姚瑞瑞，劉歡*，趙桂琴，王敬龍，王綺玉，董凱，張然

（1.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院草業(yè)科學研究所，西藏 拉薩 850000）

作為農(nóng)業(yè)中最基本的生產(chǎn)資料，種子質量的高低直接影響到生產(chǎn)效益和種質資源的保存［1］。高活力的種子在種子萌發(fā)和幼苗建成等方面具有重要作用［2］，當年收獲的種子一般具有較高的活力，而種子在收獲后通常要經(jīng)過長時間的貯藏。短期內，種子在適宜的貯藏條件下活力基本變化不大，但隨著貯藏時間的延長，種子活力會逐漸下降，直至種子喪失活力甚至死亡［3-4］。大量研究表明，種子活力隨著貯藏年限的延長而明顯降低甚至喪失［5-6］，幼苗生長受到抑制［7］；細胞膜完整性喪失、酶活性失調、呼吸作用減弱、貯藏物質含量和超微結構等均會隨著貯藏時間的延長而受到不同程度的影響［8-10］。

燕麥（Avena sativa）是禾本科（Gramineae）燕麥屬（Avena）一年生草本植物［11］，以外部形態(tài)為分類依據(jù)，可分為皮燕麥和裸燕麥［12］。隨著我國畜牧業(yè)的迅速發(fā)展、草地植被恢復面積的逐年擴增，以及人類對健康的日益重視，燕麥類產(chǎn)品的消費量不斷增加。然而，貯藏時間嚴重制約著燕麥的種質保存和利用，優(yōu)質的種子是農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎，也是植物種質資源創(chuàng)新的重要原料及有效保存體［13］。燕麥種子在短時間內能夠保持較高的內部活力，但隨著貯藏時間的延長和貯藏環(huán)境的改變，種子的正常生理代謝功能和細胞結構便會遭受不同程度的損傷，導致不可逆且不可避免的老化［8］；同時燕麥種子內油脂含量高，尤其是不飽和脂肪酸含量高［14］，更容易導致種子發(fā)生劣變而不耐貯藏，從而降低其利用價值［15-16］。因此，明確皮、裸燕麥種子劣變過程及內在機制，為老化種子的修復提供依據(jù)，對于種質資源的長期保存具有重要意義。

功能和結構息息相關，種子活力變化的一個重要原因就是組織細胞結構的變化［17］。目前，關于燕麥種子的研究多集中在鹽、堿脅迫對燕麥生理生化影響［18-20］以及自然老化和人工老化對種子遺傳完整性［6，21-23］等方面，有關貯藏年限對皮、裸燕麥種子萌發(fā)和細胞學結構影響方面的研究還鮮見報道。因此本研究探討皮、裸燕麥種子的種子活力、細胞解剖結構和種胚、線粒體超微結構隨貯藏年限的變化規(guī)律，以探究老化過程中細胞程序性死亡在燕麥種子中發(fā)生的具體部位和時間進程，為燕麥種子自然老化的生理機制研究提供依據(jù)，并為燕麥的科學貯藏及其高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

應試材料為皮燕麥品種‘隴燕3 號’和裸燕麥品種‘白燕2 號’，燕麥種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院提供。2 個燕麥品種均種植于甘肅省通渭縣華家?guī)X鎮(zhèn)，該地屬溫帶季風氣候，年平均氣溫3.7 ℃，年均降水量451.1 mm。種子密封貯藏于甘肅省蘭州市甘肅農(nóng)業(yè)大學牧草實訓基地種子室（室內全年通風，貯藏期間年均溫度為10 ℃），貯藏年限分別為2、4、6、8年（表1）。

表1 皮燕麥、裸燕麥種子不同貯藏時間處理Table 1 Covered oat and naked oat seeds were treated with different storage time

試驗于2022 年3 月在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院試驗室進行。根據(jù)樣品種子的初始含水量，采用飽和溶液法將樣品種子含水量進行調整，獲得含水量為10%的種子樣品［9］。計算公式為：達到所需含水量的種子質量（W，g）=［（100-MC0）÷（100-MCr）］×W0，式中：MC0為種子初始含水量（%），MCr為種子需要達到的含水量（%），W0為種子初始質量（g）。稱量干凈飽滿燕麥種子，將種子放入裝有NaBr 飽和溶液的干燥器中平衡水分，頻繁稱量種子質量，達到所需的質量時立即將種子取出，迅速密封于10.0 cm×14.8 cm 鋁箔袋中，保存于4 ℃冰箱內備用［24］測定各指標。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)指標的測定 根據(jù)《種苗評定與種子活力測定方法手冊》［25］規(guī)定的培養(yǎng)皿紙上法進行燕麥種子萌發(fā)試驗，并逐日統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)，每個處理4 次重復，每重復50 粒種子。

