王若虹, 楊振慧, 周詩文, 吳雨珈, 李秋方,2, 梁立強,石丹丹, 楊尚寧, 苗劉暢, 蘇松坤,*, 聶紅毅,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)與生物醫(yī)藥學(xué)院, 福州 350002; 2. 恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 恩施 445000)

昆蟲體色的變化是十分普遍而且高度多樣化的現(xiàn)象,這是其長期進化過程中為適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境產(chǎn)生的。體壁的顏色是各種色素如黑色素、眼色素和喋呤色素等以及尿酸鹽顆粒沉著的體現(xiàn),色素之間不同的組合模式形成了各自獨特的體色模式(高云等, 2020)。昆蟲表皮內(nèi)或皮細胞層下方各種色素分子是造成體壁成色的原因之一,形成的色素顆粒會隨著不同的生理狀態(tài)而有所變動,以此來改變表皮的顏色。為適應(yīng)環(huán)境變化,昆蟲復(fù)雜的體色變化受到多種因子的影響,各代謝通路中的1種或多種色素前體或酶含量的改變都會影響體色。在果蠅Drosophila和家蠶Bombyxmori中,yellow-y突變導(dǎo)致表皮呈現(xiàn)為黃色(Wittkoppetal., 2002; Futahashietal., 2008);家蠶檸檬蠶突變體中SPR突變導(dǎo)致幼蟲體表墨蝶呤的積累從而呈現(xiàn)黃色(Mengetal., 2009);家蠶由于犬尿氨酸羥化酶cinnabar缺失形成白卵突變體w-1,其成蟲眼色呈現(xiàn)為白色而非黑褐色(Quanetal., 2002)。在昆蟲中,色素在體色形成、防御、體溫調(diào)節(jié)和覓食等方面具有重要作用(Wittkopp and Beldade, 2009; Kronforstetal., 2012)。

由于果蠅和家蠶中存在較多的色素突變體以及已有的成熟的遺傳操作工具,因此對果蠅和家蠶色素形成機制所開展的研究工作較多。昆蟲的體色主要由黑色素、蝶呤、眼色素及尿酸鹽顆粒共同決定(孫明霞等, 2020)。作為膜翅目的蜜蜂,具有婚飛交配和清理行為的特性,導(dǎo)致大量的突變體很難保存,因此,色素形成機制方面的研究工作較少。不同蜂種的蜜蜂以及相同蜂種不同生態(tài)型之間在體色上都會產(chǎn)生差異。目前蜜蜂屬蜜蜂共有9種,其中我國主要飼養(yǎng)中華蜜蜂Apisceranacerana(東方蜜蜂Apiscerana指名亞種)和西方蜜蜂A.mellifera。中華蜜蜂是我國獨有的蜜蜂種質(zhì)資源,已經(jīng)進化出適應(yīng)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的9種生態(tài)型:北方中華蜜蜂、華中中華蜜蜂、華南中華蜜蜂、長白山中華蜜蜂、阿壩中華蜜蜂、海南中華蜜蜂、滇南中華蜜蜂、云貴中華蜜蜂和西藏中華蜜蜂,這些中華蜜蜂腹部的體色呈現(xiàn)地域多樣性,但胸部背板基本均呈現(xiàn)黑色(薛運波, 2020)。廖文新(2019)在福建三明市蜂場首次發(fā)現(xiàn)了一群胸部背板棕紅色的中華蜜蜂,之后稱為紅背中華蜜蜂。紅背中華蜜蜂的發(fā)現(xiàn)豐富了中華蜜蜂遺傳資源,為蜜蜂著色分子機制的研究提供了較好的生物材料,然而,截止目前為止,紅背中華蜜蜂的形態(tài)及其著色差異的分子機制尚未報道。

