PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗生理和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2024-02-25 12:18:30吳令上朱玉球高燕會(huì)
浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào) 2024年1期
馮 蕊，周 琪，吳令上，朱玉球，高燕會(huì)
（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）
干旱作為植物重要的非生物脅迫之一，是全球面臨的重大環(huán)境問題，嚴(yán)重影響植物的生長、發(fā)育和生存[1]。植物會(huì)通過形態(tài)、生理生化、光合作用及分子水平等層次的響應(yīng)抵御干旱脅迫[2-9]。植物受干旱脅迫傷害時(shí)，脂膜過氧化導(dǎo)致丙二醛(MDA)積累，使蛋白質(zhì)和核酸變性，導(dǎo)致膜流動(dòng)性降低，膜透性增強(qiáng)，因此MDA 的多少可衡量植物細(xì)胞受傷害的程度[10]；活性氧保護(hù)酶過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)協(xié)同作用可有效清除植物體內(nèi)過多的自由基，從而維持植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡[11-12]；植物還會(huì)積累可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以提高細(xì)胞保水能力，從而維持細(xì)胞的正常生理過程來響應(yīng)干旱脅迫[13-15]；干旱脅迫還能破壞植物水分代謝，導(dǎo)致葉綠素分解，影響光能電子傳遞和轉(zhuǎn)換、光合磷酸化及暗反應(yīng)等過程，使植物光合速率下降，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致葉綠體光合機(jī)構(gòu)的破壞，對植物體造成不可逆影響。葉綠素?zé)晒鈪?shù)對干旱脅迫的響應(yīng)非常靈敏，可作為監(jiān)測光合作用過程中光能的吸收、傳遞、耗散和分配的指標(biāo)，判斷植物干旱脅迫的程度；董斌等[16]利用葉綠素?zé)晒鈾z測油茶Camelliaoleifera的干旱抗性，選育出抗干旱的油茶品種。
植物根系利用細(xì)胞水勢低于土壤水勢的原理進(jìn)行吸水，聚乙二醇6000(PEG 6000)可降低溶液水勢，根系不易從周圍吸收水分，從而造成干旱脅迫[17]。已有學(xué)者[18-19]利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬不同程度的干旱脅迫對小麥Triticumaestvum和玉米Zeamays的影響。鐵皮石斛Dendrobiumcandidum是蘭科Orchidaceae 多年生草本植物，兼具很高的藥用和觀賞價(jià)值，分布于中國安徽、浙江、福建等地[20-21]。目前，已將鐵皮石斛野生資源成功進(jìn)行馴化和人工移栽，實(shí)現(xiàn)了鐵皮石斛的大面積規(guī)?；a(chǎn)業(yè)種植和近野生栽培，不僅提高了鐵皮石斛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還推動(dòng)中國中藥材產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[22]。在鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化種植和近野生栽培過程中，水分是一個(gè)重要的限制性生態(tài)因子，因缺水引起的干旱嚴(yán)重影響鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此了解干旱脅迫下鐵皮石斛生理生化和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化特征，對研究鐵皮石斛耐干旱機(jī)制及鐵皮石斛的近野生栽培意義重大。近年來，已有關(guān)于干旱對鐵皮石斛的生長和生理特性變化的報(bào)道。阮凌暄等[23]研究發(fā)現(xiàn)：隨著PEG 6000 模擬干旱脅迫時(shí)間的延長和脅迫強(qiáng)度的增加，3 年生盆栽鐵皮石斛葉片活性氧積累呈上升趨勢，保護(hù)酶POD 和SOD 活性先增加后降低，第8 天時(shí)達(dá)到最大值，葉片葉綠素最大熒光(Fm)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和光化學(xué)猝滅系數(shù)(qp)逐漸降低，光反應(yīng)能力降低。呂朝燕等[24]研究指出：3 年生盆栽鐵皮石斛葉片凈光合速率和氣孔導(dǎo)度隨干旱脅迫時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢，而胞間二氧化碳 (CO2)摩爾分?jǐn)?shù)和蒸騰速率則相反，呈先降低再升高的趨勢，認(rèn)為鐵皮石斛為干旱避免型植物。為進(jìn)一步探討鐵皮石斛抵抗干旱脅迫的生理特性，本研究擬通過不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫，對鐵皮石斛幼苗MDA、可溶性糖和可溶性蛋白、POD、CAT 等生理生化指標(biāo)和葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等進(jìn)行分析，探討鐵皮石斛幼苗抗旱的生理和葉綠素?zé)晒馓匦裕云跒殍F皮石斛的品種選育及產(chǎn)業(yè)化栽培和近野生栽培技術(shù)的建立提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)材料鐵皮石斛‘晶品1 號(hào)’D.candidum‘Jingpin No.1’幼苗于光照1 500～3 000 lx 和(25±2) ℃的植物組織培養(yǎng)室培養(yǎng)60 d，每天光照和黑暗時(shí)間分別為14 h 和10 h。
1.2 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理
在MS 液體培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000(5%、10%、20%、30%)模擬干旱脅迫，以不含PEG 6000 的MS 液體培養(yǎng)基為對照(ck)[25]。選擇長勢良好，生長較一致的‘晶品1 號(hào)’幼苗，接種于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，光照1 500～3 000 lx，每天光照和黑暗時(shí)間分別為 14 h 和10 h，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，每個(gè)處理60 株，處理后每隔2 d 定時(shí)取5 株植株葉片和莖段觀察細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)(分別記為D2、D4、D6、D8、D10和D12)；取5 株混合樣測定鐵皮石斛幼苗的MDA、POD、CAT、可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素等各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，選擇5 株植株測定葉片的葉綠素各熒光參數(shù)。每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
1.3 測定方法
1.3.1 葉片和莖段組織細(xì)胞學(xué)觀察 采用瓊脂糖包埋法對鐵皮石斛‘晶品1 號(hào)’莖段和葉片進(jìn)行固定。具體做法為：試驗(yàn)當(dāng)天將新鮮莖段和葉片樣品置于磷酸鹽(PBS)緩沖溶液(pH 7.4)中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%瓊脂糖凝膠，待凝膠溫度為50～60 ℃時(shí)，將新鮮莖段和葉片置于凝膠中，于室溫冷卻至凝膠凝固，完成樣品的固定；將固定好的莖段和葉片置于震蕩切片機(jī)上進(jìn)行橫切，切片厚度為50～100 μm，切好的莖段和葉片橫切片置于載玻片上，滴加1 滴PBS 緩沖液(pH 7.4)，蓋上蓋玻片，于萊卡熒光顯微鏡(Leica DM-4000)下觀察莖段和葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，并拍照記錄[26]。
1.3.2 生理指標(biāo)的測定 采用硫代巴比妥酸法(TBA 法)測定丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度[27-28]；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD 酶活性；紫外分光光度法的CAT 活性測定[11]；蒽酮法測定莖段的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[29]；考馬斯亮藍(lán)比色法測定可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)[30]。
