價

采用隸屬函數(shù)法對各指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，根據(jù)1.4.2 中的公式（1）計(jì)算出18 份材料分別在7 個主成分下的隸屬函數(shù)值（表6）。對于綜合指標(biāo)主成分1 而言，青海444 的隸屬函數(shù)值最大，為U（X1）=1.000，而青燕2 號的隸屬函數(shù)值最小，為U（X1）=0.000；說明在主成分1 下，青海444 的耐低氮性最強(qiáng)，而青燕2 號的耐低氮性最弱。進(jìn)一步結(jié)合7 個主成分的貢獻(xiàn)率，根據(jù)1.4.3 中的公式（2）計(jì)算出7 個主成分的權(quán)重，分別為0.274、0.159、0.151、0.135、0.121、0.092、0.069。最后利用公式（3）計(jì)算出18 份材料耐低氮性的綜合評價值（D）。從表6 可知，18 份燕麥材料耐低氮性按D值由大到小排序?yàn)椋禾鹧?0>青海甜燕麥>青海444>美達(dá)>燕王>青引1 號>魅力>青燕1 號>蒙燕1 號>領(lǐng)袖>牧王>邊鋒>槍手>莫妮卡>太陽神>青燕2 號>甜燕2 號>駿馬。

表6 18 份皮燕麥材料各綜合指標(biāo)值、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D 值及綜合評價Table 6 The comprehensive indicator values，index weight，membership function value，D values and comprehensive evaluation of 18 oat cultivars

2.10 耐低氮性聚類分析

對不同耐低氮性指標(biāo)進(jìn)行R 型聚類分析，結(jié)果顯示21 個耐低氮性指標(biāo)可分為3 類，第一類包含了株高（PH）、根長（RL）、根冠比（RSR）、地下部干重（RDW）、地下部鮮重（RFW）、胞間CO2濃度（C）i等指標(biāo)，主要以地下部相關(guān)指標(biāo)為主，可歸納為根系因子；第二類包含地上部鮮重（SFW）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、硝態(tài)氮（NO3--N）、硝酸還原酶（NR）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）等指標(biāo)，可歸納為氮代謝效率因子、滲透調(diào)節(jié)因子以及光合因子，并且這一類因子總體水平較低；第三類包含谷氨酸合成酶（GOGAT）、超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）等指標(biāo)，可歸納為抗氧化能力因子（圖10）。對18 份材料進(jìn)行Q 型聚類分析，結(jié)果顯示，這些材料可分為兩類（Ⅰ和Ⅱ），第Ⅰ類包括青海甜燕麥、美達(dá)、青海444、牧王、領(lǐng)袖、邊鋒；第Ⅱ類材料又可分為兩個亞組：Ⅱ-a（魅力、太陽神、莫妮卡、甜燕2 號、青燕2 號、槍手）和Ⅱ-b（燕王、青燕1 號、青引1 號、駿馬、甜燕70、蒙燕1 號）。第Ⅰ類皮燕麥品種中的MDA 這一指標(biāo)相較于第Ⅱ類皮燕麥品種偏低，說明第Ⅰ類皮燕麥品種受到的氧化損傷較輕，其抗低氮能力更強(qiáng)，且第Ⅰ類品種的地下部生物量較高，說明此類材料對低氮脅迫的耐受性較高，可將這6 份皮燕麥品種劃分為耐低氮型品種。Ⅱ-a 組品種的MDA含量較高，GOGAT 活性較低，說明Ⅱ-a 中品種的抗氧化能力和氮代謝能力都相對較低，可將Ⅱ-a 的品種劃分為氮敏感品種；Ⅱ-b 中MDA 含量屬于中等，表明此類材料受到的氧化脅迫程度為中度，因此可劃分為中等耐低氮性品種。

3 討論

3.1 低氮脅迫下皮燕麥農(nóng)藝性狀的變化

植物的形態(tài)特征和干物質(zhì)變化是植物對營養(yǎng)脅迫反應(yīng)最直觀的指標(biāo)，植物缺氮時，地上部干物質(zhì)重量通常會呈現(xiàn)下降趨勢，而適當(dāng)?shù)牡偷{迫會促進(jìn)根的生長發(fā)育，呈現(xiàn)根冠比和根干重上升的趨勢［22］。姜琳琳等［23］研究表明較低的氮濃度一定程度上對玉米的根系生長有促進(jìn)作用，而氮濃度的進(jìn)一步上升，會抑制根系的生長；陳瑩等［24］也發(fā)現(xiàn)低氮脅迫下苗期高羊茅（Festuca arundinacea）的株高、地上部生物量顯著降低。在本試驗(yàn)中，所試品種的株高、地上部生物量均下降，與前人研究一致；而根長和地下部生物量整體呈下降趨勢，根冠比整體呈上升趨勢，但也有少數(shù)品種的根長和地上部生物量呈上升趨勢。造成這一現(xiàn)象的原因可能是皮燕麥為維持自身生長，增加吸收氮的面積，從而刺激根生長。低氮脅迫會影響植物地上部分和地下部分的生長情況，但是具體的變化跟植物種類和耐低氮性有關(guān)。