本研究運用體視顯微鏡觀察紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂的體表顏色差異;通過同源比對鑒定中華蜜蜂色素通路相關(guān)基因,包括黑色素通路苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)基因、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)基因、多巴脫羧酶(dopa decarboxylase, DDC)基因、NBAD合成酶基因ebony、NBAD水解酶基因tan、芳烷基胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(arylalkylamine-N-acetyltransferase, aaNAT)基因、多巴色素轉(zhuǎn)移酶基因yellow-y和酚氧化酶基因laccase2,蝶呤通路GTP環(huán)化水解酶Ⅰ(GTP cyclo-hydrolase Ⅰ, GTPCH Ⅰ)基因、墨蝶呤還原酶(sepia pterin reductase, SPR)基因和6-丙酮?；臍渖锏屎厦?6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase, PTPS)基因,眼色素通路色氨酸氧化酶基因vermilion、犬尿氨酸羥化酶基因cinnabar,以及尿酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的尿酸鹽顆粒轉(zhuǎn)運基因BLOS2、Hermansky-Pudlak綜合征5的同源基因HPS5、半型ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因OK(okusatranslucent)、轉(zhuǎn)運尿酸鹽顆?；騐arp(VPS9-ankyrinrepeat-containingprotein);利用熒光定量PCR檢測以上色素通路及尿酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因在紅背中華蜜蜂中的表達量變化。這些結(jié)果為闡明紅背中華蜜蜂色素形成的分子機制提供大量可靠的數(shù)據(jù),同時也為中華蜜蜂的分子選育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗蜂群

蜂群飼養(yǎng)于福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)與生物醫(yī)藥學(xué)院實驗蜂場,其中紅背中華蜜蜂蜂王來自福建省三明市;分別選取3群群勢強且健康的紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂(正常個體)用于后續(xù)實驗。

1.2 主要儀器及試劑

連續(xù)變倍體視顯微鏡(奧特光學(xué)SZ680)、紫外分光光度計(NanoDrop 2000)、冷光源(至宸F-150C)、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)以及購自于Vazyme公司的Hiscript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA Wiper)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix。

1.3 紅背和黑背中華蜜蜂成年工蜂的形態(tài)觀察與樣本收集

為了準確控制取樣時間,將紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂蜂群中成熟封蓋子脾裝入蜂王產(chǎn)卵控制器中,然后置于恒溫培養(yǎng)箱(溫度31 ℃,相對濕度61%),待其羽化出房。收集出房后6 h內(nèi)的紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂用于形態(tài)觀察和后續(xù)分子檢測。將剛羽化出房的紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂分別放入1.5 mL離心管中,通入CO2麻醉10 min ,置于體視顯微鏡下觀察拍照;同時分別將60頭剛出房的紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂迅速放入液氮中冷凍保存。解剖紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂的胸部背板和腹部體壁組織,12只胸部背板為1組,各5組;6只腹部體壁組織為1組,各4組,用于后續(xù)熒光定量PCR檢測。

1.4 中華蜜蜂色素通路相關(guān)基因的鑒定

分別用黑腹果蠅D.melanogaster的DDC(GenBank登錄號: NP_724164.1),PAH(GenBank登錄號: NP_523963.2)和tan(GenBank登錄號: NP_001285042.1);西方蜜蜂的aaNAT(GenBank登錄號: XP_026299012.1),TH(GenBank登錄號: NP_001011633.1),ebony(GenBank登錄號: XP_016772147.2),yellow-y(GenBank登錄號: NP_001091693.1),laccase2(GenBank登錄號: XP_006562317),SPR(GenBank登錄號: XP_016770924.1),PTPS(GenBank登錄號: XP_006571389.1),cinnabar(GenBank登錄號: XP_026296051.1),HPS5(GenBank登錄號: XP_003250103.1);赤擬谷盜Triboliumcastaneum的vermilion(GenBank登錄號: NP_001034499.1);家蠶的GTPCHI(GenBank登錄號: NP_001138797.1),BLOS2(GenBank登錄號: XP_021207937.2),OK(GenBank登錄號: XP_012551185.2),Varp(GenBank登錄號: NP_001166968.1), 受體型鳥苷酸環(huán)化酶(receptor-type guanylate cyclase, GC-I)基因(GenBank登錄號: NP_001036870.1)氨基酸序列作為參考序列,利用BLAST(NCBI)在東方蜜蜂基因組數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號: ACSNU-2.0)中進行檢索,最后選擇相似度和得分最高的序列作為中華蜜蜂的同源序列。利用Primer Premier 6.0軟件對中華蜜蜂中參與黑色素、眼色素、蝶呤通路和尿酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的同源基因設(shè)計特異性引物(表1)。

