葉亞萍, 劉治灘, 李琪明, 臧 賀,2,3, 馮佩林, 王 寧,王 杰, 黃枳腱, 陳大福,2,3,*, 郭 睿,2,3,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)與生物醫(yī)藥學(xué)院, 福州 350002; 2. 天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002;3. 福建省蜂療研究所, 福州 350002; 4. 四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳畜牧總站, 成都 610041)

Argonaute (AGO)家族在模式植物擬南芥Arabidopsisthaliana中被首次發(fā)現(xiàn)(Bohmertetal., 1998),是一類在進(jìn)化上高度保守的蛋白家族,雖然不同物種含有的AGO蛋白數(shù)量存在較大差異,但不同的AGO蛋白都包含N末端、PAZ結(jié)構(gòu)域、MID結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域(Vaucheret, 2009; Poterala and Rzeszowska-wolny, 2016; Xuetal., 2016)。Wang等(2013)在家蠶Bombyxmori中鑒定到4個(gè)AGO蛋白(BmAgo1, BmAgo2, BmAgo3和BmPiwi)及其編碼基因,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)BmAgo1,BmAgo2和BmAgo3在家蠶的不同組織與發(fā)育階段均有表達(dá),而BmPiwi主要在精原細(xì)胞中表達(dá),當(dāng)受到家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)侵染后上述4個(gè)基因在家蠶體內(nèi)均被激活表達(dá)。AGO蛋白在小RNA誘導(dǎo)的基因沉默過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能,如miRNA通過結(jié)合AGO被整合進(jìn)miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(miRNA-induced silencing complex, miRISC),進(jìn)而識(shí)別靶mRNA的3′UTR上的同源靶位點(diǎn)切割靶mRNA或抑制其翻譯(Bartel, 2004)。miRISC通常能夠保護(hù)miRNA免受核酸酶的降解,但當(dāng)miRISC配對(duì)到一些特殊的靶RNA時(shí)可觸發(fā)靶標(biāo)降解(Shietal., 2020)。

相比于智人Homosapiens(Sheu-Gruttadauria and Macrae, 2018)和擬南芥(Oliver and Martinez and Martinez, 2022)等模式生物,昆蟲AGO蛋白的研究較為滯后。有研究表明AGO在昆蟲的蛋白翻譯、生長(zhǎng)發(fā)育及免疫應(yīng)答(van Rjjetal., 2006; Iwasaki and Tomari, 2009)等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要功能。例如, van Rjj等(2006)曾通過RNAi沉默黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RSCI)中的催化組分ago-2的編碼基因,發(fā)現(xiàn)沉默ago-2基因后宿主對(duì)果蠅C病毒(DrosophilaC virus, DCV)感染的敏感程度遠(yuǎn)高于正常果蠅,說明RISC活性在果蠅的抗病毒免疫防御中起到核心作用;王艷麗等(2016)通過注射dsRNA沉默飛蝗LocustamoratoriaAGO1基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)飛蝗的生長(zhǎng)發(fā)育和存活率均受到顯著影響;Karamipour等(2019)發(fā)現(xiàn)銀紋夜蛾多核多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)感染草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaSf9細(xì)胞后,Ago1的表達(dá)量顯著升高,然而當(dāng)相應(yīng)dsRNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞沉默Ago1后,病毒DNA的復(fù)制能力增強(qiáng),說明Ago1潛在參與宿主的侵染應(yīng)答。