式中：Dt為發(fā)芽天數(shù)（d）；Gt為Dt對應時間的發(fā)芽數(shù)；S為發(fā)芽10 d 幼苗的鮮重（g）。

幼苗芽長、根長：幼苗生長10 d 后，用游標卡尺測定每株幼苗從種子胚到最長葉葉尖和最長根根尖的長度，每皿隨機測定5 株。

浸出液電導率的測定：隨機取凈種子50 粒放入150 mL 三角瓶中，向內加入100 mL 去離子水并搖晃瓶身至種子完全浸沒。每個處理4 次重復，以未放種子的去離子水為空白對照。瓶口用封口膜封好，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h（±15 min）后，立即測定溶液的電導率［25］。

1.2.2 燕麥種子解剖結構測定 采用常規(guī)石蠟切片法，參照陳陽等［26］的方法并進行了改良，具體步驟如下：取燕麥種子適量，放入蒸餾水中浸泡4 h 后轉入FAA 混合固定液（福爾馬林∶冰醋酸∶70%乙醇=1∶1∶18）中固定24 h。采用不同濃度的乙醇梯度脫水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇）。乙醇和二甲苯逐級透明，每級3/4 h［無水乙醇∶二甲苯（體積比2∶1）、無水乙醇∶二甲苯（1∶1）、無水乙醇∶二甲苯（1∶2）、二甲苯］。透明材料轉入裝有碎蠟的二甲苯中，浸蠟溫度由37 ℃上升至56 ℃，逐漸置換為純石蠟后于56 ℃恒溫箱中過夜，浸蠟2 d，期間換蠟3 次。包埋后修塊、切片（厚度為10 μm）、展片、45 ℃烘片。二甲苯中脫蠟，乙醇梯度復水后番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封片，放在40 ℃烘箱中烘片，之后永久保存。在顯微鏡下觀察并拍照。每個處理重復5 次，每張樣片選取5 個視野。

1.2.3 種胚及線粒體超微結構觀察 采用透射電鏡法，操作步驟如下：隨機選取待測燕麥種子，在蒸餾水中浸泡4 h 后，用解剖針在體式顯微鏡下將其種胚取出，經(jīng)3%戊二醛預固定后采用1%四氧化鋨再固定。丙酮逐級脫水（30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%），100%濃度的丙酮換3 次。Ep812 包埋，半薄切片用甲苯胺藍染色作光學定位，在超薄切片機上用鉆石刀切片，再經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛室溫下雙重染色，用JEM-1400FLASH［日本電子（JEOL）］透射電鏡觀察樣品切片，并拍攝細胞及線粒體照片［27］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件整理試驗數(shù)據(jù)并繪制圖表，使用IBM SPSS Statistics 24.0 軟件進行雙因素方差分析與單因素ANOVA 檢驗，用Adobe Photoshop CC 2018 做拼圖處理。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏時間對皮、裸燕麥種子萌發(fā)的影響

如圖1，‘隴燕3 號’在貯藏4 年時，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均達到最大值，較貯藏2 年種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)升高51.44%和58.89%，差異顯著（P<0.05）；貯藏6 年時，‘隴燕3 號’發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)開始顯著下降（P<0.05）。隨著貯藏時間的增加，‘白燕2 號’發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)整體均表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，在貯藏6 和8 年時，種子發(fā)芽指數(shù)降至10.22%和4.66%，較貯藏2 年時各降低65.43%和84.24%，差異顯著（P<0.05）；活力指數(shù)降至41.14%和3.14%，較貯藏2 年時各降低81.69%和98.60%，差異顯著（P<0.05）。

圖1 貯藏時間對皮、裸燕麥種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of storage time on seed germination of covered oats and naked oats

如圖1，隨著貯藏時間的增加，‘隴燕3 號’的芽長與根長無明顯變化。而‘白燕2 號’的芽長則表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，在貯藏8 年時‘白燕2 號’燕麥種子芽長較貯藏2 年顯著降低34.28%（P<0.05）；其根長表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，貯藏4 年時，根長較貯藏2 年升高12.94%，差異不顯著（P>0.05）。貯藏8 年時，根長較貯藏2 年降低41.74%，差異顯著（P<0.05）。綜上，‘隴燕3 號’和‘白燕2 號’相比，‘隴燕3 號’發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長和根長變化更為穩(wěn)定。

