稅良勇, 趙忠祎, 馮 印, 謝曉倩, 袁曉琴, 毛新芳, 劉忠淵

(四川輕化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 自貢 643000)

羧酸酯酶(carboxlesterase, CarE,EC3.1.1.1)屬于具有α /β水解酶活性的絲氨酸水解酶(Lietal., 2022)家族成員,是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的多功能水解酶,可以水解大量內(nèi)源性或外源性含有酯鍵、硫酯鍵和酰胺鍵化合物(Johanetal., 2021)。其一級結(jié)構(gòu)在進化上具有高度的保守性,其活性中心(Ser/Cys-Asp/Glu-His)殘基形成高度保守的催化三聯(lián)體;催化三聯(lián)體在肽鏈的一級結(jié)構(gòu)式不連續(xù),在肽鏈三級結(jié)構(gòu)中互相關(guān)聯(lián)成為活性中心;其次,親核活性中心的Ser/Cys位于高度保守的五肽氨基酸序列(G-X-S/C-X-G)中(陸巧穎, 2021)。羧酸酯酶的功能具有多樣性,在哺乳動物體內(nèi)參與酯質(zhì)的穩(wěn)態(tài)平衡、含酯類藥物和環(huán)境毒物的代謝(Márciaetal., 2016),同時參與生長代謝的調(diào)節(jié)和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞(Wangetal., 2018);在微生物體內(nèi)參與細胞內(nèi)酯的合成(Johanetal., 2021);在昆蟲體內(nèi),羧酸酯酶不僅參與生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝及環(huán)境適應(yīng)(Fengetal., 2018),還與昆蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性密切相關(guān)。根據(jù)功能和氨基酸序列的相似性,昆蟲羧酸酯酶分為生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝以及環(huán)境適應(yīng)性3類,包括α-酯酶、β-酯酶、幼年激素酯酶、外皮酯酶、乙酰膽堿酯酶、神經(jīng)遞質(zhì)、突觸受體、膠質(zhì)肌動蛋白和谷氨酸肌動蛋白9個分支(Ransonetal., 2002)。在昆蟲羧酸酯酶的9個分支中,α-酯酶、β-酯酶和乙酰膽堿酯酶與對殺蟲劑抗性有關(guān)(Coppinetal., 2012)。近20年來,研究人員從昆蟲體內(nèi)陸續(xù)分離了多種羧酸酯酶,其結(jié)構(gòu)和功能上的相似性表明羧酸酯酶與農(nóng)藥的抗性及解毒機制密切相關(guān),例如白微微等(2018)在不同劑量的吡蟲啉刺激下,麥長管蚜Sitobionavenae羧酸酯酶基因SaEST3 mRNA的相對表達量均上調(diào);尹菲等(2020)研究發(fā)現(xiàn)飛蝗Locustamigratoria羧酸酯酶基因LmCesA1和LmCesA2在馬拉硫磷的刺激下的表達量成倍地上調(diào),比農(nóng)藥處理前的抗性提高了1.5倍,羧酸酯酶基因LmCesA2可能參與飛蝗對馬拉硫磷的代謝解毒過程;Kai等(2022)通過RNA干擾降低CarE基因表達,顯著增加了褐飛虱Nilaparvatalugens對毒死蜱的抗性。此外,多種農(nóng)藥的刺激下,昆蟲體內(nèi)單一的羧酸酯酶基因表達并產(chǎn)生對多種殺蟲劑的抗藥性,例如小菜蛾P(guān)lutellaxylostella體內(nèi)的羧酸酯酶基因PxaE14可對6種殺蟲劑(β-氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱、氰戊菊酯、馬拉硫磷和辛硫磷)產(chǎn)生抗性,羧酸酯酶基因PxE8可對兩種殺蟲劑(α-氯氰氰菊酯和馬拉對硫磷)產(chǎn)生抗性(Lietal., 2021)。多種證據(jù)表明羧酸酯酶與昆蟲抗藥性產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)。