此前,在西方蜜蜂Apismellifera中已鑒定到3種AGO基因,其中AmAGO1(GenBank登錄號(hào): LOC552062)和AmAGO2(GenBank登錄號(hào): LOC411577)編碼的蛋白屬于AGO蛋白亞家族,而AmAGO3(GenBank登錄號(hào): LOC725111)編碼的蛋白屬于PIWI蛋白亞家族。目前,關(guān)于蜜蜂AGO蛋白的研究還十分有限。廖珍(2009)克隆到意大利蜜蜂A.melliferaligusticapiwi-like-1蛋白基因Am-ago3的全長(zhǎng)序列,并通過測(cè)定表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)Am-ago3在雄蜂中的表達(dá)量顯著高于工蜂中的表達(dá)量;Zhao等(2019)曾對(duì)意大利蜜蜂和狄斯瓦螨Varroadestructor之間的相互作用進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)AGO2的表達(dá)量在狄斯瓦螨寄生2 d后顯著上升達(dá)到峰值,且與抗菌肽基因AMP及轉(zhuǎn)錄因子Dorsal的表達(dá)趨勢(shì)相同,表明AGO2可能發(fā)揮了類似于抗菌肽或轉(zhuǎn)錄因子的作用。目前,GenBank數(shù)據(jù)庫收錄了西方蜜蜂的AGO1基因(AmAGO1)的預(yù)測(cè)序列,但AmAGO1的分子克隆和功能研究仍然缺失。因此,通過預(yù)測(cè)AmAGO1的理化性質(zhì)和分子特性,測(cè)定AmAGO1在西方蜜蜂中的時(shí)空表達(dá)譜及制備AmAGO1的多克隆抗體,可為深入開展AmAGO1的功能與機(jī)制研究提供參考和基礎(chǔ)。本研究對(duì)AmAGO1的編碼序列(coding sequence, CDS)進(jìn)行分子克隆,利用生物信息學(xué)解析AmAGO1蛋白的理化性質(zhì)和分子特性,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達(dá)AmAGO1融合蛋白,進(jìn)而制備AmAGO1的多克隆抗體,并通過ELISA, Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)分別檢測(cè)抗體效價(jià)、靈敏度和特異性,旨在豐富AmAGO1的基本信息,為進(jìn)一步開展AmAGO1的功能和機(jī)制研究提供了參考和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

西方蜜蜂工蜂卵、3日齡幼蟲、7日齡預(yù)蛹、8日齡預(yù)蛹、12日齡蛹以及1, 2, 6, 12, 15和18日齡成蟲均取自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)與生物醫(yī)藥學(xué)院教學(xué)蜂場(chǎng)的飼養(yǎng)蜂群。

1.2 AmAGO1基因CDS區(qū)的PCR擴(kuò)增、TA克隆及Sanger測(cè)序

利用RNA提取試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司,北京)提取西方蜜蜂工蜂6日齡幼蟲(n=3)腸道總RNA,再利用Hifair?AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (上海翌圣生物科技有限公司,上海)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的西方蜜蜂AmAGO1(GenBank登錄號(hào): LOC552062) CDS區(qū)核苷酸序列,利用Primer Premier 5軟件(Singhetal., 1998)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物(TA-AGO1-F: 5′-TGCTCGACTATTTTA CATA-3′; TA-AGO1-R: 5′-TTTGTATCAATTGCATG TG-3′)。使用高保真酶PCR Mix (擎科生物技術(shù)有限公司,北京)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)在梯度PCR儀(Bio-Rad公司,美國)上進(jìn)行,反應(yīng)體系(20 μL): PCR mix 10 μL, 無菌水 7 μL, 上下游引物(2.5 pmol/μL)各1 μL, cDNA模板1 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 共34個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.8%的瓊脂糖凝膠電泳后再紫外凝膠成像儀(上海培清科技有限公司,上海)下觀察。參照郭意龍等(2022)的方法,利用FastPure?Gel DNA Extraction Mini Kit (諾唯贊生物科技股份有限公司,南京)回收目的片段,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞DH5α (上海唯地生物技術(shù)有限公司,上海),涂板后培養(yǎng)過夜,次日挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基(氨芐抗性)振蕩培養(yǎng)12 h,取少量菌液進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果陽性的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.3 AmAGO1蛋白的生物信息學(xué)分析

利用Expasy網(wǎng)站(https:∥www.expasy.org/)上的Protparam, ProtScale, SignalP 4.1 Server, NetPhos 3.1 Server和SMART等軟件(Letunicetal., 2012; Duvaudetal., 2021)預(yù)測(cè)和分析AmAGO1編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)、親水性、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。在NCBI (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中下載智人、黑腹果蠅、家蠶、西方蜜蜂、東方蜜蜂A.ceranacerana、歐洲熊蜂Bombusterrestris和斑馬魚Daniorerio的AGO1蛋白氨基酸序列,使用MEGA7.0軟件(Kumaretal., 2016)進(jìn)行多重序列比對(duì),進(jìn)而采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)行3次重復(fù),其余參數(shù)為軟件默認(rèn)。