由表2 可知，不同品種間燕麥種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長、根長和電導率存在極顯著差異（P<0.01）。不同貯藏年限下燕麥種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和電導率存在極顯著差異（P<0.01），而芽長與根長差異不顯著。品種和貯藏時間交互作用下的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長和電導率存在極顯著差異（P<0.01），表明貯藏時間對不同品種的各萌發(fā)指標影響較大，且存在交互作用。

表2 貯藏時間對皮、裸燕麥種子萌發(fā)和細胞膜透性的方差分析Table 2 Variance analysis of storage time on covered，naked oat seed germination and cell membrane permeability

如圖2 所示，在貯藏4 年時，‘隴燕3 號’種子發(fā)芽率達到最大值，隨后種子活力緩慢下降，但降幅不大；隨著貯藏時間的增加，‘白燕2 號’燕麥種子發(fā)芽率逐漸下降，在貯藏6～8 年時，種子發(fā)芽率急劇下降，種子活力逐漸喪失。

圖2 貯藏時間對皮、裸燕麥種子活力的影響Fig.2 Effect of storage time on seed viability of covered and naked oat seeds

2.2 不同貯藏時間對皮、裸燕麥種子細胞膜透性的影響

如圖3 所示，隨著貯藏時間的增加，‘隴燕3 號’種子的電導率表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。在貯藏4、6 和8年時，‘隴燕3 號’的電導率較貯藏2 年顯著升高（P<0.05）?！籽? 號’的電導率表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，在貯藏6 和8 年時，‘白燕2 號’的電導率較貯藏2年顯著升高（P<0.05）。綜上，兩個不同燕麥種質相比，隨著貯藏年限的增加，‘白燕2 號’的細胞膜透性受影響更大。

圖3 貯藏時間對皮、裸燕麥種子電導率的影響Fig.3 Effect of storage time on electrical conductivity of covered and naked oat seeds

2.3 不同貯藏時間對皮、裸燕麥種子解剖結構的影響

隨著貯藏年限的增加‘隴燕3 號’和‘白燕2 號’解剖結構發(fā)生變化。如圖4 所示，貯藏2 年‘隴燕3 號’燕麥種子胚乳中內含物豐富，均勻的散布在胚乳中；種皮薄且經(jīng)番紅-固綠染色淺；糊粉層細胞排列整齊，細胞形狀近似于長方形，有些細胞內部甚至可以清晰地看到細胞核；種子次級糊粉層細胞內部糊粉粒即蛋白貯藏液泡（protein storage vacuole，PSV）豐富，都集中在細胞內部（圖4 A 和B）。貯藏8 年的‘隴燕3 號’燕麥種子胚乳細胞較貯藏2年種子無明顯變化；而燕麥種子種皮經(jīng)番紅-固綠染色深且變厚，糊粉層細胞多達數(shù)層，細胞排列不整齊，形狀不規(guī)則且部分細胞出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象；一些細胞內部仍然可以看到細胞核，次級糊粉層細胞內部出現(xiàn)破碎化，細胞內部糊粉粒出現(xiàn)輕微降解現(xiàn)象（圖4 C 和D）。

圖4 貯藏時間對皮、裸燕麥種子解剖結構的影響（×400）Fig.4 Effects of storage time on the anatomy of covered and naked oat seeds（×400）

貯藏2 年‘白燕2 號’燕麥種子胚乳中內含物豐富，均勻的散布在胚乳中。貯藏8 年的燕麥種子胚乳內細胞排列疏松，細胞間隙變大，細胞內含物個體變小且數(shù)量變少（圖4 E 和G）。貯藏2 年‘白燕2 號’燕麥種子糊粉層細胞排列整齊有序，細胞形狀類似于長方形，種皮經(jīng)番紅-固綠染色淺，次級糊粉層細胞內部糊粉粒豐富，細胞與細胞之間有序排列；貯藏8 年糊粉層細胞較貯藏2 年燕麥種子糊粉層細胞狹長，且細胞內部出現(xiàn)質壁分離現(xiàn)象，細胞形狀不規(guī)則，次級糊粉層細胞內部PSV 出現(xiàn)嚴重降解現(xiàn)象，細胞內部出現(xiàn)大量無結構液滴，細胞內部蛋白體數(shù)量變少（圖4 F 和H）。綜上，‘白燕2 號’較‘隴燕3 號’燕麥種子解剖結構受貯藏年限的影響更為明顯。