表1 引物信息

1.5 色素通路相關(guān)基因的熒光定量PCR檢測

利用Trizol法分別提取1.3節(jié)剛出房紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板和腹部體壁組織RNA,取1 μg總RNA參照Hiscript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)操作說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA,對1.4節(jié)篩選的色素通路相關(guān)同源基因表達量進行檢測;中華蜜蜂Actin作為相對定量的內(nèi)參基因;熒光定量PCR反應(yīng)體系(10 μL): 2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Low ROX Premixed) 5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O3.6 μL。反應(yīng)程序:

95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃變性15 s, 60 ℃ 30 s, 39個循環(huán)。每個樣本3個技術(shù)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量,GarphPad Prism 8軟件處理實驗數(shù)據(jù),采用數(shù)據(jù)分析中的獨立樣本T檢驗(independent samplesT-test)進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 剛出房紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂的形態(tài)

與黑背中華蜜蜂相比,紅背中華蜜蜂個體的胸部背板呈現(xiàn)棕紅色,其他部位并無明顯變化(圖1: A);在背板放大圖中,可以明顯看到兩者胸部背板上的絨毛都是淡黃色,只有背板表皮存在顏色差異(圖1: B)。

圖1 紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂形態(tài)觀察

2.2 黑色素代謝通路相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板中的表達模式

熒光定量PCR檢測結(jié)果表明(圖2),tan在紅背中華蜜蜂胸部背板中的表達量顯著低于黑背中華蜜蜂胸部背板中的表達量(P<0.05),而laccase2在紅背中華蜜蜂胸部背板中的表達量則較黑背中華蜜蜂胸部背板中的表達量顯著上調(diào)(P<0.05);TH,ebony和yellow-y在紅背中華蜜蜂胸部背板中表達量較黑背中華蜜蜂的均略有增加,PAH,DDC和aaNAT在紅背中華蜜蜂胸部背板中表達量較黑背中華蜜蜂的均略有下調(diào)。

圖2 黑色素代謝通路相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板中相對表達量

2.3 蝶呤通路相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板中的表達模式

結(jié)果顯示(圖3),相較于黑背中華蜜蜂,紅背中華蜜蜂胸部背板中SPR表達量顯著下調(diào)(P<0.05),GTPCHI和PTPS則略有上調(diào),GC-I略有下調(diào),但都無顯著差異(P>0.05)。

圖3 蝶呤通路相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板中的相對表達量

2.4 眼色素通路相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板中的表達模式

結(jié)果顯示(圖4),vermilion和cinnabar在紅背中華蜜蜂胸部背板中表達量較黑背中華蜜蜂的均顯著下調(diào)(vermilion:P<0.01;cinnabar:P<0.05)。

圖4 眼色素通路相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板中相對表達量

2.5 尿酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板中的表達模式

結(jié)果顯示(圖5),BLOS2在紅背中華蜜蜂胸部背板中表達量顯著低于黑背中華蜜蜂胸部背板中的表達量(P<0.01),而OK在紅背中華蜜蜂胸部背板中的表達量則較黑背中華蜜蜂胸部背板中的表達量顯著上調(diào)(P<0.05),HPS5和Varp在紅背中華蜜蜂胸部背板中的表達量較黑背中華蜜蜂的均略有下調(diào)(圖5)。

圖5 尿酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板中相對表達量

2.6 色素通路相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂腹部體壁中的表達模式

為了確定紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂胸部背板色素相關(guān)差異表達基因在腹部體壁中是否也存在差異,利用熒光定量PCR分別檢測紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂腹部體壁色素通路相關(guān)基因(tan,laccase2,SPR,vermilion,cinnabar,BLOS2和OK)的相對表達量。結(jié)果表明,OK在紅背中華蜜蜂腹部體壁中的相對表達量顯著低于黑背中華蜜蜂的(P<0.05),其他基因表達量無顯著變化(P>0.05)(圖6)。