3.2 低氮脅迫下皮燕麥的光合變化

通過對前人的研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，評價光合性能機(jī)制一般是從氣孔因素和非氣孔因素兩方面來進(jìn)行［25］，限制光合作用的氣孔因素主要包括氣孔數(shù)量和氣孔導(dǎo)度，非氣孔因素包括PEP 羧化酶或Rubisco 的羧化能力、電子傳遞能力和葉綠素含量等［26］。當(dāng)氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和凈光合速率（Pn）都呈下降趨勢時，可認(rèn)為是氣孔因素導(dǎo)致了Pn的下降；當(dāng)Pn和Gs減小，而Ci增加時，則將Pn下降的原因歸結(jié)為非氣孔因素［27-28］。在本試驗(yàn)中，燕麥的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）均呈下降趨勢（表3），但Ci下降趨勢不明顯，這一結(jié)果與李從鋒等［29］對玉米在低氮環(huán)境下的研究結(jié)果一致。因此推測早期皮燕麥在低氮脅迫下Pn下降可能是由于氣孔閉合導(dǎo)致的。

3.3 低氮脅迫下皮燕麥的氮代謝響應(yīng)

目前的農(nóng)業(yè)模式中，作為植物氮肥來源的主要是硝酸鹽中的硝酸根（NO3-），因此對植物體內(nèi)的硝態(tài)氮含量的測定，可以直觀地看到周圍環(huán)境的氮水平變化及植物自身吸收氮的效率［2，30］。前人研究表明，在低氮環(huán)境中的植物，當(dāng)可吸收的外界氮素減少時，其體內(nèi)的硝態(tài)氮含量也會隨外界氮素濃度的下降而降低［31］。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低氮環(huán)境下，所有品種吸收的硝態(tài)氮都有不同程度的減少（圖1）；這與劉源［32］在大豆（Glycine max）的低氮脅迫研究中結(jié)果一致；范蓮雪等［31］在關(guān)于黃瓜（Cucumis sativus）的低氮試驗(yàn)中也得出相似的結(jié)果，黃瓜的地上、地下部分硝態(tài)氮含量都低于正常氮處理。青引1 號的硝態(tài)氮含量降幅度最大，說明在供試的燕麥品種中，青引1 號的氮吸收能力最弱。

植物從土壤中吸收的NO3-無法直接利用，需要經(jīng)過一系列氮代謝反應(yīng)將NO3-還原、NH4+同化，以便生成含氮有機(jī)物來維持植物生長發(fā)育，這也就涉及各種氮代謝相關(guān)酶［33］。氮代謝相關(guān)酶活性展現(xiàn)了植物的氮代謝能力，硝酸還原酶（NR）作為植物進(jìn)行氮代謝的第一限速酶，是研究低氮脅迫的關(guān)鍵指標(biāo)，其主要作用是將植物吸收的NO3-還原成NH4+［34］。谷氨酰胺合成酶（GS）是植物同化氨的關(guān)鍵酶之一，相關(guān)研究表明，低氮環(huán)境下，GS 活性與氮效率呈正相關(guān)，GS 高表達(dá)能增加植物的氮代謝效率［35］。植物的氮代謝過程中，GS/GOGAT 途徑是十分關(guān)鍵的一步，是氮代謝過程的重要樞紐，被NR 還原后的NH4+在GS 的催化作用下生成谷氨酰胺（glutamine，Gln），并在GOGAT 的作用下再次轉(zhuǎn)化為谷氨酸（glutamic acid，Glu）［36-37］。GDH 對作物的氮利用率同樣有重要的調(diào)控作用，有研究報(bào)道，當(dāng)NH4+濃度增加時，會引起植物體內(nèi)GDH 的活性升高，從而催化谷氨酸（Glu）的合成，來抵抗NH4+中毒［36］；同時，GDH 活性升高還會促使脯氨酸的含量增加，增強(qiáng)植物的抗逆性［38-39］。在本試驗(yàn)中，所有皮燕麥品種的NR、GS、GDH 活性均表現(xiàn)為下降趨勢，這與謝孟林等［40］在低氮脅迫下玉米苗期氮代謝相關(guān)酶活性的研究結(jié)果一致；并且駿馬、邊鋒的GS 活性下降得十分明顯，說明這兩個品種在低氮的環(huán)境下，其氨轉(zhuǎn)化能力最容易受到影響。另外本試驗(yàn)中GOGAT 呈上升趨勢，也可能是因?yàn)槠ぱ帑淕OGAT 的高表達(dá)將谷氨酰胺（Gln）轉(zhuǎn)化成了谷氨酸（Glu），消耗了大量NH4+，維持了自身生長需求，從而使皮燕麥植株體內(nèi)的NH4+沒有堆積對自身造成毒害，也因此沒有高濃度的NH4+來刺激GDH 活性升高。這可能就是皮燕麥在低氮脅迫下相關(guān)氮代謝酶的動態(tài)變化理論。