1.3.3 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 用紫外分光度法測定葉片的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)[31]。分別取不同處理‘晶品1 號(hào)’幼苗葉片，去葉脈葉緣，剪碎葉片，將0.1 g 新鮮葉片放入10 mL 離心管，加入8 mL 體積分?jǐn)?shù)為95% 乙醇提取液，避光浸提 24 h 后，測定波長 663、645 和470 nm 處吸光度，并計(jì)算葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
1.3.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 采用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(PAM-2500)，于9:00—11:00，選擇從上往下數(shù)的第3 片葉子，先用暗適應(yīng)夾夾住葉片暗適應(yīng)20 min，然后開始測定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理的鐵皮石斛‘晶品1 號(hào)’幼苗葉片的電子傳遞速率(ETR)、qP、光合效率(α)、非化學(xué)猝滅系數(shù)(qNP)和Fv/Fm等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。每個(gè)處理測定5 株，每株測定3 次，取平均值。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
通過Excel 2018 整理所有原始數(shù)據(jù)，Graphpad 8.0 作圖，SPSS 20 進(jìn)行方差分析，并采用單因素方差分析法和新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析和顯著性比較，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性水平為0.05。
2 結(jié)果與分析
2.1 PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗生理生化指標(biāo)的影響
2.1.1 對鐵皮石斛丙二醛質(zhì)量摩濃度的影響 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理不同時(shí)間對鐵皮石斛幼苗丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響差異顯著(P＜0.05)。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫處理2～8 d 時(shí)的鐵皮石斛幼苗莖段丙二醛比較穩(wěn)定，說明短時(shí)間(≤8 d)的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫處理對鐵皮石斛細(xì)胞膜的影響較小，而到第8 天時(shí)丙二醛急劇上升，到第10 天時(shí)達(dá)最大值，比同期ck 組分別增加2.36 (5% PEG 6000)、2.43 (10% PEG 6000)、2.03 (20% PEG 6000)和2.50 倍 (30% PEG 6000)(圖1)，說明不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗細(xì)胞膜造成不同程度的傷害，PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高(30%)對鐵皮石斛細(xì)胞膜的傷害越大，抵御干旱的能力下降。
圖1 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗丙二醛的變化Figure 1 Change of MDA contents in D.candidum seedlings under PEG 6000 simulated drought stress
2.1.2 對鐵皮石斛防御酶活性的影響 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理不同時(shí)間對鐵皮石斛幼苗CAT 和POD 活性的影響差異顯著(P＜0.05)。由圖2A 可以看出：鐵皮石斛幼苗CAT 活性隨著不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，且在處理10 d 時(shí)CAT 活性達(dá)到最高值，12 d 時(shí)CAT 活性下降(圖2A)；鐵皮石斛幼苗CAT 活性隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先上升后下降的趨勢，PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)CAT 活性明顯高于其他處理，且在處理第10 天時(shí)，CAT 活性是ck 組的3.87 倍；PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)CAT 活性降低，可能由于高質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 可使細(xì)胞脫水，嚴(yán)重影響細(xì)胞正常生活，降低CAT 活性。
圖2 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗CAT 和POD 活性的變化Figure 2 Changes of CAT and POD enzyme activities in D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
由圖2A 和圖2B 可知：PEG 6000 模擬干旱脅迫后，鐵皮石斛幼苗POD 活性的變化趨勢與CAT 活性基本一致。沒有PEG 6000 處理的鐵皮石斛幼苗的POD 活性幾乎保持不變，隨著PEG 6000 處理時(shí)間延長，鐵皮石斛POD 活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在處理第8 天時(shí)達(dá)到最高值(圖2B)，而后開始緩慢下降；PEG 6000 模擬干旱處理后鐵皮石斛幼苗POD 活性均高于ck 組，且隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，POD 活性呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)達(dá)到峰值，為119×16.67 nkat·min-1·g-1(圖2B)。
2.1.3 對鐵皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理不同時(shí)間對鐵皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響差異顯著(P＜0.05)。可溶性糖不僅能夠?yàn)橹参锾峁┨荚次镔|(zhì)，還能維持一定的滲透壓。從圖3A 可看出：鐵皮石斛幼苗的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和處理時(shí)間的延長均呈上升趨勢，到第12 天時(shí)達(dá)最高，且隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，PEG 6000 為30%時(shí)，可溶性糖上升顯著，說明鐵皮石斛植株受到不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫時(shí)，通過增加可溶性糖來維持植物體內(nèi)細(xì)胞的滲透壓。
圖3 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Figure 3 Changes of soluble sugar and soluble protein contents in D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
從圖3B 可知：不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理對鐵皮石斛幼苗的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響(P＜0.05)，且隨著PEG 6000 處理時(shí)間的延長，鐵皮石斛幼苗的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢，且在處理相同時(shí)間，PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，鐵皮石斛幼苗的可溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越少。當(dāng)PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 30%時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第8～10 天時(shí)下降。此時(shí)蛋白質(zhì)分解加速，合成減少，說明鐵皮石斛幼苗可在一定程度上消耗可溶性蛋白來調(diào)節(jié)適應(yīng) PEG 6000 的脅迫處理，但需要一定的脅迫強(qiáng)度和時(shí)間。