圖6 色素通路相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂成年工蜂腹部體壁中的相對表達量

3 討論與結(jié)論

本研究全面比較了紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂的形態(tài)差異,并檢測了黑色素、蝶呤、眼色素通路和參與尿酸鹽轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因在紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂胸部背板中相對表達量。這些結(jié)果為闡明紅背中華蜜蜂色素形成的分子機制提供大量可靠的數(shù)據(jù)。

黑色素通路是參與昆蟲著色的重要通路,昆蟲中多巴胺是合成黑色素的主要前體物質(zhì),ebony催化多巴胺合成N-β-丙酰多巴胺(N-β-alanyl dopamine, NBAD),tan水解NBAD形成多巴胺,NBAD 經(jīng)laccase 2氧化生成NBAD骨質(zhì)參與表皮鞣化,呈現(xiàn)棕色表皮(Sugumaranetal., 1999; Sugumaran, 2002);此外,家蠶tan的突變導(dǎo)致紅眼紋(rouge,ro)突變體產(chǎn)生,在幼蟲體表形成紅褐色的斑紋(Futahashietal., 2010)。本研究檢測到紅背中華蜜蜂在黑色素通路tan的表達量較黑背中華蜜蜂的顯著下調(diào),laccase2的表達量顯著上調(diào)(圖2),推測紅背中華蜜蜂胸部背板有更多的多巴胺參與NBAD合成,并進一步被氧化形成紅褐色表皮。

由蝶呤合成的蝶呤類色素是可在昆蟲表皮和蝶類翅中呈現(xiàn)紅色、黃橙色的一類色素物質(zhì)(Wijnenetal., 2007)。SPR是合成四氫生物喋呤(tetrahydrobiopterin, BH4)所必需的,檸檬蠶(lem)是一種幼蟲體色突變體,色素分離鑒定實驗表明,SPR活性降低使得幼蟲時期積累著大量的墨蝶呤和墨蝶呤脫氨產(chǎn)物,最終呈現(xiàn)黃體色表皮(Mengetal., 2009)。SPR不同程度地突變,使SPR活性也會發(fā)生相應(yīng)程度的降低。我們檢測到紅背中華蜜蜂背板中蝶呤色素通路SPR的表達量較黑背中華蜜蜂的顯著下調(diào)(圖3), 基于此, 我們推測這將使得紅背中華蜜蜂背板呈現(xiàn)類似檸檬色或某種過渡狀態(tài)的體色。

眼色素在昆蟲中影響復(fù)眼、體表以及蝶類翅膀的著色,產(chǎn)生黑色或褐色的眼睛和紅色的表皮或翅。已有的研究發(fā)現(xiàn),敲除乳草長蝽Oncopeltusfasciatics的vermilion以及敲除麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis的cinnabar都可產(chǎn)生紅色眼睛的成蟲后代(Lietal., 2017; Redingetal., 2023)。本研究檢測到紅背中華蜜蜂胸部背板中眼色素通路相關(guān)基因vermilion和cinnabar表達量都顯著下調(diào)(圖4),推測可能是眼色素的生物合成減少形成了中華蜜蜂紅褐色的胸部背板。此外,昆蟲眼色素分為2類,暗眼色素 (ommin)和淡眼色素 (ommatins)(Figonetal., 2020)。暗眼色素普遍存在于昆蟲的眼睛中,少數(shù)昆蟲的表皮中也有分布,而淡眼色素存在于昆蟲的排泄物、眼睛、表皮和翅中(Linzen, 1970, 1974; Nijhout, 1997)。家蠶野生型都含暗眼色素色素和淡眼色素色素,家蠶的re突變體通過定位克隆確定是由re(編碼MFS轉(zhuǎn)運蛋白)基因變異產(chǎn)生re突變體,可能導(dǎo)致了暗眼色素合成缺陷,從而形成深紅色卵(Osanai-Futahashietal., 2012);家蠶pe突變體由于cardinal(吩噁嗪酮合成酶)基因突變不表達使得xanthommatin色素合成異常,形成紅色眼睛和白色或淡粉色的卵,而非正常的深色(Osanai-Futahashietal., 2016);褐飛虱Nilaparvatalugens紅眼突變體頭部眼黃素的含量顯著低于褐色眼野生型(蔣鵬凌, 2013),這些報道都表明眼色素的減少都會呈現(xiàn)紅體色。