3.4 低氮脅迫下皮燕麥的抗氧化能力

當(dāng)植物處于逆境環(huán)境中時，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除動態(tài)平衡就會被打破，從而導(dǎo)致ROS 含量增加［41］。ROS 又主要包括超氧陰離子（O2·-）和過氧化氫（H2O2）等，過多的ROS 會使細(xì)胞膜的膜脂系統(tǒng)受到損傷［42］。與此同時，植物在受到脅迫后細(xì)胞膜脂過氧化會明顯加劇，丙二醛（MDA）作為膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，對植物的蛋白質(zhì)、核酸和酶都有很強(qiáng)的破壞性，因此MDA 含量高低能反映植物受傷害程度的大?。?3］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低氮處理下，所試皮燕麥材料的ROS 均大量累積（圖6），不同品種的累積情況不同，這與王峰［34］在低氮脅迫下不同耐低氮性作物的ROS 變化研究結(jié)果一致。并且在低氮脅迫下，所有皮燕麥的 ROS 含量上升的同時，皮燕麥MDA 含量較正常氮情況下均上升（圖7），這與葉宇波等［44］對杉木（Cunninghamia lanceolata）幼苗在低氮脅迫下的MDA 變化趨勢一致。本試驗(yàn)中的ROS 與MDA 含量的顯著上升結(jié)果表明，低氮脅迫會對皮燕麥的膜脂系統(tǒng)造成損傷，導(dǎo)致皮燕麥體內(nèi)的自由基變多，從而使皮燕麥?zhǔn)艿窖趸瘬p傷；另外皮燕麥在低氮脅迫下的氧化反應(yīng)，也表明皮燕麥的抗氧化能力變?nèi)?，這可能與抗氧化酶活性有關(guān)。

3.5 低氮脅迫下皮燕麥的滲透調(diào)節(jié)能力

相關(guān)研究表明，當(dāng)植物受到逆境脅迫時，會通過調(diào)節(jié)自身一系列生理生化反應(yīng)來適應(yīng)逆境，其中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量可作為評價植物的抗性指標(biāo)之一，可溶性糖（SSC）和可溶性蛋白（SP）等有機(jī)物質(zhì)含量的增加，可以維持植物葉片的水分吸收能力并延緩葉片的衰老［45］。而低氮脅迫中，因外界氮素的缺失，從而導(dǎo)致自身吸收合成的氮化物過少，可合成的蛋白質(zhì)減少，氮素的缺失會使植物自身的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)生改變［34］。陳瑩等［24］在高羊茅的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫使高羊茅的SP 顯著下降，指出SP 的合成受到了低氮脅迫的影響；李強(qiáng)等［46］在玉米苗研究中發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下的SP 呈下降趨勢，且耐低氮型玉米的下降幅度要小于氮敏感型玉米，同時指出耐低氮品種在低氮脅迫下更能維持自身的滲透調(diào)節(jié)能力；張楚等［47］在對苦蕎（Fagopyrum tataricum）的低氮脅迫中同樣發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下苦蕎的SP 顯著下降；以及王寧等［48］在對玉米的低氮脅迫研究中發(fā)現(xiàn)SSC 含量下降，并且發(fā)現(xiàn)SSC 降低的幅度與生物量降低幅度一致。在本研究中發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫會造成皮燕麥SSC、SP 含量顯著降低（P<0.05），基于以上，可以看出低氮環(huán)境會導(dǎo)致皮燕麥自身合成的氮化物減少，從而影響皮燕麥SSC 和SP 的合成，降低皮燕麥自身水分吸收能力與滲透調(diào)節(jié)能力，誘導(dǎo)早期皮燕麥葉片衰老。并且，耐低氮品種（青引1 號）的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的降幅小于氮敏感品種（駿馬、邊鋒、太陽神），因此可以認(rèn)為，耐低氮型皮燕麥可以保持相對較高的滲透調(diào)節(jié)能力從而增強(qiáng)自身的抗逆性，其延緩葉片衰老的能力也更強(qiáng)，這可能就是皮燕麥耐低氮脅迫的重要生理機(jī)制之一。