1.4 AmAGO1的時(shí)空表達(dá)譜檢測(cè)

利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)AmAGO1的qPCR引物(AmAGO1-F: 5′-CAAGTTCTTCTGTTGG AGCA-3′, AmAGO1-R: 5′-AGGTTGAGGAGGAGTGT GTG-3′)。參照吳鷹等(2023)的方法,收集剛出房的西方蜜蜂工蜂成蟲置于冰上麻醉,利用干凈的眼科鑷和眼科剪在超凈工作臺(tái)上小心剖取觸角、咽下腺、腦、表皮、中腸、脂肪體和毒腺等組織,3次生物學(xué)重復(fù),每次生物學(xué)重復(fù)含3頭工蜂成蟲。分別提取上述7種組織,工蜂卵、3日齡幼蟲、7日齡預(yù)蛹、8日齡預(yù)蛹和12日齡蛹,以及1, 2, 6, 12, 15和18日齡工蜂成蟲的總RNA,作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到的cDNA作為模板進(jìn)行qPCR以檢測(cè)AmAGO1的時(shí)空表達(dá)譜。反應(yīng)體系和程序均按照吳鷹等(2023)的報(bào)道設(shè)置。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3次平行重復(fù)。

1.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建

鑒于AmAGO1的核苷酸序列較長(zhǎng),因此選擇AmAGO1的部分片段進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建。利用DNASTAR軟件(Burland, 1999)中的protean工具對(duì)AmAGO1的氨基酸序列進(jìn)行分析,選取抗原指數(shù)較高、親水性較強(qiáng)及表面可及性較強(qiáng)的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)上述區(qū)域的上下游引物并在上下游引物的5′端分別添加NcoⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基,引物分別命名為AGO1-F(5′-CATGCCATGGGCTTAGACATTCGAGAT ATAG-3′)和AGO1-R(5′-CCGCTCGAGTTGAACGTA TGAATCATTA-3′)。按照1.2節(jié)的方法設(shè)置反應(yīng)體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸10 min, 共30個(gè)循環(huán)。同樣按照1.2節(jié)的方法進(jìn)行擴(kuò)增片段的回收、TA克隆及Sanger測(cè)序。

將測(cè)序正確的菌液轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基(氨芐抗性),繼續(xù)震蕩培養(yǎng)。利用FastPure Plasmid Mini Kit (諾唯贊生物科技股份有限公司,南京)提取質(zhì)粒,再使用NcoⅠ和XhoⅠ(TaKaRa,日本)對(duì)提取的pESI-T-AmAGO1質(zhì)粒和pET-28a載體(索萊寶生物科技有限公司,北京)進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收,再將回收片段與酶切后的pET-28a載體混合后進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行涂板、挑斑及測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的菌液進(jìn)行擴(kuò)增,提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞(全式金生物技術(shù)有限公司,北京),同時(shí)轉(zhuǎn)化未插入片段的空載pET-28a質(zhì)粒作為對(duì)照,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物復(fù)蘇后涂板于LB固體培養(yǎng)基(卡那霉素抗性),挑斑后搖菌過夜。將菌液加入50%甘油后保存于-80 ℃超低溫冰箱(Sanyo公司,日本)備用。

1.6 AmAGO1融合蛋白的原核表達(dá)

1.6.1蛋白小量表達(dá)和驗(yàn)證:取50 μL 1.5節(jié)保存的菌液加入到2 mL LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素抗性),37 ℃,200 r/min搖菌。待菌液的OD值達(dá)到0.6左右后加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG) (索萊寶生物科技有限公司,北京),使其終濃度達(dá)到1 mmol/L。繼續(xù)搖菌8 h后12 000 r/min 4 ℃離心,加入20 μL 5×蛋白上樣緩沖液以及80 μL PBS緩沖液重懸沉淀,100 ℃孵育5 min,12 000 r/min 4 ℃離心5 min后取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。由于構(gòu)建的pET-28a-AmAGO1質(zhì)粒蛋白C端帶有6×His標(biāo)簽,因此通過Western blot對(duì)融合蛋白進(jìn)行檢測(cè),采用鼠Anti-His Mouse多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司,北京)作為一抗,使用HRP標(biāo)記的兔抗鼠單克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司,北京)作為二抗,ECL顯色后進(jìn)行曝光觀察。