2.2 PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響
由圖4A 可知：PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗莖段和葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響(P＜0.05)。隨著PEG 6000 模擬干旱脅迫時(shí)間的延長，鐵皮石斛幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，在PEG 6000 模擬干旱處理2～8 d 時(shí)，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，到第10 天時(shí)，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇下降，較同一時(shí)間的ck 分別下降了32.01% (5%PEG 6000)、35.03% (10%PEG 6000)、44.07% (20%PEG 6000)和57.06% (30%PEG 6000)，且隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，葉綠素下降幅度明顯增加。方差分析結(jié)果表明：不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理對鐵皮石斛幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的有顯著的影響(P＜0.05)。對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理12 d 時(shí)鐵皮石斛幼苗莖段和葉片瓊脂糖包埋震蕩切片觀察發(fā)現(xiàn)：鐵皮石斛莖段和葉片細(xì)胞內(nèi)葉綠素隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減少(圖4B)，與測得葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果一致。
圖4 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理后鐵皮石斛幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)及在莖和葉上的分布(B)Figure 4 Chlorophyll contents (A) and its distribution on stems and leaves (B) of D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress treatment
2.3 對鐵皮石斛幼苗光合效率和電子傳遞速率的影響
由圖5A 和5B 可知：PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗處理不同時(shí)間對α和ETR 的影響差異顯著(P＜0.05)。隨著PEG 6000 脅迫處理時(shí)間的延長和PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，α和ETR 均呈下降趨勢，在4～8 d 時(shí)下降的幅度最大。與ck 組相比，隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，α下降幅度增大(圖5A)。在PEG 6000 為30%處理時(shí)ETR 下降幅度最大，PEG 6000 為20%和30%處理12 d 時(shí)ETR 達(dá)到最低(圖5B)，說明PEG 6000 脅迫處理會(huì)使鐵皮石斛幼苗的光合作用減弱，且隨著脅迫程度增加，光合作用減弱的幅度越大。這與PEG 6000 脅迫處理下鐵皮石斛葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低的結(jié)果一致。
圖5 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗光合效率和電子傳遞速率的變化Figure 5 Changes of photosynthetic efficiency and electron transfer rate of D.candidumseedlings after PEG 6000 simulated drought stress
2.4 PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
2.4.1 對鐵皮石斛幼苗光能轉(zhuǎn)換效率的影響 由圖6A 可知：Fv/Fm隨著不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理時(shí)間的延長呈逐漸下降的趨勢，在PEG 6000 處理第2 天時(shí)，F(xiàn)v/Fm為0.723～0.743。未添加PEG 6000 處理在第2～8 天時(shí)，鐵皮石斛幼苗Fv/Fm為0.703～0.743，說明光能轉(zhuǎn)換正常，但到第10～12 天時(shí)，F(xiàn)v/Fm顯著下降(P＜0.05)，光轉(zhuǎn)換效率降低，可能由于長時(shí)間液體培養(yǎng)會(huì)對鐵皮石斛幼苗生長產(chǎn)生不利影響。隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P＜0.05)，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 (5%)處理后第2～8 天，F(xiàn)v/Fm為0.698～0.713，說明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 對鐵皮石斛幼苗PSⅡ的損傷較小，而第8～12 天逐漸下降；10%～30%PEG 6000 處理后第4 天，F(xiàn)v/Fm開始顯著下降，說明鐵皮石斛幼苗受到模擬干旱脅迫后，植株的最大光能轉(zhuǎn)換效率降低，PSⅡ受到脅迫損傷，嚴(yán)重影響鐵皮石斛幼苗的光合作用。
圖6 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化Figure 6 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
2.4.2 對熒光猝滅系數(shù)的影響 熒光猝滅主要有光化學(xué)猝滅和非光化學(xué)猝滅，光化學(xué)猝滅是由碳代謝酶光活化和氣孔開放引起的PSⅡ電子傳遞速率增加，光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)一定程度上反映PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度；非光化學(xué)猝滅是由能量轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的熱耗散效率增加，qNP為非光化學(xué)猝滅系數(shù)。非光化學(xué)猝滅是一種保護(hù)途徑，通過熱耗散消耗過剩的光能，使光合機(jī)構(gòu)免受傷害[32-33]。PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗處理不同時(shí)間對qNP和qP的影響差異顯著(P＜0.05)。由圖6B 可知：不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理均使qP在第2～12 天逐漸降低，且隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降，說明PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度隨之降低，參加光化學(xué)反應(yīng)的激發(fā)能量明顯降低，過剩的光能就會(huì)增加。由圖6C 可看出：當(dāng)PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～10%時(shí)，鐵皮石斛幼苗qNP隨著處理時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，PEG 6000 為0 和5%時(shí)，在處理的第10 天qNP達(dá)最高值(0.584 和0.593)，PEG 6000 為10%時(shí)于第8 天qNP達(dá)最高值(0.509)；PEG 6000 為20%和30%時(shí)，鐵皮石斛幼苗qNP隨著處理時(shí)間的延長持續(xù)下降，說明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 脅迫下，非光化學(xué)猝滅途徑發(fā)揮了保護(hù)作用，qNP增大；但隨著處理時(shí)間的延長或在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 脅迫下，qNP自我保護(hù)機(jī)制達(dá)到一定限度，導(dǎo)致光合反應(yīng)受到傷害，無法逆轉(zhuǎn)，使qNP呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。