在昆蟲中,尿酸以尿酸鹽顆粒的形式儲存在昆蟲體內(nèi),逐漸向幼蟲表皮遷移和積累,影響昆蟲表皮的著色(Tasakietal., 2017)。尿酸鹽顆粒在家蠶幼蟲真皮細胞的積累使得體壁變成白色或者不透明,保護幼蟲不受紫外線的傷害(Huetal., 2013)。柞蠶Antheraeapernyi2齡幼蟲BLOS2基因RNA干擾后幼蟲體壁出現(xiàn)了少量相對不同程度淺色狀,可能是柞蠶的天然體色遮蓋或者其他基因的影響并未出現(xiàn)明顯的大面積半透明或透明個體(馬月月等, 2020);家蠶OK的RNA干擾也會導(dǎo)致半透明體色(Wangetal., 2013)。在本研究中,我們檢測到紅背中華蜜蜂的胸部背板尿酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)基因BLOS2表達量顯著下調(diào)、OK表達量顯著上調(diào)(圖5),腹部體壁中OK表達量顯著下調(diào)(圖6),然而胸部背板和腹部體壁并未出現(xiàn)透明、半透明體色,可能是因為BLOS2和OK以及其他尿酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)基因共同作用導(dǎo)致體色未發(fā)生透明狀,也可能是由黑色素、蝶呤、眼色素和尿素顆粒共同作用的結(jié)果。

綜上所述,我們檢測到紅背中華蜜蜂胸部背板中部分黑色素、蝶呤、眼色素及尿酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達量均發(fā)生了顯著變化(圖2-5), 而在腹部體壁中沒有顯著差異(圖6),暗示這些基因在紅背中華蜜蜂胸部背板色素形成過程發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)家蠶鶉斑(quail,q)突變體5齡第1天幼蟲時表皮呈現(xiàn)粉紅色,而對照組則為白色;色素含量測定分析發(fā)現(xiàn)q突變體中黑色素、眼色素及喋呤色素均發(fā)生異常增加(Katoetal., 2006; Nieetal., 2014),這種變化與紅背中華蜜蜂檢測到色素通路相關(guān)基因表達量變化結(jié)果(圖2-4)相似。通過定位克隆發(fā)現(xiàn)q的突變基因為GC-1(Yuasaetal., 2016)。通過熒光定量PCR檢測,我們發(fā)現(xiàn)GC-1在紅背中華蜜蜂背板中表達量有降低,但是不存在顯著差異(圖3),這些結(jié)果暗示紅背中華蜜蜂中可能存在與家蠶q突變體不同的分子調(diào)控機制。紅背中華蜜蜂的性狀可以穩(wěn)定傳遞給后代,但是控制該性狀的基因尚不明確。后續(xù)可以配制紅背中華蜜蜂純系材料,通過圖位克隆的方法鎖定其突變基因,比較紅背中華蜜蜂和黑背中華蜜蜂的遺傳差異,闡明突變的分子機制。同時,文獻報道昆蟲的體色也受到環(huán)境因素的調(diào)節(jié),如視覺、嗅覺和觸覺、溫度、光照周期等刺激以及內(nèi)分泌因素(激素、信息素等) (陳兵等, 2023; Huangetal., 2023),紅背中蜂是否受到環(huán)境因素的調(diào)節(jié)需要后續(xù)進一步研究,這也將有助于深入挖掘和培育優(yōu)良的中蜂遺傳資源。