1.6.2IPTG最佳濃度篩選:分別取50 μL保存的菌液,加入到5管2 mL LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素抗性),在菌液OD值達(dá)到0.6左右時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),使其終濃度分別達(dá)到0.1, 0.2, 0.6, 1.0和2.0 mmol/L。按照1.6.1節(jié)的方法分別對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)出的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.6.3蛋白表達(dá)形式鑒定:取1 mL保存的菌液加入到50 mL LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素抗性),按照1.6.1節(jié)的方法選取蛋白表達(dá)最高時(shí)的IPTG濃度進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),24 h后8 000 r/min 4 ℃離心5 min,收集菌液沉淀,加入5 mL PBS緩沖液后使用超聲波細(xì)胞破碎儀(新芝生物科技有限公司,寧波)破碎菌體,程序設(shè)置為:超聲功率200 W,超聲2 s,間隔3 s,共20 min。破碎后的菌液轉(zhuǎn)移至離心管,8 000 r/min 4 ℃離心5 min以分離上清和沉淀,再通過SDS-PAGE鑒定融合蛋白的表達(dá)形式。

1.6.4蛋白大量表達(dá)與純化:按照1∶100的比例將保存的菌液加入到總共2 L的LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素抗性),按照1.6.1節(jié)的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。搖菌完成后離心菌液,用裂解液(50 mmol/L Tris, 300 mmol/L NaCl, pH 8.0)重懸沉淀,加入苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)使其終濃度達(dá)到1 mmol/L,超聲波破碎菌體后離心收集包涵體。使用洗滌液(2 mol/L尿素, 50 mmol/L Tris, 300 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 8.0)進(jìn)行洗滌包涵體1 h后離心收集沉淀,再用包涵體溶解液(8 mol/L 尿素, 50 mmol/L Tris, 300 mmol/L NaCl, pH 8.0)溶解包涵體2 h,離心收集上清,用0.45 μmol/L濾器進(jìn)行過濾,參照楊付來等(2020)報(bào)道的方法進(jìn)行蛋白純化。將純化過程中的上樣液、流穿液、洗雜液、不同咪唑濃度(50, 100, 200, 300和500 mmol/L)下的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE以檢測(cè)蛋白純化效果。收集純化蛋白,使用透析膜進(jìn)行梯度透析,然后使用PEG20000進(jìn)一步濃縮。最后使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,上海)測(cè)定純化蛋白的濃度。

1.7 多克隆抗體制備

參照吳鷹等(2023)的方法,將1.6.4節(jié)純化后的AmAGO1蛋白作為抗原與等體積弗式完全佐劑(Sigma,美國)和不完全佐劑(Sigma,美國)混勻用于免疫2只新西蘭大白兔,第1, 21, 35和49天連續(xù)免疫5次;第42和56天進(jìn)行耳靜脈采血后利用ELISA試劑盒(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司,上海)檢測(cè)抗血清效價(jià);待抗血清效價(jià)達(dá)到要求后,通過頸動(dòng)脈采集全血離心后收集血清,隨后進(jìn)行抗原親和純化,抗原包被量為2～5 μg/mL;再次利用ELISA試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.8 抗體檢測(cè)

1.8.1Western blot檢測(cè)靈敏度:收集重量約100 mg的西方蜜蜂工蜂6日齡幼蟲,液氮速凍后充分研磨,向粉末中加入1 mL蛋白提取液,冰上靜置30 min后14 000 r/min 4 ℃離心10 min,吸取上清(即幼蟲總蛋白);取40 μL上清,加入10 μL蛋白上樣緩沖液后100 ℃加熱5 min,12 000 r/min 4 ℃離心5 min,取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)膜到0.45 μm的PVDF膜上,封閉液中封閉2 h后加入AmAGO1多克隆抗體(1∶1 000稀釋),孵育1 h,洗膜液洗膜3次,每次5 min;加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔2抗(1∶10 000稀釋),室溫孵育1 h,洗膜液洗膜3次,每次5 min;吸干PVDF膜表面多余液體,將事先混合好的ECL顯色液滴加到膜上,在利用GE AI600多功能成像儀(GE,美國)進(jìn)行觀察和拍照,檢測(cè)抗體靈敏度。

