李玉珠，余江弟，丁菲菲，苗佳敏，白小明，師尚禮

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將目的基因或基因編輯產(chǎn)物插入受體植物的基因組，獲得的再生植株為進(jìn)一步研究基因功能并開展新品種選育工作奠定基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的再生能力是決定遺傳轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵因子，也是限制轉(zhuǎn)基因及基因編輯技術(shù)在植物上廣泛應(yīng)用的主要瓶頸。植物再生的基礎(chǔ)是植物細(xì)胞的全能性，即單個(gè)分化的體細(xì)胞或分生組織細(xì)胞再生成完整植株的能力［1］。盡管植物細(xì)胞具有全能性，但自然界中的37 萬多種高等植物中，只有不到0.1%的植物可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作［2］。對(duì)于已建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的植物，基于農(nóng)桿菌侵染和基因槍轟擊的轉(zhuǎn)化技術(shù)通常需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力通過組織培養(yǎng)獲得再生植株。經(jīng)愈傷組織形成的再生芽發(fā)生（de novoshoot organogenesis）和體胚發(fā)生（somatic embryogenesis，SE）是許多植物產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系的標(biāo)準(zhǔn)程序。隨著對(duì)愈傷組織形成和再生分子機(jī)制研究的不斷深入，與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素（cytokinin，CK）生物合成、感應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因和發(fā)育調(diào)節(jié)基因在調(diào)控植物體外再生中的功能被鑒定，這些基因在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用能顯著提高再生效率和轉(zhuǎn)化效率，縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間，實(shí)現(xiàn)在更廣泛的物種和基因型上開展轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)。本研究在總結(jié)遺傳轉(zhuǎn)化過程中植物體細(xì)胞再生完整植株的不同途徑和方式基礎(chǔ)上，以再生芽發(fā)生和體胚發(fā)生的間接再生途徑為主，闡釋了影響再生的因素和分子機(jī)制及再生促進(jìn)基因（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因和發(fā)育調(diào)節(jié)基因）在提高遺傳轉(zhuǎn)化效率方面的應(yīng)用，并提出了今后開展研究的方向及前景。

1 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生方式

植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中的外植體取材廣泛，根據(jù)體細(xì)胞來源不同可分為兩種類型，一種是存在于莖分生組織中的未分化細(xì)胞，即干細(xì)胞（stem cell，SC），另一種是已分化的體細(xì)胞。SC 是植物體所有地上器官的來源，但數(shù)量稀少且難以直接進(jìn)行遺傳操作，目前僅在大豆（Glycine max）［3-5］、黃羽扇豆（Lupinus luteus）［6］和小麥（Triticum aestivum）［7］上有成功被用于遺傳轉(zhuǎn)化并再生植株的報(bào)道。利用已分化的體細(xì)胞作為外植體時(shí)，這些體細(xì)胞需經(jīng)過重編程，重獲多能性或全能性后再生完整植株。根據(jù)再生方式和再生產(chǎn)物的不同，已分化體細(xì)胞的再生可分為器官發(fā)生途徑和體胚發(fā)生途徑，這兩個(gè)途徑都有直接發(fā)生方式和間接發(fā)生方式。間接發(fā)生方式中，外植體首先形成愈傷組織，通過愈傷組織的增殖和分化，以再生莖發(fā)生方式或體胚發(fā)生方式再生。直接發(fā)生方式中，外植體繞過愈傷組織誘導(dǎo)階段，直接發(fā)育成體胚或莖等營(yíng)養(yǎng)器官。因此，植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中被轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的再生方式共有5 種，分別是依賴分生組織的器官發(fā)生、依賴愈傷組織形成的器官發(fā)生或體胚發(fā)生以及繞過愈傷組織形成的器官發(fā)生或體胚發(fā)生。器官發(fā)生的間接途徑（即外植體—愈傷組織—再生莖發(fā)生或體胚發(fā)生）是大多數(shù)植物在遺傳轉(zhuǎn)化中實(shí)現(xiàn)體外再生的方式。在此過程中，愈傷組織的誘導(dǎo)、具備多能性或全能性細(xì)胞的獲得以及芽再生或體胚再生是實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化與植株再生的重要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟。

2 愈傷組織誘導(dǎo)和再生分子機(jī)制的研究進(jìn)展

外源植物激素誘導(dǎo)愈傷組織形成和再生的過程可分為4 個(gè)階段，依次是外植體身份特征的消除、根特性的重新建立、莖特性的重新建立以及器官發(fā)生或體胚發(fā)生方式再生完整植株［8］。許多遺傳和環(huán)境因子都會(huì)影響這個(gè)過程，其中，創(chuàng)傷、表觀遺傳修飾、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的作用最為重要。