3.6 耐低氮品種篩選

氮脅迫是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一，且不同品種對氮脅迫也會有不同程度的響應(yīng)，而幼苗期作物的形態(tài)指標(biāo)、農(nóng)藝性狀、生理指標(biāo)都可作為評判耐性的主要依據(jù)［46-47］。植物的形態(tài)指標(biāo)可直觀地反映品種在脅迫下的耐性，植物的生理生化特性是植物在內(nèi)部機(jī)理上對低氮脅迫產(chǎn)生的響應(yīng)，進(jìn)而影響了其形態(tài)特征及產(chǎn)量等指標(biāo)［49-50］，形態(tài)和生理指標(biāo)可分別反映植物外部及內(nèi)部的抗性。因此，綜合形態(tài)與生理指標(biāo)來評價植物可以更全面地反映材料的耐低氮性。同時，鑒于各品種的固有差異，采用耐低氮系數(shù)來科學(xué)評價各品種的相對變化。并且，基于各指標(biāo)間相關(guān)性差異，運(yùn)用主成分分析和隸屬函數(shù)分析可以實(shí)現(xiàn)降維分析，能全面地分析各個指標(biāo)的數(shù)據(jù)及其相關(guān)性［51］。綜上，為了更準(zhǔn)確地對皮燕麥抗性進(jìn)行評價，本試驗(yàn)采用燕麥的形態(tài)指標(biāo)、光合指標(biāo)、氮代謝相關(guān)酶活性、硝態(tài)氮含量、活性氧含量及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等21 個指標(biāo)的耐低氮系數(shù)，通過相關(guān)性分析、主成分分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析相結(jié)合的方式來綜合評價18 份皮燕麥的耐低氮性。本研究首先采用隸屬函數(shù)與主成分分析相結(jié)合的方法，計(jì)算耐低氮綜合值（D）來評價皮燕麥的耐低氮性，盡可能減少單一方法的片面性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低氮脅迫中，所試驗(yàn)的品種里，耐低氮性較強(qiáng)的品種是甜燕70、青海甜燕麥和青海444，較弱的是駿馬、甜燕2 號和青燕2 號，其余材料耐低氮性居中。聚類分析將青海甜燕麥、美達(dá)、青海444、牧王、領(lǐng)袖、邊鋒劃分為耐低氮品種；將魅力、太陽神、莫妮卡、甜燕2 號、青燕2 號、槍手劃分為氮敏感品種；其余品種均為中等耐低氮品種。結(jié)合隸屬函數(shù)綜合評價與聚類分析所得結(jié)果來看，青海甜燕麥、青海444 在以上分析結(jié)果中均屬于耐低氮型品種，而甜燕2號、青燕2 號這兩份品種均屬于氮敏感型品種，所得結(jié)果還需大田試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。對于所篩選出來的耐低氮型品種青海甜燕麥，發(fā)現(xiàn)其在低氮脅迫下的活性氧含量大幅增加，但它的丙二醛（MDA）含量卻沒有大幅變化，這可能與其交替呼吸途徑強(qiáng)弱有關(guān)，因此推測青海甜燕麥的抗氧化脅迫能力較強(qiáng)，但還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

1）低氮脅迫對皮燕麥早期的形態(tài)及生理生化有顯著影響，早期燕麥的株高、地上部生物量在低氮脅迫下均呈顯著下降趨勢，根長變化以及地下部生物量變化不盡相同；同時凈光合速率、硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶等活性、可溶性蛋白與可溶性糖含量在受到低氮脅迫時均下降，而脅迫后的谷氨酸合成酶活性、活性氧含量與丙二醛含量會上升。

2）不同皮燕麥的耐低氮性不同，18 份材料中，耐低氮性較強(qiáng)的品種是青海甜燕麥、青海444，較弱的是甜燕2號和青燕2 號。