1.8.2免疫沉淀檢測(cè)特異性:取50 μL Protein A/G磁珠(碧云天生物技術(shù)有限公司,上海),PBS緩沖液洗滌后在磁力架上放置1 min,吸取上清,重復(fù)2次;用20 μL PBS緩沖液重懸磁珠后加入到1 mL的1.8.1節(jié)西方蜜蜂工蜂幼蟲蛋白提取液中,室溫孵育1 h,在磁力架上放置5 min,收集上清;將上清分為2份,一份加入5 μg的AmAGO1多克隆抗體,另一份加入兔IgG抗體作為對(duì)照,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜;次日向兩組中分別加入50 μL洗滌過的Protein A/G磁珠,室溫旋轉(zhuǎn)孵育2 h,離心后棄上清,加入1 mL PBS緩沖液重復(fù)洗滌5次;用100 μL PBS緩沖液重懸磁珠,加入蛋白上樣緩沖液后進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western blot檢測(cè),使用AmAGO1多克隆抗體作為一抗,HRP標(biāo)記的山羊抗兔(生工生物工程(上海)股份有限公司,上海)作為二抗照,檢測(cè)抗體特異性。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics軟件對(duì)AmAGO1在不同組織和蟲態(tài)及工蜂不同日齡成蟲中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),以P<0.05為顯著性閾值,采用Tukey氏檢驗(yàn)法和字母顯著標(biāo)記法兩兩比較分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 AmAGO1的CDS分子克隆和序列特征

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,通過PCR能夠擴(kuò)增出單一且符合預(yù)期大小(2 884 bp)的片段,Sanger測(cè)序結(jié)果證實(shí)目的片段與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的AmAGO1(GenBank登錄號(hào): LOC552062)序列完全一致,說明成功克隆到AmAGO1的CDS。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,AmAGO1含928個(gè)氨基酸,分子式為C4624H7332N1316O1325S51,分子量約為104.2 kD,等電點(diǎn)為9.31;AmAGO1含35個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn),10個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)及41個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn);AmAGO1的平均親水系數(shù)為-0.2965,親水氨基酸數(shù)量多于疏水氨基酸;AmAGO1中不存在典型的信號(hào)肽;AmAGO1含302(32.54%)個(gè)α-螺旋,165條(17.78%)延長(zhǎng)鏈, 54個(gè)(5.82%)β-轉(zhuǎn)角和407個(gè)(43.86%)無規(guī)則卷曲;AmAGO1含典型的PAZ結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域。

多重序列比對(duì)結(jié)果顯示(圖1),AmAGO1與東方蜜蜂、歐洲熊蜂、家蠶、腹黑果蠅、斑馬魚及智人的AGO1均具有較高的序列一致性。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示(圖1),同為脊椎動(dòng)物的智人和斑馬魚的AGO1聚為一支,同為無脊椎動(dòng)物的西方蜜蜂、東方蜜蜂、家蠶和黑腹果蠅的AGO1聚為一支;西方蜜蜂與東方蜜蜂的AGO1蛋白同源性最高。

圖1 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的西方蜜蜂和其他6個(gè)物種的AGO1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 AmAGO1的時(shí)空表達(dá)譜

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼蟲、預(yù)蛹、蛹和成蟲等不同發(fā)育階段中均有表達(dá),但表達(dá)量也存在差異;相較于AmAGO1在卵中的表達(dá)量,3日齡幼蟲和7日齡預(yù)蛹中AmAGO1的表達(dá)量顯著降低,而8日齡預(yù)蛹和12日齡蛹中AmAGO1的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)(圖2: A);AmAGO1在西方蜜蜂1, 2, 6, 12, 15和18日齡工蜂成蟲體內(nèi)也均有表達(dá),但表達(dá)量也存在差異,相較于AmAGO1在1日齡成蟲體內(nèi)的表達(dá)量, 2, 6, 12, 15和18日齡成蟲體內(nèi)AmAGO1的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖2: B)。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂成蟲觸角等7種組織中均有表達(dá)但表達(dá)量存在差異,相較于AmAGO1在觸角中的表達(dá)量,AmAGO1在毒腺、腦、中腸、脂肪體和表皮中的表達(dá)量顯著降低(P<0.05),而AmAGO1在咽下腺中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05),表皮中AmAGO1的表達(dá)量最低(圖2: C)。