2.1 早期創(chuàng)傷反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

創(chuàng)傷是誘導(dǎo)愈傷組織形成的外部因素，它引起外植體發(fā)生一系列物理和化學(xué)變化，這些變化始于對(duì)創(chuàng)傷引起的相關(guān)分子模式的感知，并觸發(fā)胞質(zhì)鈣信號(hào)和活性氧簇的爆發(fā)。局部創(chuàng)傷信號(hào)被翻譯成長(zhǎng)距離信號(hào)后，進(jìn)一步誘導(dǎo)表觀遺傳修飾發(fā)生、生長(zhǎng)素和CK 的合成與積累以及生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)［9-10］。創(chuàng)傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄上調(diào)表達(dá)的基因包括染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)基因POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX2（PRC2），細(xì)胞周期基因CYCLINs（CYCs）和CYCLINDEPENDENT KINASES（CDKs），細(xì)胞分裂素合成基因ISOPENTENYL TRANSFERASE（IPT），生長(zhǎng)素合成基因YUCCA5（YUC5），創(chuàng)傷反應(yīng)中心調(diào)節(jié)因子WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATION1-4（WIND1-4）和芽再生增強(qiáng)因子ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1（ESR1）等［10-11］。其中，CYCs和CDKs的表達(dá)可重新激活細(xì)胞周期，從而使細(xì)胞重獲增殖能力，這是愈傷組織形成的中心機(jī)制［12］，而WINDs通過直接與ESR1啟動(dòng)子結(jié)合并上調(diào)其表達(dá)促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)［13］。沒有創(chuàng)傷處理時(shí)，擬南芥（Arabidopsis thaliana）的根在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（callus induction media，CIM）和莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（shoot induction media，SIM）上只能長(zhǎng)出側(cè)根而不能再生莖，說明創(chuàng)傷是從根到莖的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變所必需的［14］。CIM 上的根因剪切造成傷口后可顯著提高體胚發(fā)生效率，也證實(shí)了創(chuàng)傷應(yīng)激和激素誘導(dǎo)的再生之間存在緊密關(guān)系［15］。

2.2 表觀遺傳修飾

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的表觀遺傳修飾會(huì)引起與愈傷組織誘導(dǎo)有關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生全基因組水平的變化［16-17］。組蛋白H3 第27 位賴氨酸的三甲基化修飾（H3K27me3）是一類重要的轉(zhuǎn)錄抑制性翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)進(jìn)程中發(fā)揮作用，也是葉片外植體轉(zhuǎn)化為愈傷組織的關(guān)鍵因子。PRC2是H3K27me3 建立和維持的關(guān)鍵基因，該基因既可沉默葉片發(fā)育調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，也可去除生長(zhǎng)素合成基因YUC4和生長(zhǎng)素/吲哚-3-乙酸基因auxin/INDOLE-3-ACETIC ACID2（AUX/IAA2）以及根發(fā)育調(diào)控基因WOX5（WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5）和SHORT-ROOT（SHR）上的抑制性甲基標(biāo)記，直接參與葉片身份的消除［18］。此外，PRC2 介導(dǎo)的抑制性組蛋白修飾也控制創(chuàng)傷響應(yīng)基因WIND的表達(dá)［19］，WIND通過上調(diào)B型反應(yīng)調(diào)節(jié)因子ARR-B（type-B ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR）的表達(dá)水平激活CK 生物合成途徑，促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)［20］。染色質(zhì)重塑蛋白PICKLE（PKL）可結(jié)合在H3K27me3 靶基因的啟動(dòng)子區(qū)直接影響H3K27me3 水平［21］，并通過組蛋白去乙?；种艭K 響應(yīng)，其突變體中因H3K37me3 水平的降低而形成愈傷組織［22］。染色質(zhì)修飾基因ARABIDIPSIS TRITHORAX4（ATX4）的表達(dá)在愈傷組織誘導(dǎo)期間被抑制，當(dāng)莖身份基因KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX GENE 4（KNAT4）和YABBY 5（YAB5）上的H3K4me3 甲基基團(tuán)被去除后，該基因被重新激活并促進(jìn)器官發(fā)生途徑的再生［23］。此外，表觀遺傳重編程也引起愈傷組織誘導(dǎo)和再生過程中關(guān)鍵基因，即發(fā)育調(diào)節(jié)基因表觀遺傳狀態(tài)的局部變化。這些關(guān)鍵基因包括WIND3，BABY BOOM（BBM），LEAFY COTYLEDON1（LEC1），LEC2和WOX5/11等［16］。因此，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的整體和局部修飾參與了愈傷組織形成和再生的所有過程，不同的表觀遺傳修飾組合和發(fā)生的時(shí)序性塑造了愈傷組織中不同細(xì)胞后續(xù)發(fā)育命運(yùn)的復(fù)雜性。