3 討論
3.1 鐵皮石斛對干旱脅迫的生理生化響應(yīng)
干旱是全球性環(huán)境問題之一。植物不能逃避惡劣的自然環(huán)境條件，只能加速適應(yīng)各種逆境。大多數(shù)植物可改變自身的生理生化指標(biāo)來響應(yīng)干旱逆境脅迫，以維持植物正常生長。
MDA 是細(xì)胞膜受到逆境脅迫傷害引起的膜脂過氧化產(chǎn)物，MDA 質(zhì)量摩爾濃度是判斷植物細(xì)胞膜受到傷害程度的重要指標(biāo)，MDA 質(zhì)量摩爾濃度越高說明細(xì)胞膜受傷程度越大[28,34-35]。本研究中，鐵皮石斛幼苗MDA 質(zhì)量摩爾濃度隨PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間不同存在差異，短時(shí)間(≤8 d) PEG 6000 模擬干旱脅迫處理后鐵皮石斛幼苗MDA 變化不大，對細(xì)胞膜影響較小，而長時(shí)間(≥10 d)處理后MDA 急劇上升，且PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，MDA 質(zhì)量摩爾濃度越高，因此，PEG 6000 模擬干旱程度增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受到極大的傷害，膜脂過氧化程度也越大。這與構(gòu)樹Broussonetiapapyrifera[36]、北美紅櫟Quercusrubra[37]和大豆Glycinemax[38]幼苗在干旱脅迫時(shí)MDA 的變化一致。
小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖能通過滲透調(diào)節(jié)平衡細(xì)胞滲透勢，提高細(xì)胞保水能力而維持細(xì)胞的正常生理過程。同時(shí)，干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜受損，透性增大，引起膜脂過氧化反應(yīng)，會(huì)對蛋白質(zhì)造成傷害，因此細(xì)胞內(nèi)可溶性糖和蛋白變化能夠穩(wěn)定滲透調(diào)節(jié)能力，是反映植物抗旱性的有效指標(biāo)之一[14,39]。本研究中，鐵皮石斛幼苗可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脅迫處理時(shí)間的延長呈上升趨勢，說明鐵皮石斛幼苗細(xì)胞通過積累可溶性糖來提高細(xì)胞液濃度，降低細(xì)胞膜的滲透勢，維持體內(nèi)細(xì)胞的滲透壓保持自身正常的生理過程。這與玉米的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨干旱脅迫的加劇逐漸升高的變化趨勢一致[40]。在處理時(shí)間相同時(shí)，PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，鐵皮石斛幼苗可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，說明干旱環(huán)境對鐵皮石斛細(xì)胞造成極大的傷害。
植物體內(nèi)較低的活性氧不會(huì)對植物細(xì)胞產(chǎn)生傷害[41]，而當(dāng)植物受干旱脅迫時(shí)活性氧的代謝平衡被嚴(yán)重破壞，活性氧增多，攻擊植物蛋白質(zhì)上各種氨基酸殘基，使蛋白質(zhì)和葉綠素等分子解體，從而對植物細(xì)胞產(chǎn)生各種毒害作用。POD、CAT 等保護(hù)酶能有效抑制和清除植物體內(nèi)的各種活性氧和自由基[42]。本研究表明：PEG 6000 模擬干旱處理鐵皮石斛幼苗后，POD 和CAT 活性都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，POD 和CAT 酶活性的大幅提高大大增強(qiáng)對活性氧的抵抗能力和對植物光合機(jī)構(gòu)的保護(hù)能力。該結(jié)果與三葉草Trifoliumrepens受到干旱脅迫時(shí)POD 和CAT 的活性變化一致[25]。因此，植物受干旱脅迫時(shí)通過提高相關(guān)保護(hù)酶活性來保持體內(nèi)活性氧平衡。
3.2 PEG 6000 模擬干旱脅迫對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
葉綠素是光合作用最重要的色素，光合作用時(shí)葉綠素吸收能量，為CO2轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔锾峁┠芰?；水分是葉綠素的合成原料，干旱脅迫能使葉綠素合成減緩及葉綠素解體，直接導(dǎo)致葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。本研究中PEG 6000 模擬干旱處理鐵皮石斛幼苗后，莖段和葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，與PEG 模擬干旱脅迫不同抗逆性棉花Gossypiumhirsutum的葉綠素變化趨勢一致[43]。
葉綠素?zé)晒夂椭参锕夂献饔藐P(guān)系密切，當(dāng)強(qiáng)光持續(xù)照射植物時(shí)，為了有效避免植物葉綠體內(nèi)吸收的光能超過光合作用中發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的能量消耗及過量的光能灼傷植物光合作用機(jī)構(gòu)，植物以熒光的方式耗盡消散掉部分光能以起重要保護(hù)作用；自然條件下葉綠素?zé)晒夂椭参锕夂纤俾食守?fù)相關(guān)，葉綠素?zé)晒庾內(nèi)鯐r(shí)光合速率就高，反之亦然。植物遭受脅迫的程度與光合作用的葉綠素?zé)晒馓匦杂兄芮械年P(guān)系[44]。本研究中，PEG 6000 模擬干旱處理鐵皮石斛幼苗，F(xiàn)v/Fm、qP、ETR 均呈下降趨勢，表明PEG 6000 干旱脅迫對植物光合作用產(chǎn)生了傷害；PEG 6000 干旱脅迫使鐵皮石斛幼苗qNP呈上升趨勢，說明鐵皮石斛幼苗通過啟動(dòng)非光化學(xué)猝滅途徑來大量消耗PSⅡ反應(yīng)中心吸收的過剩光能。隨著PEG 6000 脅迫的不斷加重，qNP也開始呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，可能是由于熱耗散機(jī)制受阻，無法使耗散掉吸收的過剩光能，導(dǎo)致光系統(tǒng)受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷，影響光合作用。因此，植物受到干旱脅迫時(shí)光合作用能力降低從而影響植物的正常生長。
4 結(jié)論
通過研究對鐵皮石斛幼苗進(jìn)行PEG 6000 模擬干旱脅迫處理后的生理和葉綠素?zé)晒馓匦?，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛幼苗具有一定的抗旱能力，在適當(dāng)干旱條件下可通過自身調(diào)節(jié)來達(dá)到正常生長的目的，但也有一定限度。在較低PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(≤5%)脅迫時(shí)，可以通過調(diào)節(jié)代謝實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)，在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 (≥20%)時(shí)，干旱脅迫會(huì)損傷植物，影響生理過程和光合作用。20% PEG 6000 脅迫10 d 可作為鐵皮石斛抗干旱品種篩選的標(biāo)準(zhǔn)；鐵皮石斛幼苗可通過增加可溶性糖，減少可溶性蛋白，提高POD 和CAT 等防御酶活性抵抗和適應(yīng)一定程度的干旱脅迫(≥20%PEG 6000 處理≥10 d)；鐵皮石斛幼苗的最大光能轉(zhuǎn)換效率降低，PSⅡ受到脅迫損傷，同時(shí)，鐵皮石斛幼苗通過啟動(dòng)qNP途徑來消耗PSⅡ反應(yīng)中心吸收的過剩光能，維持正常的光合作用。因此，可溶性糖和可溶性蛋白、防御酶POD 和CAT 以及葉綠體熒光參數(shù)均可作為鐵皮石斛的耐干旱指標(biāo)。
猜你喜歡
飛鼠與石斛基層中醫(yī)藥(2021年3期)2021-11-22 08:08:08 鐵皮俠的裝備數(shù)學(xué)大王·中高年級(jí)(2020年12期)2020-12-31 07:28:26 提取葉綠素閱讀（科學(xué)探秘）(2020年8期)2020-11-06 06:22:48 鐵皮園趣味(語文)(2020年4期)2020-07-27 01:43:14 35 種石斛蘭觀賞價(jià)值評價(jià)亞熱帶植物科學(xué)(2019年3期)2019-10-16 05:21:24 桃樹葉綠素含量與SPAD值呈極顯著正相關(guān)中國果業(yè)信息(2019年1期)2019-01-05 17:41:42 金釵石斛化學(xué)成分的研究中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:56 鐵皮石斛家庭種植技術(shù)探索現(xiàn)代園藝(2018年2期)2018-03-15 08:00:05 葉綠素家族概述生物學(xué)教學(xué)(2017年9期)2017-08-20 13:22:32 正交設(shè)計(jì)在觀賞石斛種胚離體培養(yǎng)中的應(yīng)用廣西林業(yè)科學(xué)(2016年3期)2016-03-16 05:43:37