圖2 AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同發(fā)育階段(A, B)和成蟲不同組織(C)中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 AmAGO1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

SDS-PAGE結(jié)果顯示,加入IPTG后在Transetta細(xì)胞中成功誘導(dǎo)表達(dá)出大小符合預(yù)期(約20 kD)的目的蛋白(圖3: A),進(jìn)一步利用6×His標(biāo)簽的特異性抗體對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)出的融合蛋白進(jìn)行Western blot,可檢測(cè)到大小約20 kD的蛋白,說明成功誘導(dǎo)表達(dá)出AmAGO1融合蛋白(圖3: B)。

圖3 IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET-28a-AmAGO1表達(dá)蛋白的 SDS-PAGE(A)和Western blot檢測(cè)(B)

分別使用不同IPTG濃度對(duì)重組質(zhì)粒pET-28a-AmAGO1進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)IPTG濃度為0.1, 0.2, 0.6, 1和2 mmol/L時(shí)均能誘導(dǎo)蛋白表達(dá),其中0.6 mmol/L時(shí)能誘導(dǎo)出更高的蛋白表達(dá)量(圖4)。

圖4 37 ℃條件下不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)AmAGO1 的SDS-PAGE檢測(cè)

對(duì)菌液破碎離心后得到的上清液以及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果顯示在沉淀中檢測(cè)到明顯的目的條帶,而在上清中僅能檢測(cè)到微弱的目的條帶,說明誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為包涵體形式(圖5)。大量表達(dá)及純化得到純度較高的AmAGO1融合蛋白的濃度達(dá)到0.8 mg/mL(圖6)。

圖5 pET-28a-AmAGO1質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)形式鑒定

圖6 純化的AmAGO1融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

2.4 AmAGO1多克隆抗體

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示AmAGO1多克隆抗體效價(jià)大于512 K,說明制備的抗體具有較高的效價(jià)和靈敏度。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示可以特異性檢測(cè)到AmAGO1蛋白(圖7: A),靈敏度高。免疫沉淀檢測(cè)結(jié)果顯示,AmAGO1多克隆抗體可以特異性富集AmAGO1蛋白,而兔IgG無法富集AmAGO1蛋白(圖7: B),表明制備的AmAGO1多克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性。

圖7 免疫沉淀(IP)檢測(cè)AmAGO1多克隆抗體的特異性

3 討論

本研究首次克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS,為持續(xù)深入開展相關(guān)研究提供了序列基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示AmAGO1含928個(gè)氨基酸,分子式為C4624H7332N1316O1325S51,分子量約為104.2 kD,等電點(diǎn)為9.31;親水性指數(shù)-0.2965,暗示其為親水性蛋白;AmAGO1含有典型的PAZ結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域,說明其屬于AGO蛋白家族;西方蜜蜂、東方蜜蜂、歐洲熊蜂、家蠶和黑腹果蠅的AGO1氨基酸序列相似度較高,且西方蜜蜂、東方蜜蜂、家蠶和黑腹果蠅的AGO1聚為一支(圖1),表明上述4種昆蟲的AGO1同源性較高;西方蜜蜂和東方蜜蜂的AGO1進(jìn)化距離最近,符合二者互為姐妹種的客觀事實(shí)。以上結(jié)果為進(jìn)一步探究AmAGO1的生物學(xué)功能提供了有價(jià)值的參考信息和理論依據(jù)。