2.3 生長(zhǎng)素促進(jìn)愈傷組織形成和細(xì)胞多能性的獲得

細(xì)胞增殖能力的重新獲得是愈傷組織誘導(dǎo)的主要特征。CIM 上愈傷組織的形成類似側(cè)根原基發(fā)生過程，啟動(dòng)木質(zhì)部中柱鞘細(xì)胞分裂的激素是生長(zhǎng)素［24］。生長(zhǎng)素通過ARF（AUXIN RESPONSE FACTOR）轉(zhuǎn)錄因子ARF7 和ARF19 介導(dǎo)的側(cè)根形成相關(guān)基因LBD（LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN）的激活誘導(dǎo)愈傷組織形成，實(shí)現(xiàn)將生長(zhǎng)素信號(hào)通過側(cè)根形成基因轉(zhuǎn)化為細(xì)胞周期再激活的模式［25］。過表達(dá)調(diào)控側(cè)根形成的基因（LBD16、LBD17、LBD18和LBD29）可在無外源激素的情況下誘導(dǎo)愈傷組織的形成［26］。除了激活調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵基因，生長(zhǎng)素還可下調(diào)編碼細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDKs 的抑制基因KIP-RELATED PROTEN（KRP）以及生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)組蛋白乙?；璧木幋a轉(zhuǎn)錄接頭蛋白基因PROPORZ1（PRZ1，也稱為At-ADA2b）［27］，將生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞周期重激活模式。CIM 上培養(yǎng)的愈傷組織經(jīng)細(xì)胞增殖可獲得多能性。生長(zhǎng)素通過兩個(gè)不同的途徑促進(jìn)細(xì)胞多能性的獲得。一個(gè)途徑由WOX11和LBD16介導(dǎo)，LBD16被WOX11激活后在CIM 上形成的愈傷組織中特異表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞多能性獲得。一旦WOX11-LBD16途徑被阻斷會(huì)導(dǎo)致愈傷組織喪失多能性，在SIM 上無法再生莖［28］。另一個(gè)途徑涉及根分生組織發(fā)育調(diào)節(jié)基因PLT1和PLT2。生長(zhǎng)素通過PLT3、PLT5 和PLT7 激活PLT1和PLT2的表達(dá)，賦予細(xì)胞多能性［29-30］。PLT3、PLT5 和PLT7 也能調(diào)節(jié)芽再生促進(jìn)基因CUC2（CUP-SHAPED COTYLEDON2）的表達(dá)［31］，使SIM 上具備多能性的細(xì)胞再生完整莖［29］。因此，組織培養(yǎng)中芽再生過程包括兩個(gè)不同的步驟，分別是CIM 上多能細(xì)胞的形成以及SIM 上多能細(xì)胞再生莖。芽再生過程中生長(zhǎng)素的作用尚不明確，但YUC1和YUC4可在SIM 上被誘導(dǎo)，芽再生需要YUC 介導(dǎo)的生長(zhǎng)素合成［32］。