馮 蕊，周 琪，吳令上，朱玉球，高燕會(huì)
（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）
干旱作為植物重要的非生物脅迫之一，是全球面臨的重大環(huán)境問題，嚴(yán)重影響植物的生長、發(fā)育和生存[1]。植物會(huì)通過形態(tài)、生理生化、光合作用及分子水平等層次的響應(yīng)抵御干旱脅迫[2-9]。植物受干旱脅迫傷害時(shí)，脂膜過氧化導(dǎo)致丙二醛(MDA)積累，使蛋白質(zhì)和核酸變性，導(dǎo)致膜流動(dòng)性降低，膜透性增強(qiáng)，因此MDA 的多少可衡量植物細(xì)胞受傷害的程度[10]；活性氧保護(hù)酶過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)協(xié)同作用可有效清除植物體內(nèi)過多的自由基，從而維持植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡[11-12]；植物還會(huì)積累可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以提高細(xì)胞保水能力，從而維持細(xì)胞的正常生理過程來響應(yīng)干旱脅迫[13-15]；干旱脅迫還能破壞植物水分代謝，導(dǎo)致葉綠素分解，影響光能電子傳遞和轉(zhuǎn)換、光合磷酸化及暗反應(yīng)等過程，使植物光合速率下降，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致葉綠體光合機(jī)構(gòu)的破壞，對植物體造成不可逆影響。葉綠素?zé)晒鈪?shù)對干旱脅迫的響應(yīng)非常靈敏，可作為監(jiān)測光合作用過程中光能的吸收、傳遞、耗散和分配的指標(biāo)，判斷植物干旱脅迫的程度；董斌等[16]利用葉綠素?zé)晒鈾z測油茶Camelliaoleifera的干旱抗性，選育出抗干旱的油茶品種。
植物根系利用細(xì)胞水勢低于土壤水勢的原理進(jìn)行吸水，聚乙二醇6000(PEG 6000)可降低溶液水勢，根系不易從周圍吸收水分，從而造成干旱脅迫[17]。已有學(xué)者[18-19]利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬不同程度的干旱脅迫對小麥Triticumaestvum和玉米Zeamays的影響。鐵皮石斛Dendrobiumcandidum是蘭科Orchidaceae 多年生草本植物，兼具很高的藥用和觀賞價(jià)值，分布于中國安徽、浙江、福建等地[20-21]。目前，已將鐵皮石斛野生資源成功進(jìn)行馴化和人工移栽，實(shí)現(xiàn)了鐵皮石斛的大面積規(guī)?；a(chǎn)業(yè)種植和近野生栽培，不僅提高了鐵皮石斛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還推動(dòng)中國中藥材產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[22]。在鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化種植和近野生栽培過程中，水分是一個(gè)重要的限制性生態(tài)因子，因缺水引起的干旱嚴(yán)重影響鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此了解干旱脅迫下鐵皮石斛生理生化和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化特征，對研究鐵皮石斛耐干旱機(jī)制及鐵皮石斛的近野生栽培意義重大。近年來，已有關(guān)于干旱對鐵皮石斛的生長和生理特性變化的報(bào)道。阮凌暄等[23]研究發(fā)現(xiàn)：隨著PEG 6000 模擬干旱脅迫時(shí)間的延長和脅迫強(qiáng)度的增加，3 年生盆栽鐵皮石斛葉片活性氧積累呈上升趨勢，保護(hù)酶POD 和SOD 活性先增加后降低，第8 天時(shí)達(dá)到最大值，葉片葉綠素最大熒光(Fm)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和光化學(xué)猝滅系數(shù)(qp)逐漸降低，光反應(yīng)能力降低。呂朝燕等[24]研究指出：3 年生盆栽鐵皮石斛葉片凈光合速率和氣孔導(dǎo)度隨干旱脅迫時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢，而胞間二氧化碳 (CO2)摩爾分?jǐn)?shù)和蒸騰速率則相反，呈先降低再升高的趨勢，認(rèn)為鐵皮石斛為干旱避免型植物。為進(jìn)一步探討鐵皮石斛抵抗干旱脅迫的生理特性，本研究擬通過不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫，對鐵皮石斛幼苗MDA、可溶性糖和可溶性蛋白、POD、CAT 等生理生化指標(biāo)和葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等進(jìn)行分析，探討鐵皮石斛幼苗抗旱的生理和葉綠素?zé)晒馓匦裕云跒殍F皮石斛的品種選育及產(chǎn)業(yè)化栽培和近野生栽培技術(shù)的建立提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)材料鐵皮石斛‘晶品1 號(hào)’D.candidum‘Jingpin No.1’幼苗于光照1 500～3 000 lx 和(25±2) ℃的植物組織培養(yǎng)室培養(yǎng)60 d，每天光照和黑暗時(shí)間分別為14 h 和10 h。
1.2 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理
在MS 液體培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000(5%、10%、20%、30%)模擬干旱脅迫，以不含PEG 6000 的MS 液體培養(yǎng)基為對照(ck)[25]。選擇長勢良好，生長較一致的‘晶品1 號(hào)’幼苗，接種于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，光照1 500～3 000 lx，每天光照和黑暗時(shí)間分別為 14 h 和10 h，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，每個(gè)處理60 株，處理后每隔2 d 定時(shí)取5 株植株葉片和莖段觀察細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)(分別記為D2、D4、D6、D8、D10和D12)；取5 株混合樣測定鐵皮石斛幼苗的MDA、POD、CAT、可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素等各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，選擇5 株植株測定葉片的葉綠素各熒光參數(shù)。每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
1.3 測定方法
1.3.1 葉片和莖段組織細(xì)胞學(xué)觀察 采用瓊脂糖包埋法對鐵皮石斛‘晶品1 號(hào)’莖段和葉片進(jìn)行固定。具體做法為：試驗(yàn)當(dāng)天將新鮮莖段和葉片樣品置于磷酸鹽(PBS)緩沖溶液(pH 7.4)中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%瓊脂糖凝膠，待凝膠溫度為50～60 ℃時(shí)，將新鮮莖段和葉片置于凝膠中，于室溫冷卻至凝膠凝固，完成樣品的固定；將固定好的莖段和葉片置于震蕩切片機(jī)上進(jìn)行橫切，切片厚度為50～100 μm，切好的莖段和葉片橫切片置于載玻片上，滴加1 滴PBS 緩沖液(pH 7.4)，蓋上蓋玻片，于萊卡熒光顯微鏡(Leica DM-4000)下觀察莖段和葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，并拍照記錄[26]。
1.3.2 生理指標(biāo)的測定 采用硫代巴比妥酸法(TBA 法)測定丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度[27-28]；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD 酶活性；紫外分光光度法的CAT 活性測定[11]；蒽酮法測定莖段的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[29]；考馬斯亮藍(lán)比色法測定可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)[30]。