AGO蛋白是昆蟲miRNA通路中的重要組成部分,AGO蛋白通過靶向泛素-蛋白酶體通路中的蛋白水解暴露miRNA進(jìn)行降解,即能夠與miRNA形成靶向miRNA降解機(jī)制(target-directed miRNA degradation, TDMD),進(jìn)而參與昆蟲體內(nèi)的諸多生物學(xué)過程(Shietal., 2020)。本研究發(fā)現(xiàn),AmAGO1在西方蜜蜂工蜂成蟲組織中均有表達(dá)(圖2: C),說明AmAGO1在西方蜜蜂體內(nèi)廣泛分布和表達(dá),暗示其功能的重要性。觸角是蜜蜂感知化學(xué)信號(hào)的主要器官,本研究發(fā)現(xiàn)AmAGO1在西方蜜蜂工蜂成蟲觸角中表達(dá)且表達(dá)量顯著高于毒腺、腦、中腸、脂肪體和表皮中的表達(dá)量,說明AmAGO1與西方蜜蜂工蜂的化學(xué)信號(hào)感知密切相關(guān)。蜜蜂咽下腺由兩條呈葡萄狀的腺泡組成,哺育蜂的咽下腺主要分泌蜂王漿哺育幼蟲,而采集蜂咽下腺行使加工碳水化合物代謝酶的功能(Corby-Harris and Snyder, 2018)。本研究中,剛出房的工蜂成蟲咽下腺中AmAGO1表達(dá)量顯著高于毒腺、腦、中腸、脂肪體和表皮中的表達(dá)量(圖2: C),推測(cè)AmAGO1參與蜂王漿的合成與分泌過程。蜜蜂中腸是消化食物、吸收營養(yǎng)和抵御病原入侵的重要器官(吳鷹等, 2023),本研究發(fā)現(xiàn)工蜂中腸中AmAGO1的表達(dá)量顯著高于毒腺、脂肪體和表皮中的表達(dá)量,暗示AmAGO1在西方蜜蜂工蜂的消化吸收和免疫防御中扮演重要角色。下一步擬通過對(duì)AmAGO1進(jìn)行RNAi探究AmAGO1在西方蜜蜂工蜂化學(xué)信號(hào)感知、蜂王漿合成與分泌及消化吸收和免疫防御中的功能。

蜜蜂是一種完全變態(tài)昆蟲,其生活史歷經(jīng)卵、幼蟲、預(yù)蛹、蛹和成蟲5個(gè)發(fā)育階段。本研究中,AmAGO1在工蜂卵、幼蟲、預(yù)蛹、蛹和成蟲中呈動(dòng)態(tài)差異表達(dá),說明AmAGO1在西方蜜蜂工蜂的變態(tài)發(fā)育過程中的各個(gè)階段持續(xù)發(fā)揮功能。此外,8日齡預(yù)蛹中AmAGO1的表達(dá)量顯著高于7日齡預(yù)蛹中的表達(dá)量(圖2: A),鑒于預(yù)蛹中組織器官發(fā)生劇烈的消解和重組,推測(cè)AmAGO1在此過程中發(fā)揮重要功能,值得進(jìn)一步深入研究。王艷麗等(2016)研究發(fā)現(xiàn),注射dsRNA干擾的飛蝗4齡若蟲AGO1后,待若蟲蛻皮至5齡期時(shí)發(fā)生大量死亡,說明AGO1與飛蝗的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),AmAGO1在1, 2, 6, 12, 15和18日齡工蜂成蟲體內(nèi)均有表達(dá)且總體表現(xiàn)為持續(xù)下降-上升-下降的表達(dá)趨勢(shì)(圖2: B),表明AmAGO1在西方蜜蜂成蟲發(fā)育過程中具有重要功能。在蜜蜂成蜂的發(fā)育過程中,6-16日齡的工蜂分泌腺十分發(fā)達(dá),其中6-12日齡的工蜂上鄂腺十分發(fā)達(dá),12日齡之后的工蜂蠟腺發(fā)達(dá),負(fù)責(zé)制造大量巢脾(曾志將, 2003)。本研究中,AmAGO1在1日齡工蜂體內(nèi)表達(dá)量最高,而在12日齡工蜂體內(nèi)表達(dá)量最低(圖2: B),表明AmAGO1與西方蜜蜂工蜂出房、腺體變化、制造巢脾之間具有相關(guān)性。上述結(jié)果為西方蜜蜂工蜂變態(tài)發(fā)育過程中AmAGO1的功能研究的時(shí)間點(diǎn)選取提供了重要參考。