2.4 細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)愈傷組織形成和芽再生

CK 誘導(dǎo)愈傷組織形成的關(guān)鍵組分是B 型ARRs。B 型ARRs 促進(jìn)細(xì)胞周期重啟的靶蛋白是CYCD3（一種D型細(xì)胞周期蛋白），在缺乏外源CK 時(shí)，過表達(dá)CYCD3可誘導(dǎo)擬南芥愈傷組織的形成［33］。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員ESR（ENHANCED SHOOT REGENERATION）參與CK 信號(hào)通路，可通過直接激活CYCD1；1的表達(dá)促進(jìn)愈傷組織形成。在不含外源激素的培養(yǎng)基上過表達(dá)ESR1和其功能冗余同源基因ESR2可誘導(dǎo)擬南芥愈傷組織的形成［34］。ESR 也能上調(diào)縮短G1期持續(xù)時(shí)間的OBP1基因（OBF BINDING PROTEIN1），后者可直接與CYCD3；3和S 期特異轉(zhuǎn)錄因子基因DOF2；3（DOF TF OBF2；3）的啟動(dòng)子序列結(jié)合［35］。因此，CK 通過ESR 介導(dǎo)的細(xì)胞周期重新激活方式實(shí)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)，該過程受多個(gè)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控以共同協(xié)調(diào)不同細(xì)胞周期基因的表達(dá)。CK 通過WOX5 和 B 型 ARR12 抑制ARRs-A表達(dá)，隨著CIM 上誘導(dǎo)的愈傷組織對(duì)CK 響應(yīng)敏感性的增強(qiáng)可使細(xì)胞獲得多能性。CK 可誘導(dǎo)SIM 上獲得多能性的細(xì)胞再生芽，涉及CK 響應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因調(diào)控該過程。CK 受體組氨酸激酶（histidine kinases，HKs）在芽再生中起主要作用［36］，過表達(dá)CK 下游信號(hào)成分，如ARR1可在沒有外源CK 的情況下再生芽［37］。CK 誘導(dǎo)芽再生的關(guān)鍵基因是WUSCHEL（WUS）。WUS表達(dá)水平的增加足以激活不定芽形成［38］，WUS的功能缺失突變體則無法在SIM 上實(shí)現(xiàn)芽再生［39］。CK 是通過ARR（ARR1、ARR10 和ARR12）的介導(dǎo)激活了WUS的表達(dá)，促進(jìn)莖頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）的形成［40-42］。該過程中，Ⅲ類同源結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈（class Ⅲ homeodomain-leucine zipper，HD-Zip Ⅲ）轉(zhuǎn)錄因子PHABULOSA（PHB）、PHAVOLUTA（PHV）和REVOLOTA（REV）直接與B 型ARR 相互作用以激活WUS的表達(dá)，是CK 誘導(dǎo)WUS表達(dá)和隨后芽再生不能缺少的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［43］。

2.5 生長(zhǎng)素誘導(dǎo)體胚發(fā)生

外源生長(zhǎng)素2，4-D 用于誘導(dǎo)擬南芥體胚時(shí)，胚性愈傷組織表面或內(nèi)部首先形成原胚團(tuán)（proembryogenic masses，PEMs），增殖后的PEMs 被轉(zhuǎn)移到無生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，PEMs 中的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)可進(jìn)一步完成胚胎發(fā)育再生完整植株［44］。研究表明，體胚發(fā)生是胚胎調(diào)節(jié)基因通過調(diào)控生長(zhǎng)素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的，內(nèi)源性生長(zhǎng)素的生物合成是細(xì)胞獲得全能性的重要條件［45］。胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到無生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基后，依賴PIN1 介導(dǎo)的極性生長(zhǎng)素運(yùn)輸導(dǎo)致其表層細(xì)胞形成生長(zhǎng)素最大值區(qū)域。同時(shí)，依賴YUC 的生長(zhǎng)素從頭合成使內(nèi)源生長(zhǎng)素水平逐漸增加［46］。生長(zhǎng)素激活WUS表達(dá)，進(jìn)而激活胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)基因LEC1和LEC2［47-48］，這兩個(gè)基因與合子胚胎發(fā)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子BBM 和AGL15（AGAMOUS-LIKE 15）相互作用，形成包括多個(gè)正反饋通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［49-51］。這些胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)基因促進(jìn)YCUs，TAA1和IAA30的表達(dá)，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生［52-53］。

3 再生促進(jìn)基因提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的研究進(jìn)展

生長(zhǎng)素和CK 共同決定著植物組織和器官的再生方式和再生命運(yùn)。添加外源生長(zhǎng)素和CK 通過激活特定發(fā)育程序增強(qiáng)了體外再生反應(yīng)。參與植物生長(zhǎng)素和CK 生物合成、響應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因?qū)儆谏L(zhǎng)調(diào)節(jié)基因；控制細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)（全能性和多能性）的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆诎l(fā)育調(diào)節(jié)基因，也叫作形態(tài)發(fā)生基因［8］。它們?cè)谥参锲鞴侔l(fā)生和體胚發(fā)生過程中存在緊密的調(diào)控關(guān)系，在分子水平上共同影響遺傳轉(zhuǎn)化和體外再生，統(tǒng)稱為再生促進(jìn)基因（表1）。

表1 植物再生促進(jìn)基因在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用Table 1 Application of regeneration-promoting genes in the improvement of plant transformation system