1.3.3 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 用紫外分光度法測定葉片的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)[31]。分別取不同處理‘晶品1 號(hào)’幼苗葉片，去葉脈葉緣，剪碎葉片，將0.1 g 新鮮葉片放入10 mL 離心管，加入8 mL 體積分?jǐn)?shù)為95% 乙醇提取液，避光浸提 24 h 后，測定波長 663、645 和470 nm 處吸光度，并計(jì)算葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
1.3.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 采用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(PAM-2500)，于9:00—11:00，選擇從上往下數(shù)的第3 片葉子，先用暗適應(yīng)夾夾住葉片暗適應(yīng)20 min，然后開始測定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理的鐵皮石斛‘晶品1 號(hào)’幼苗葉片的電子傳遞速率(ETR)、qP、光合效率(α)、非化學(xué)猝滅系數(shù)(qNP)和Fv/Fm等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。每個(gè)處理測定5 株，每株測定3 次，取平均值。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
通過Excel 2018 整理所有原始數(shù)據(jù)，Graphpad 8.0 作圖，SPSS 20 進(jìn)行方差分析，并采用單因素方差分析法和新復(fù)極差法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析和顯著性比較，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性水平為0.05。
2 結(jié)果與分析
2.1 PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗生理生化指標(biāo)的影響
2.1.1 對鐵皮石斛丙二醛質(zhì)量摩濃度的影響 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理不同時(shí)間對鐵皮石斛幼苗丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響差異顯著(P＜0.05)。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫處理2～8 d 時(shí)的鐵皮石斛幼苗莖段丙二醛比較穩(wěn)定，說明短時(shí)間(≤8 d)的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫處理對鐵皮石斛細(xì)胞膜的影響較小，而到第8 天時(shí)丙二醛急劇上升，到第10 天時(shí)達(dá)最大值，比同期ck 組分別增加2.36 (5% PEG 6000)、2.43 (10% PEG 6000)、2.03 (20% PEG 6000)和2.50 倍 (30% PEG 6000)(圖1)，說明不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗細(xì)胞膜造成不同程度的傷害，PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高(30%)對鐵皮石斛細(xì)胞膜的傷害越大，抵御干旱的能力下降。
圖1 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗丙二醛的變化Figure 1 Change of MDA contents in D.candidum seedlings under PEG 6000 simulated drought stress
2.1.2 對鐵皮石斛防御酶活性的影響 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理不同時(shí)間對鐵皮石斛幼苗CAT 和POD 活性的影響差異顯著(P＜0.05)。由圖2A 可以看出：鐵皮石斛幼苗CAT 活性隨著不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，且在處理10 d 時(shí)CAT 活性達(dá)到最高值，12 d 時(shí)CAT 活性下降(圖2A)；鐵皮石斛幼苗CAT 活性隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先上升后下降的趨勢，PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)CAT 活性明顯高于其他處理，且在處理第10 天時(shí)，CAT 活性是ck 組的3.87 倍；PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)CAT 活性降低，可能由于高質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 可使細(xì)胞脫水，嚴(yán)重影響細(xì)胞正常生活，降低CAT 活性。
圖2 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗CAT 和POD 活性的變化Figure 2 Changes of CAT and POD enzyme activities in D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
由圖2A 和圖2B 可知：PEG 6000 模擬干旱脅迫后，鐵皮石斛幼苗POD 活性的變化趨勢與CAT 活性基本一致。沒有PEG 6000 處理的鐵皮石斛幼苗的POD 活性幾乎保持不變，隨著PEG 6000 處理時(shí)間延長，鐵皮石斛POD 活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在處理第8 天時(shí)達(dá)到最高值(圖2B)，而后開始緩慢下降；PEG 6000 模擬干旱處理后鐵皮石斛幼苗POD 活性均高于ck 組，且隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，POD 活性呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)達(dá)到峰值，為119×16.67 nkat·min-1·g-1(圖2B)。
2.1.3 對鐵皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理不同時(shí)間對鐵皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響差異顯著(P＜0.05)。可溶性糖不僅能夠?yàn)橹参锾峁┨荚次镔|(zhì)，還能維持一定的滲透壓。從圖3A 可看出：鐵皮石斛幼苗的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和處理時(shí)間的延長均呈上升趨勢，到第12 天時(shí)達(dá)最高，且隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，PEG 6000 為30%時(shí)，可溶性糖上升顯著，說明鐵皮石斛植株受到不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 模擬干旱脅迫時(shí)，通過增加可溶性糖來維持植物體內(nèi)細(xì)胞的滲透壓。
圖3 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Figure 3 Changes of soluble sugar and soluble protein contents in D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
從圖3B 可知：不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理對鐵皮石斛幼苗的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響(P＜0.05)，且隨著PEG 6000 處理時(shí)間的延長，鐵皮石斛幼苗的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢，且在處理相同時(shí)間，PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，鐵皮石斛幼苗的可溶蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越少。當(dāng)PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 30%時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第8～10 天時(shí)下降。此時(shí)蛋白質(zhì)分解加速，合成減少，說明鐵皮石斛幼苗可在一定程度上消耗可溶性蛋白來調(diào)節(jié)適應(yīng) PEG 6000 的脅迫處理，但需要一定的脅迫強(qiáng)度和時(shí)間。