原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、成本較低和操作簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn),是目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一(Fernández, 2004)。大腸桿菌細(xì)胞具有密碼子偏好性,因而含有較多稀有密碼子的基因在其中無法正常表達(dá)(Fernández, 2004)。由于Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中含有大腸桿菌細(xì)胞缺乏的稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA,理論上可用于外源基因的原核表達(dá)(Carmignotto and Azzoni, 2019)。本研究中,鑒于AmAGO1的核苷酸序列較長(zhǎng)(約2 884 bp),我們首先對(duì)AmAGO1蛋白進(jìn)行抗原表位分析,并結(jié)合親水性指數(shù)、抗原指數(shù)和表面可及性篩選出299～456個(gè)氨基酸區(qū)域用于構(gòu)建原核表達(dá)載體。本研究成功構(gòu)建含AmAGO1部分片段的pET-28a-AmAGO1重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,加入IPTG后可誘導(dǎo)表達(dá)出約20 kD的目的蛋白(圖3: A);進(jìn)一利用6×His標(biāo)簽的特異性抗體進(jìn)行Western blot,可檢測(cè)到大小約20 kD的蛋白(圖3: B)。上述結(jié)果表明成功誘導(dǎo)表達(dá)出AmAGO1融合蛋白。這說明對(duì)于核苷酸序列較長(zhǎng)的基因,篩選部分片段進(jìn)行原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建是一種可行方法(Chenetal., 2005),本研究提供了又一例證。

利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白,常由于蛋白合成速度過快而導(dǎo)致無法正確折疊,從而形成包涵體(Sánchezetal., 2022)。此外,由于大腸桿菌細(xì)胞無法像真核生物一樣對(duì)合成的蛋白進(jìn)行糖基化和甲基化等修飾,進(jìn)一步降低了蛋白的可溶性表達(dá)(Fernández, 2004)。有研究表明降低溫度可以提高原核表達(dá)過程中可溶性蛋白的含量(張磊等, 2021)。本研究嘗試在16 ℃進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),但發(fā)現(xiàn)目的蛋白仍然存在于包涵體?？紤]到本研究的主要目的是制備AmAGO1的多克隆抗體,故采用對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性的方法獲得目的蛋白。本研究在37 ℃條件下大量表達(dá)AmAGO1融合蛋白(圖4),進(jìn)而使用高濃度尿素溶解包涵體蛋白(圖5),SDS-PAGE結(jié)果顯示純化蛋白較為清晰、濃度較高,可滿足抗體制備的需要(圖6)。ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示制備的AmAGO1多克隆抗體的效價(jià)大于512 K,說明該抗體具有較高的效價(jià)和靈敏度。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示上述抗體可以在西方蜜蜂工蜂幼蟲蛋白樣本中檢測(cè)到約100 kD的條帶(圖7: A),符合預(yù)期大小,說明制備的AmAGO1多克隆抗體特異性較好。IP技術(shù)的原理是通過抗原與抗體的結(jié)合形成復(fù)合物沉淀以富集抗原蛋白,具有特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于鑒定蛋白質(zhì)及驗(yàn)證蛋白互作登方面的研究(DeCaprio and Kohl, 2017)。本研究中,IP組可以特異性富集AmAGO1蛋白(圖7: B),而IgG組不能富集AmAGO1蛋白,進(jìn)一步表明制備的AmAGO1多克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性。

AGO1蛋白能結(jié)合miRNA形成miRISC,進(jìn)而發(fā)揮基因沉默作用(Bartel, 2004)。目前,利用AGO抗體驗(yàn)證miRNA和靶基因的結(jié)合及互作關(guān)系已見諸于家蠶(楊帆等, 2019)、埃及伊蚊Aedesaegypti(Zhangetal., 2016)、褐飛虱Nilaparvatalugens(Yeetal., 2019)和朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus(馮楷陽, 2020)等節(jié)肢動(dòng)物的研究報(bào)道。但到目前為止,蜜蜂中的相關(guān)研究仍然缺失。本研究制備出的高效價(jià)、高靈敏度和強(qiáng)特異性的AmAGO1多克隆抗體可用于后續(xù)的RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)等實(shí)驗(yàn),以及西方蜜蜂miRNA與靶基因的互作及miRNA的調(diào)控功能及機(jī)制研究。另外,鑒于西方蜜蜂和東方蜜蜂AGO1蛋白同源性高,本研究獲得的AmAGO1多克隆抗體有望用于東方蜜蜂的相關(guān)研究。