WUS是SAM 中維持干細(xì)胞生態(tài)位最重要的發(fā)育調(diào)節(jié)基因，也是生長(zhǎng)素和CK 調(diào)控植物細(xì)胞重獲多能性或全能性的關(guān)鍵基因。過表達(dá)WUS被用于促進(jìn)植物遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化細(xì)胞通過體胚發(fā)生［54-56］和器官發(fā)生方式再生［57-58］。由于生長(zhǎng)素和CK 都能調(diào)節(jié)WUS表達(dá)，因此持續(xù)表達(dá)WUS的轉(zhuǎn)基因植株常具有異常表型。通過分別構(gòu)建ZmWUS2基因和選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體，再共同侵染玉米（Zea mays）未成熟胚的方法，可獲得僅表達(dá)選擇標(biāo)記基因而不含ZmWUS2的T0代正常轉(zhuǎn)基因玉米植株。該方法利用玉米磷脂轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子ZmPLTP 驅(qū)動(dòng)ZmWUS2的表達(dá)，在WUS2T-DNA 不整合但選擇性標(biāo)記T-DNA 整合的細(xì)胞中，瞬時(shí)WUS2的表達(dá)刺激含有選擇性標(biāo)記的相鄰細(xì)胞以體胚發(fā)生方式再生。研究者將這種利用形態(tài)發(fā)生基因瞬時(shí)表達(dá)刺激含靶基因的細(xì)胞發(fā)生再生的方法叫作“利他轉(zhuǎn)化”［59］。

3.1 生長(zhǎng)素相關(guān)的再生促進(jìn)基因

AP2/ERF（APETALA2/ETHYLENE RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR）轉(zhuǎn)錄因子家族基因BBM通過生長(zhǎng)素信號(hào)途徑誘導(dǎo)植物胚胎發(fā)生和器官發(fā)生［60-61］。過表達(dá)BBM基因的歐洲油菜（Brassica napus）［60］、煙草（Nicotiana tabacum）［62］、可可（Theobroma cacao）［63-64］和辣椒（Capsicum annuum）［65］通過器官發(fā)生或體胚發(fā)生方式再生。但這些轉(zhuǎn)基因植株的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官會(huì)出現(xiàn)不同程度的多效型表型。LEC1 和LEC2 是位于BBM 調(diào)控體胚發(fā)生途徑下游的轉(zhuǎn)錄因子［49］，過表達(dá)歐洲云杉（Picea abies）的LEC1 型基因PaHAP3A促進(jìn)了其體胚分化［66］。LEC2 可直接激活A(yù)GL15的表達(dá)，過表達(dá)GmAGL15使大豆轉(zhuǎn)化效率提高了2倍但轉(zhuǎn)基因植物具有異常表型［67］。SAUR15（small auxin-upregulated RNA15）是胚性愈傷組織誘導(dǎo)中生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子，敲除ZmSAUR15可通過提高玉米未成熟胚形成胚性愈傷組織的能力，將轉(zhuǎn)化效率提高5 倍［68］。

共表達(dá)BBM與WUS實(shí)現(xiàn)了許多組培執(zhí)拗型單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。Lowe 等［69］利用農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶啟動(dòng)子（Nos：ZmWUS2）低水平表達(dá)WUS2，結(jié)合玉米泛素啟動(dòng)子（ZmUbi：ZmBBM）高水平表達(dá)BBM成功獲得了玉米，高粱（Sorghum bicolor），甘蔗（Saccharum officinarum）和水稻（Oryza sativa）經(jīng)體胚發(fā)生途徑再生的轉(zhuǎn)基因植株。該方法使4 個(gè)執(zhí)拗型玉米自交系的轉(zhuǎn)化效率從0.0%～2.0%改變?yōu)?5.3%～51.7%，且效果顯著，并在33 個(gè)重要的商用‘先鋒’玉米自交系中成功實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。但BBM和WUS的持續(xù)表達(dá)會(huì)引起根的異常表型，且轉(zhuǎn)基因植株矮小而不育。Mookkan 等［70-71］設(shè)計(jì)了一種干旱誘導(dǎo)的CRE/lox 剪切策略，環(huán)化重組酶CRE（cyclization recombinase）識(shí)別loxP（locus of X-over P1）位點(diǎn)并表達(dá)，將轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織中的Nos：ZmWUS2和ZmUbi：ZmBBM切除，獲得了可育的T0代轉(zhuǎn)基因植物。該方法在執(zhí)拗型玉米品種‘B73’和高粱‘P898012’上實(shí)現(xiàn)了有效轉(zhuǎn)化，但干燥誘導(dǎo)的剪切方法需要3 個(gè)月時(shí)間的愈傷組織誘導(dǎo)。為了縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間，Lowe 等［72］嘗試使用不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BBM和ZmWUS2的表達(dá)，Nos：ZmWUS2和ZmPLTP：ZmBBM的組合使未成熟玉米胚在一周內(nèi)直接發(fā)生體胚，繞過愈傷組織形成階段發(fā)育，長(zhǎng)成健康的可育植株；ZmAxig1：ZmWUS2和ZmPLTP：ZmBBM的組合在7 個(gè)受試玉米基因型中同樣可誘導(dǎo)以體胚直接發(fā)生方式再生轉(zhuǎn)基因植株。Aregawi 等［73］利用兩個(gè)農(nóng)桿菌菌株同時(shí)轉(zhuǎn)化高粱，一個(gè)菌株含有ZmPLTP：ZmWUS2和ZmPLTP：ZmBBM，另一個(gè)菌株含有選擇標(biāo)記基因，成功獲得了僅表達(dá)選擇標(biāo)記基因而不含ZmWUS2和ZmBBM的T0代正常轉(zhuǎn)基因植株，通過“利他轉(zhuǎn)化”方法將高粱的轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短了近1/2，并使得之前幾個(gè)不能轉(zhuǎn)化的基因型成功得以轉(zhuǎn)化。最近，Wang 等［74］利用Nos：ZmWUS2和3xEnhZmUbi：ZmBBM的組合在禾本科4 個(gè)不同亞科的8 個(gè)物種中成功獲得了以葉片為外植體的胚性愈傷組織及再生植株，不僅顯著提高了玉米和高粱的轉(zhuǎn)化效率，而且獲得了它們的基因編輯植株。