2.2 PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響
由圖4A 可知：PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗莖段和葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著影響(P＜0.05)。隨著PEG 6000 模擬干旱脅迫時(shí)間的延長，鐵皮石斛幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，在PEG 6000 模擬干旱處理2～8 d 時(shí)，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，到第10 天時(shí)，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇下降，較同一時(shí)間的ck 分別下降了32.01% (5%PEG 6000)、35.03% (10%PEG 6000)、44.07% (20%PEG 6000)和57.06% (30%PEG 6000)，且隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，葉綠素下降幅度明顯增加。方差分析結(jié)果表明：不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理對鐵皮石斛幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的有顯著的影響(P＜0.05)。對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理12 d 時(shí)鐵皮石斛幼苗莖段和葉片瓊脂糖包埋震蕩切片觀察發(fā)現(xiàn)：鐵皮石斛莖段和葉片細(xì)胞內(nèi)葉綠素隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減少(圖4B)，與測得葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果一致。
圖4 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理后鐵皮石斛幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)及在莖和葉上的分布(B)Figure 4 Chlorophyll contents (A) and its distribution on stems and leaves (B) of D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress treatment
2.3 對鐵皮石斛幼苗光合效率和電子傳遞速率的影響
由圖5A 和5B 可知：PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗處理不同時(shí)間對α和ETR 的影響差異顯著(P＜0.05)。隨著PEG 6000 脅迫處理時(shí)間的延長和PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，α和ETR 均呈下降趨勢，在4～8 d 時(shí)下降的幅度最大。與ck 組相比，隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，α下降幅度增大(圖5A)。在PEG 6000 為30%處理時(shí)ETR 下降幅度最大，PEG 6000 為20%和30%處理12 d 時(shí)ETR 達(dá)到最低(圖5B)，說明PEG 6000 脅迫處理會(huì)使鐵皮石斛幼苗的光合作用減弱，且隨著脅迫程度增加，光合作用減弱的幅度越大。這與PEG 6000 脅迫處理下鐵皮石斛葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低的結(jié)果一致。
圖5 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗光合效率和電子傳遞速率的變化Figure 5 Changes of photosynthetic efficiency and electron transfer rate of D.candidumseedlings after PEG 6000 simulated drought stress
2.4 PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
2.4.1 對鐵皮石斛幼苗光能轉(zhuǎn)換效率的影響 由圖6A 可知：Fv/Fm隨著不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理時(shí)間的延長呈逐漸下降的趨勢，在PEG 6000 處理第2 天時(shí)，F(xiàn)v/Fm為0.723～0.743。未添加PEG 6000 處理在第2～8 天時(shí)，鐵皮石斛幼苗Fv/Fm為0.703～0.743，說明光能轉(zhuǎn)換正常，但到第10～12 天時(shí)，F(xiàn)v/Fm顯著下降(P＜0.05)，光轉(zhuǎn)換效率降低，可能由于長時(shí)間液體培養(yǎng)會(huì)對鐵皮石斛幼苗生長產(chǎn)生不利影響。隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P＜0.05)，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 (5%)處理后第2～8 天，F(xiàn)v/Fm為0.698～0.713，說明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 對鐵皮石斛幼苗PSⅡ的損傷較小，而第8～12 天逐漸下降；10%～30%PEG 6000 處理后第4 天，F(xiàn)v/Fm開始顯著下降，說明鐵皮石斛幼苗受到模擬干旱脅迫后，植株的最大光能轉(zhuǎn)換效率降低，PSⅡ受到脅迫損傷，嚴(yán)重影響鐵皮石斛幼苗的光合作用。
圖6 PEG 6000 模擬干旱脅迫后鐵皮石斛幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化Figure 6 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
2.4.2 對熒光猝滅系數(shù)的影響 熒光猝滅主要有光化學(xué)猝滅和非光化學(xué)猝滅，光化學(xué)猝滅是由碳代謝酶光活化和氣孔開放引起的PSⅡ電子傳遞速率增加，光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)一定程度上反映PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度；非光化學(xué)猝滅是由能量轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的熱耗散效率增加，qNP為非光化學(xué)猝滅系數(shù)。非光化學(xué)猝滅是一種保護(hù)途徑，通過熱耗散消耗過剩的光能，使光合機(jī)構(gòu)免受傷害[32-33]。PEG 6000 模擬干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗處理不同時(shí)間對qNP和qP的影響差異顯著(P＜0.05)。由圖6B 可知：不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 處理均使qP在第2～12 天逐漸降低，且隨著PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降，說明PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度隨之降低，參加光化學(xué)反應(yīng)的激發(fā)能量明顯降低，過剩的光能就會(huì)增加。由圖6C 可看出：當(dāng)PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～10%時(shí)，鐵皮石斛幼苗qNP隨著處理時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，PEG 6000 為0 和5%時(shí)，在處理的第10 天qNP達(dá)最高值(0.584 和0.593)，PEG 6000 為10%時(shí)于第8 天qNP達(dá)最高值(0.509)；PEG 6000 為20%和30%時(shí)，鐵皮石斛幼苗qNP隨著處理時(shí)間的延長持續(xù)下降，說明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 脅迫下，非光化學(xué)猝滅途徑發(fā)揮了保護(hù)作用，qNP增大；但隨著處理時(shí)間的延長或在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 脅迫下，qNP自我保護(hù)機(jī)制達(dá)到一定限度，導(dǎo)致光合反應(yīng)受到傷害，無法逆轉(zhuǎn)，使qNP呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。