2.4 不同貯藏時間對皮、裸燕麥種子種胚細胞及線粒體超微結構的影響

燕麥種子種胚超微結構的電子顯微鏡圖片（圖5）顯示，貯藏2 年燕麥種胚細胞基本維持正常狀態(tài)，細胞結構清晰、細胞器正常；細胞核結構完整，核仁致密與核質界限分明，核內常染色質分布均勻，核膜清晰可見，結構與功能狀態(tài)良好；線粒體形狀呈扁平或橢圓形，線粒體膜和核膜清晰可見，且線粒體基質稠密；‘白燕2 號’細胞膜出現(xiàn)褶皺現(xiàn)象，部分地方細胞間隙變大，且細胞內聚集大量脂肪體，‘隴燕3 號’細胞膜平滑正常，細胞壁與細胞膜緊密貼合，且細胞內含有大量的線粒體和內質網(wǎng)，細胞膜周圍聚集少量脂肪體（圖5 A、B、E、F）。

經(jīng)過8 年的貯藏后，‘隴燕3 號’燕麥種胚細胞內遍布大量脂肪體，部分脂肪體出現(xiàn)溶解的現(xiàn)象；‘白燕2 號’燕麥種胚細胞形狀維持正常狀態(tài)，細胞結構清晰。細胞內脂肪體數(shù)量相較于貯藏2 年時變少，2 個燕麥種質種胚細胞內靠近細胞膜的脂肪體溶解，逐步被原液泡吞噬，形成大液泡；隨著貯藏時間的增加，‘隴燕3 號’細胞核較貯藏2 年時染色質嚴重濃縮，核仁消失；細胞膜出現(xiàn)明顯的褶皺現(xiàn)象，細胞間隙變大；‘白燕2 號’細胞核核膜溶解，染色質出現(xiàn)輕微濃縮現(xiàn)象，核邊緣皺縮；隨著貯藏年限的增加，兩個燕麥種質內部少數(shù)線粒體出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，但大部分線粒體結構均能保持良好的完整性（圖5 C、D、G、H）。

3 討論

3.1 貯藏時間對皮、裸燕麥種子萌發(fā)特性的影響

植物完成其生活史的關鍵階段就是種子萌發(fā)，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等參數(shù)是衡量種子優(yōu)劣的重要指標，也是反映種子活力變化最可靠和直接的指標［28］，直接影響到種子的田間出苗率［29］。試驗中隨著貯藏時間的延長，燕麥種子逐漸老化，表現(xiàn)為種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)逐漸降低。且不同皮、裸燕麥品種、貯藏時間及其交互作用下的種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長、根長、電導率差異顯著（P<0.05）。張雯靜等［30］研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏年限的增加，大蔥（Allium fistulosum）種子各項萌發(fā)指標也有類似變化規(guī)律。在貯藏初期，‘隴燕3 號’種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)明顯低于‘白燕2 號’種子，這可能是因為‘隴燕3 號’為皮燕麥，其外稃的機械約束作用在一定程度上延遲了種子的發(fā)芽時間［9，31］。貯藏時間也不同程度地影響著燕麥種子幼苗的生長。試驗發(fā)現(xiàn)，‘白燕2 號’種子幼苗的芽長和根長隨著貯藏時間的增加而降低，‘隴燕3 號’則無明顯變化。種子萌發(fā)和幼苗生長方面的這些表現(xiàn)證明，在同等貯藏環(huán)境下，‘隴燕3 號’比‘白燕2 號’更耐貯藏。

電導率是常被用來判定種子活力的一個重要指標。隨著種子貯藏時間的增加，2 個燕麥種質的種子浸提液的電導率都隨著貯藏時間的增加而升高，表明種子細胞膜隨貯藏時間的增加逐漸損壞和老化，電導率與種子的活力呈負相關，而種子活力下降的主要原因是細胞膜的降解及其作為半透膜能力的退化［32］，種子內部會發(fā)生一系列生理生化反應，從而導致細胞膜結構改變，細胞膜完整性喪失，膜內脂蛋白變性，種子內可溶性物質滲漏，細胞內外滲透壓的動態(tài)平衡被打破［33］。Xin 等［34］對大豆（Glycine max）種子進行人工老化研究時也有同樣發(fā)現(xiàn)。