3.2 細(xì)胞分裂素相關(guān)的再生促進(jìn)基因

KNOX（Knotted1-like homebox）同源域轉(zhuǎn)錄因子STM（SHOOTMERISTEMLESS）可激活CK 生物合成的重要限速酶異戊烯基轉(zhuǎn)移酶7（isopentenyl-transferase 7，IPT7）進(jìn)而促進(jìn)CK 水平增加［85-86］。過表達(dá)玉米STM的同源基因Knotted1（ZmKn1）使甜橙轉(zhuǎn)化效率顯著增加3～15 倍［75］。過表達(dá)ZmKn1不僅使煙草轉(zhuǎn)化效率增加3倍，而且轉(zhuǎn)基因植株在沒有抗生素和激素的培養(yǎng)基上通過器官發(fā)生途徑再生，但轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)多葉叢生的異常表型［76］。過表達(dá)CUC1和CUC2可通過激活STM 表達(dá)而促進(jìn)SAM 的形成，并使擬南芥轉(zhuǎn)化效率提高10 倍，但產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物表型異常［31］。雌二醇誘導(dǎo)ESR2過表達(dá)可通過直接調(diào)節(jié)CUC1轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化［34］。轉(zhuǎn)錄因子MP（MONOPTEROS）是生長(zhǎng)素響應(yīng)基因和CK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物合成的調(diào)節(jié)基因［87］。當(dāng)MP的調(diào)控結(jié)構(gòu)域被移除時(shí)，可產(chǎn)生活躍表達(dá)且功能正常的MPΔ。過表達(dá)AtMPΔ通過上調(diào)AtWUS、AtSTM、AtESR1、AtCUC1和AtCUC2［77，87］并抑制A 型ARR5和ARR7的表達(dá)［88］提高具備異常表型的擬南芥轉(zhuǎn)化效率。與上述過表達(dá)STM、CUC1/2、ESR2和MP等導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物具備異常表型相比，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子基因GRF（GROWTH-REGULATING FACTOR）和它的輔助因子GRF-INTERACTING FACTOR（GIF）的持續(xù)共表達(dá)不會(huì)引起轉(zhuǎn)基因植物的表型異常［78-79］。受miR396 調(diào)控的GRF-FIF 二聚體通過招募SWITCH/SUCROSE NONFERMENTING（SWI/SNF）染色質(zhì)重塑復(fù)合物調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，促進(jìn)植物以器官發(fā)生途徑再生［89-91］?！芤? 號(hào)’楊（Populus pseudo-simonii × Populus nigra‘Zheyin 3#’）的PpnGRF5-1 與PpnGIFs 形成的復(fù)合物，可通過抑制編碼細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶1（cytokinin oxidase/dehydrogenase 1）基因PpnCKX1促進(jìn)CK 積累和分生組織誘導(dǎo)［92］。Kong 等［78］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)擬南芥AtGRF5或其同源基因不僅可以提高執(zhí)拗型甜菜、歐洲油菜、大豆和向日葵的器官再生效率，也促進(jìn)了玉米通過體胚再生的效率，獲得的轉(zhuǎn)基因植物均具有正常表型。Debernardi等［79］證明過表達(dá)GRF4-GIF1嵌合基因顯著提高了小麥、水稻和檸檬等植物的轉(zhuǎn)化效率，實(shí)現(xiàn)了頑拗型商用小麥品種的轉(zhuǎn)化，并在不需要外源CK 的培養(yǎng)基上產(chǎn)生具有正常表型的可育小麥轉(zhuǎn)基因植株。該研究中，過表達(dá)GRF4-GIF1嵌合體使小麥轉(zhuǎn)化效率平均增加了7.8 倍，轉(zhuǎn)基因小麥可在無抗生素選擇標(biāo)記基因的培養(yǎng)基（含生長(zhǎng)素）上進(jìn)行選擇，轉(zhuǎn)化周期從91 d 縮短到56 d。郭蘇平等［93］將森林草莓（Fragaria vesca）基因組中鑒定出的FveGRF5和FveGRF10基因分別與FveGIF1構(gòu)成GRF-GIF嵌合基因的過表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)2 對(duì)GRF-GIF嵌合基因均可提高森林草莓愈傷組織的芽再生率，其中，GRF5-GIF1的促進(jìn)效果更明顯，其芽再生率和遺傳轉(zhuǎn)化效率為對(duì)照的2.25 倍。