3 討論
3.1 鐵皮石斛對干旱脅迫的生理生化響應(yīng)
干旱是全球性環(huán)境問題之一。植物不能逃避惡劣的自然環(huán)境條件，只能加速適應(yīng)各種逆境。大多數(shù)植物可改變自身的生理生化指標(biāo)來響應(yīng)干旱逆境脅迫，以維持植物正常生長。
MDA 是細(xì)胞膜受到逆境脅迫傷害引起的膜脂過氧化產(chǎn)物，MDA 質(zhì)量摩爾濃度是判斷植物細(xì)胞膜受到傷害程度的重要指標(biāo)，MDA 質(zhì)量摩爾濃度越高說明細(xì)胞膜受傷程度越大[28,34-35]。本研究中，鐵皮石斛幼苗MDA 質(zhì)量摩爾濃度隨PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間不同存在差異，短時(shí)間(≤8 d) PEG 6000 模擬干旱脅迫處理后鐵皮石斛幼苗MDA 變化不大，對細(xì)胞膜影響較小，而長時(shí)間(≥10 d)處理后MDA 急劇上升，且PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，MDA 質(zhì)量摩爾濃度越高，因此，PEG 6000 模擬干旱程度增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受到極大的傷害，膜脂過氧化程度也越大。這與構(gòu)樹Broussonetiapapyrifera[36]、北美紅櫟Quercusrubra[37]和大豆Glycinemax[38]幼苗在干旱脅迫時(shí)MDA 的變化一致。
小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖能通過滲透調(diào)節(jié)平衡細(xì)胞滲透勢，提高細(xì)胞保水能力而維持細(xì)胞的正常生理過程。同時(shí)，干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜受損，透性增大，引起膜脂過氧化反應(yīng)，會(huì)對蛋白質(zhì)造成傷害，因此細(xì)胞內(nèi)可溶性糖和蛋白變化能夠穩(wěn)定滲透調(diào)節(jié)能力，是反映植物抗旱性的有效指標(biāo)之一[14,39]。本研究中，鐵皮石斛幼苗可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脅迫處理時(shí)間的延長呈上升趨勢，說明鐵皮石斛幼苗細(xì)胞通過積累可溶性糖來提高細(xì)胞液濃度，降低細(xì)胞膜的滲透勢，維持體內(nèi)細(xì)胞的滲透壓保持自身正常的生理過程。這與玉米的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨干旱脅迫的加劇逐漸升高的變化趨勢一致[40]。在處理時(shí)間相同時(shí)，PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，鐵皮石斛幼苗可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，說明干旱環(huán)境對鐵皮石斛細(xì)胞造成極大的傷害。
植物體內(nèi)較低的活性氧不會(huì)對植物細(xì)胞產(chǎn)生傷害[41]，而當(dāng)植物受干旱脅迫時(shí)活性氧的代謝平衡被嚴(yán)重破壞，活性氧增多，攻擊植物蛋白質(zhì)上各種氨基酸殘基，使蛋白質(zhì)和葉綠素等分子解體，從而對植物細(xì)胞產(chǎn)生各種毒害作用。POD、CAT 等保護(hù)酶能有效抑制和清除植物體內(nèi)的各種活性氧和自由基[42]。本研究表明：PEG 6000 模擬干旱處理鐵皮石斛幼苗后，POD 和CAT 活性都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，POD 和CAT 酶活性的大幅提高大大增強(qiáng)對活性氧的抵抗能力和對植物光合機(jī)構(gòu)的保護(hù)能力。該結(jié)果與三葉草Trifoliumrepens受到干旱脅迫時(shí)POD 和CAT 的活性變化一致[25]。因此，植物受干旱脅迫時(shí)通過提高相關(guān)保護(hù)酶活性來保持體內(nèi)活性氧平衡。
3.2 PEG 6000 模擬干旱脅迫對葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
葉綠素是光合作用最重要的色素，光合作用時(shí)葉綠素吸收能量，為CO2轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓衔锾峁┠芰?；水分是葉綠素的合成原料，干旱脅迫能使葉綠素合成減緩及葉綠素解體，直接導(dǎo)致葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。本研究中PEG 6000 模擬干旱處理鐵皮石斛幼苗后，莖段和葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，與PEG 模擬干旱脅迫不同抗逆性棉花Gossypiumhirsutum的葉綠素變化趨勢一致[43]。
葉綠素?zé)晒夂椭参锕夂献饔藐P(guān)系密切，當(dāng)強(qiáng)光持續(xù)照射植物時(shí)，為了有效避免植物葉綠體內(nèi)吸收的光能超過光合作用中發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的能量消耗及過量的光能灼傷植物光合作用機(jī)構(gòu)，植物以熒光的方式耗盡消散掉部分光能以起重要保護(hù)作用；自然條件下葉綠素?zé)晒夂椭参锕夂纤俾食守?fù)相關(guān)，葉綠素?zé)晒庾內(nèi)鯐r(shí)光合速率就高，反之亦然。植物遭受脅迫的程度與光合作用的葉綠素?zé)晒馓匦杂兄芮械年P(guān)系[44]。本研究中，PEG 6000 模擬干旱處理鐵皮石斛幼苗，F(xiàn)v/Fm、qP、ETR 均呈下降趨勢，表明PEG 6000 干旱脅迫對植物光合作用產(chǎn)生了傷害；PEG 6000 干旱脅迫使鐵皮石斛幼苗qNP呈上升趨勢，說明鐵皮石斛幼苗通過啟動(dòng)非光化學(xué)猝滅途徑來大量消耗PSⅡ反應(yīng)中心吸收的過剩光能。隨著PEG 6000 脅迫的不斷加重，qNP也開始呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，可能是由于熱耗散機(jī)制受阻，無法使耗散掉吸收的過剩光能，導(dǎo)致光系統(tǒng)受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷，影響光合作用。因此，植物受到干旱脅迫時(shí)光合作用能力降低從而影響植物的正常生長。
4 結(jié)論
通過研究對鐵皮石斛幼苗進(jìn)行PEG 6000 模擬干旱脅迫處理后的生理和葉綠素?zé)晒馓匦?，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛幼苗具有一定的抗旱能力，在適當(dāng)干旱條件下可通過自身調(diào)節(jié)來達(dá)到正常生長的目的，但也有一定限度。在較低PEG 6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(≤5%)脅迫時(shí)，可以通過調(diào)節(jié)代謝實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)，在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6000 (≥20%)時(shí)，干旱脅迫會(huì)損傷植物，影響生理過程和光合作用。20% PEG 6000 脅迫10 d 可作為鐵皮石斛抗干旱品種篩選的標(biāo)準(zhǔn)；鐵皮石斛幼苗可通過增加可溶性糖，減少可溶性蛋白，提高POD 和CAT 等防御酶活性抵抗和適應(yīng)一定程度的干旱脅迫(≥20%PEG 6000 處理≥10 d)；鐵皮石斛幼苗的最大光能轉(zhuǎn)換效率降低，PSⅡ受到脅迫損傷，同時(shí)，鐵皮石斛幼苗通過啟動(dòng)qNP途徑來消耗PSⅡ反應(yīng)中心吸收的過剩光能，維持正常的光合作用。因此，可溶性糖和可溶性蛋白、防御酶POD 和CAT 以及葉綠體熒光參數(shù)均可作為鐵皮石斛的耐干旱指標(biāo)。
猜你喜歡
基層中醫(yī)藥(2021年3期)2021-11-22 08:08:08
數(shù)學(xué)大王·中高年級(jí)(2020年12期)2020-12-31 07:28:26
閱讀（科學(xué)探秘）(2020年8期)2020-11-06 06:22:48
趣味(語文)(2020年4期)2020-07-27 01:43:14
亞熱帶植物科學(xué)(2019年3期)2019-10-16 05:21:24
中國果業(yè)信息(2019年1期)2019-01-05 17:41:42
中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:56
現(xiàn)代園藝(2018年2期)2018-03-15 08:00:05
生物學(xué)教學(xué)(2017年9期)2017-08-20 13:22:32
廣西林業(yè)科學(xué)(2016年3期)2016-03-16 05:43:37