3.2 貯藏時間對皮、裸燕麥種子細胞解剖結構的影響

種子在生理成熟期活力達到最高，隨后在貯藏過程中，種子活力開始下降［35］，內部各功能、結構受到不同程度的損傷，且貯藏時間越久，受損程度也就越大，最終導致種子質量下降［36］。對燕麥種子解剖結構觀察發(fā)現(xiàn)，與其他禾本科植物種子解剖結構基本相同［37］，燕麥種子的結構由種皮、胚和胚乳構成，且胚藏于胚乳之中。有研究發(fā)現(xiàn)，正常種子在萌發(fā)過程中，糊粉層細胞會通過分解細胞內的糊粉粒與原球體來產(chǎn)生一系列水解酶、蛋白酶等，以分解胚乳中貯藏的營養(yǎng)物質［38］，為胚的前期生長提供養(yǎng)分。本研究中‘隴燕3 號’種子在貯藏8 年后，糊粉層細胞出現(xiàn)輕微破碎化，‘白燕2 號’糊粉層細胞出現(xiàn)嚴重破損且細胞間隙變大，PSV 降解嚴重，細胞內部出現(xiàn)大量液滴狀結構。這可能是由于在貯藏期間糊粉層細胞內的糊粉粒與原球體提前出現(xiàn)水解現(xiàn)象，因而在細胞學上觀察到破碎化現(xiàn)象，另外當糊粉層細胞完成分泌功能后，發(fā)生細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），剩余部分相互融合并液泡化，最終成為無結構的液滴［39］。燕麥糊粉層細胞PCD 過程中最初較小的PSV 逐漸相互融合成為大的液泡，之后液泡破裂消失。其進程會直接影響到糊粉層PCD 的進程，抑制液泡融合阻緩了糊粉層PCD 進程，從而影響燕麥種子的萌發(fā)。這與鄭巖等［40］在水稻（Oryza sativa）種子糊粉層液泡化進程的研究結果一致。皮燕麥外殼可以保護穎果免受各種生物和非生物脅迫，陶金等［41］在探究燕麥的耐鹽萌發(fā)特性時發(fā)現(xiàn)，皮燕麥的耐鹽性高于裸燕麥。塔娜等［42］對4 份皮燕麥和5 份裸燕麥材料的抗性進行了分析，結果表明皮燕麥的抗性比裸燕麥的強，特別是抗倒伏能力尤為突出。本研究中由于‘隴燕3 號’為皮燕麥，其外稃在一定程度上起到了保護作用，而‘白燕2 號’為裸燕麥，因而種子內部結構受影響較大。

3.3 貯藏時間對皮、裸燕麥種子種胚細胞及線粒體超微結構的影響

本研究中，短時間貯藏（2 年）的燕麥種子種胚細胞結構狀態(tài)良好，隨著貯藏時間的增加，燕麥種胚細胞內細胞核染色質凝聚，細胞內核酸代謝減弱，部分線粒體腫脹成球形且線粒體膜不清晰，脂肪體水解。線粒體作為細胞能量代謝的主體和自由基產(chǎn)生的主要部位［28］，其結構的損傷將直接影響細胞的能量代謝和自由基水平。可見燕麥種子在貯藏過程中發(fā)生了脂質過氧化反應，使靠近活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生位點的線粒體內膜發(fā)生過氧化，線粒體膜系統(tǒng)遭到嚴重破壞，胚細胞中的能量代謝、物質代謝已不能正常進行，燕麥種子胚細胞衰老嚴重。貯藏微環(huán)境下的小麥（Triticum aestivum）胚細胞超微結構變化也有近似的發(fā)現(xiàn)［43］?？梢姡N子發(fā)生劣變時，細胞學上的劣變現(xiàn)象也隨之發(fā)生，尤其是線粒體超微結構的變化是對老化導致的氧化脅迫的應激反應，線粒體膜和脊受到損傷，線粒體的呼吸功能無法正常進行［44］，進而影響呼吸鏈電子的正常傳遞，呼吸作用減弱，使燕麥種子萌發(fā)過程中ATP 供應不足，導致種子活力下降，萌發(fā)率降低，進而影響幼苗的形態(tài)建成。

4 結論

貯藏年限嚴重影響燕麥種子糊粉層細胞和線粒體結構與功能的完整性。在貯藏過程中，燕麥種子糊粉層細胞水解，細胞核邊緣皺縮，染色質濃縮，核仁消失，且貯藏時間越久，細胞衰老越快。本研究中，隨著貯藏時間的增加，‘隴燕3 號’和‘白燕2 號’燕麥種子解剖結構及種胚和線粒體超微結構受損嚴重，進而導致種子活力下降。