來自農(nóng)桿菌Ti-質(zhì)粒上的IPT催化CK 生物合成途徑中的第一個(gè)中間產(chǎn)物異戊烯腺苷單磷酸鹽（isopentenyladenosine-5’-monophosphate，isopentenyl-AMP）的形成［94-95］。過表達(dá)農(nóng)桿菌IPT可使CK 水平增加23～300 倍，但獲得的轉(zhuǎn)基因植物具有明顯的異常表型［80-81］。Ebinuma 等［82］開發(fā)了一種無須選擇標(biāo)記的煙草和雜交山楊轉(zhuǎn)化體系，獲得的半合子轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞可將含有35S：IPT表達(dá)盒的Ac 元件自動(dòng)切除，最終產(chǎn)生0.5%～1.0%表型正常的轉(zhuǎn)基因植株。通過使用地塞米松誘導(dǎo)IPT的表達(dá)也獲得了不需要抗生素標(biāo)記的表型正常轉(zhuǎn)基因煙草和萵苣，并使轉(zhuǎn)化效率分別提高24.3 和6.6 倍［83］。ZmWUS2（Nos：ZmWUS2）的低表達(dá)結(jié)合農(nóng)桿菌IPT（ZmUbi：IPT）或ZmUbi：AtSTM的高表達(dá)促進(jìn)了擬南芥、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）、番茄、馬鈴薯和葡萄等轉(zhuǎn)基因植株的器官發(fā)生。當(dāng)與Cas9/gRNA 質(zhì)粒一起使用時(shí)，這個(gè)方法產(chǎn)生了直接再生莖而無須組織培養(yǎng)的基因編輯幼苗，該方法為縮短植物育種周期提供了巨大潛力［84］。

4 總結(jié)與展望

基因組學(xué)、轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)的發(fā)展為植物基礎(chǔ)研究和作物品種改良提供了強(qiáng)大的平臺(tái)。相對(duì)于基因組學(xué)和基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)中再生體系的建立成為目前功能基因組學(xué)研究的瓶頸。近年來，隨著對(duì)植物體外再生機(jī)制研究的不斷深入，生長(zhǎng)素和CK 誘導(dǎo)愈傷組織形成、增殖和再生的分子調(diào)控機(jī)理逐漸被探明。利用生長(zhǎng)素和CK 生物合成、響應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的再生促進(jìn)基因，尤其是具有形態(tài)發(fā)生功能的發(fā)育調(diào)節(jié)基因，例如WUS和BBM，在促進(jìn)單子葉植物頑拗基因型的遺傳轉(zhuǎn)化效率和再生能力方面取得了突破性進(jìn)展。利用發(fā)育調(diào)節(jié)基因克服轉(zhuǎn)基因障礙的方法也叫形態(tài)發(fā)生基因輔助轉(zhuǎn)化方法（morphogene-assisted transformation，MAT）［73］。MAT 大大縮短了轉(zhuǎn)化時(shí)間，擴(kuò)大了可用于轉(zhuǎn)基因操作的基因型和外植體類型，產(chǎn)生了非常高的轉(zhuǎn)化率。但是，這些再生促進(jìn)基因的應(yīng)用往往會(huì)引起轉(zhuǎn)基因植物表型異常。為克服這個(gè)負(fù)面影響，研究人員通過改變啟動(dòng)子類型調(diào)節(jié)再生促進(jìn)基因的表達(dá)水平，或者利用時(shí)空誘導(dǎo)性基因表達(dá)策略獲得不表達(dá)再生促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)基因后代，還開發(fā)出將形態(tài)發(fā)生基因和靶基因置于不同農(nóng)桿菌菌株再共同侵染的“利他轉(zhuǎn)化”方法。這些方法的應(yīng)用不僅獲得了正常的轉(zhuǎn)基因植株，而且產(chǎn)生了不需要激素、選擇標(biāo)記甚至組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化。最近的研究發(fā)現(xiàn)，GRF-GIF的持續(xù)表達(dá)能獲得再生效率高且表型正常的單子葉和雙子葉轉(zhuǎn)基因植株。需要注意的是，由于GRF-GIF 家族中有多個(gè)成員，并不是所有的GRFs 或GRF-GIF 配對(duì)在植物轉(zhuǎn)化中都同樣有效，因此，需要在目標(biāo)植物上開展鑒定具有高轉(zhuǎn)化效率的GRFs 或GRF-GIF 配對(duì)的研究。除本研究中介紹的再生促進(jìn)基因外，其他能促 進(jìn)SAM 形成，芽再生或體胚發(fā)生的基因，如PLTs（PLETHORAs），WINDs（WOUND-INDUCED DEDIFFERENTIATIONs），ARRs（ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORs）等在植物遺傳轉(zhuǎn)化和再生中的作用有待進(jìn)一步研究。

組織培養(yǎng)既是轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)的重要工具也是限制這些技術(shù)在植物上高效且廣泛應(yīng)用的主要原因。為了避免組培造成的不利影響，研究人員開發(fā)了一種在體細(xì)胞中傳遞和測(cè)試基因編輯試劑的方法，稱為Fast TrACC 方法（fast-treatedAgrobacteriumco-culture，快速處理農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)）。Fast TrACC 方法的原理是組合利用發(fā)育調(diào)節(jié)基因?qū)⒁逊只捏w細(xì)胞快速重新編程為多能干細(xì)胞，直接產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或基因編輯的芽，獲得的基因編輯產(chǎn)物可穩(wěn)定傳遞給下一代［84］。在本氏煙草、番茄、馬鈴薯、辣椒、茄子（Solanum melogena）和歐洲油菜等多個(gè)茄科植物上已被用于快速測(cè)試啟動(dòng)子活性和基因編輯試劑的有效性［96］。我國(guó)朱健康院士團(tuán)隊(duì)開發(fā)的CBD 遞送轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（cut-dip-budding，切-浸-萌芽）可實(shí)現(xiàn)多個(gè)植物無須組織培養(yǎng)的快速有效的遺傳轉(zhuǎn)化，其原理是利用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogene）侵染植物根莖交界處的切口，上部分莖產(chǎn)生轉(zhuǎn)化根，再由轉(zhuǎn)化根產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植株，該技術(shù)可應(yīng)用于多個(gè)具有根蘗能力的植物，包括之前很難或不可能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的草本植物橡膠草（Taraxacum koksaghyz）和繡球小冠花（Coronilla varia）、塊莖植物番薯（Ipomoea batatas）、木本植物臭椿（Ailanthus altissima）、楤木（Aralia elata）和重瓣臭茉莉（Clerodendrum chinense）等［2］。與Fast TrACC 方法相比，CBD 遞送系統(tǒng)同樣無須組織培養(yǎng)，也不需要無菌條件，僅通過對(duì)外植體的簡(jiǎn)單浸泡就能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化或基因編輯。Fast TrACC 方法中再生效率最高的發(fā)育基因組合是ZmWUS2與AtSTM或IPT，這些組合在茄科以外的植物尤其是單子葉植物上仍需開展試驗(yàn)以驗(yàn)證該方法的有效性。CBD 遞送轉(zhuǎn)化系統(tǒng)技術(shù)背后有關(guān)植物根蘗發(fā)生能力的分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究，比如對(duì)根蘗發(fā)生調(diào)節(jié)基因的功能鑒定，以便使該系統(tǒng)在更多的植物品種和基因型上實(shí)現(xiàn)快速穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。