茶尺蠖Ectropisobliqua是主要的茶園害蟲之一,其繁殖能力及幼蟲活動能力較強,交配和傳代時間較短,短期內(nèi)暴發(fā)會對茶葉生產(chǎn)造成危害(張帥琪等, 2020)。近20年來,農(nóng)藥的過度使用及昆蟲抗性產(chǎn)生一度成為困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境治理的問題(Hüesker and Lepenies, 2022)。一方面,昆蟲的抗藥性產(chǎn)生會加劇害蟲對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的破壞;另一方面,加大對害蟲的防護可能會促使農(nóng)藥的過度使用和濫用,進而加劇環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留問題。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)茶尺蠖對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性(Pengetal., 2022)可能與羧酸酯酶CarE592、乙酰膽堿酯酶EoPPase672相關(guān)。通過克隆得到茶尺蠖羧酸酯酶基因EoCarE592(GenBank登錄號: ON110139),其核苷酸序列長度1 626 bp,編碼541個氨基酸。本研究構(gòu)建了重組表達載體pET-32a-EoCarE592,并進行原核表達和包涵體蛋白變復(fù)性,通過氣相色譜檢測重組EoCarE592對農(nóng)藥的降解研究,為進一步研究羧酸酯酶參與茶尺蠖體內(nèi)農(nóng)藥解毒過程奠定基礎(chǔ),同時為解決農(nóng)藥過度使用及農(nóng)藥殘留問題提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

氯化鈉、氫氧化鈉、丙酮和冰乙酸均購買自重慶川東化工有限公司;胰蛋白胨、酵母膏、氨芐青霉素鈉、異丙基β-D-硫代半乳糖苷、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、Triton X-100、乙二胺四乙酸、尿素、丙三醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇400、GSH、BSA均購自上海生工生物工程有限公司;高效氯氟氰菊酯、異丙維和甲基對硫磷(色譜純)均購自上海泰坦科技股份有限公司,其他未標(biāo)明試劑均為國產(chǎn)分析純。

7890A氣相色譜儀(配有FID檢測器)購買自安捷倫科技有限公司;智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9160B)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;超純水制造系統(tǒng)(UPH-Ⅱ-20T)購自四川優(yōu)普超純科技有限公司;恒溫培養(yǎng)搖床(HZ150L)購自上海精勝科學(xué)儀器有限公司;電泳系統(tǒng)(Trans-blot SD Cell、SDS-PAGE)購自Bio-Rad;超聲波實驗設(shè)備(JY92-IIDN)購自寧波新芝生物科技股份有限公司;醫(yī)用冷凍離心機(TGL-16)購自四川蜀科儀器有限公司;臺式離心機(TGL-16M)購自上海盧湘儀; 全波長酶標(biāo)儀(ReadMax1200)購自上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

基于實驗室茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得EoCarE592基因的cDNA序列和氨基酸序列,登錄NCBI數(shù)據(jù)庫下載其他昆蟲的羧酸酯酶氨基酸序列,利用在線軟件Espript (https:∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)進行多序列比對。利用MEGA 6軟件的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建茶尺蠖EoCarE592與其他鱗翅目昆蟲的羧酸酯酶系統(tǒng)發(fā)育樹。利用在線軟件Swiss-model (https:∥swissmodel.expasy.org/)進行二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與同源建模。

1.3 原核表達

將實驗室保存的重組表達載體pET-32a-EoCarE592載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliBL21感受態(tài)細胞中,并接種到含有100 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中,37 ℃下過夜培養(yǎng);挑選陽性克隆菌種在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上180 r/min 37 ℃培養(yǎng)4 h;加入IPTG至終濃度60 μmol/L誘導(dǎo)表達4 h,并以不添加IPTG的陽性菌作為空白對照組;8 000 r/min 4 ℃離心15 min,收集上清液和細菌沉淀;細菌沉淀用pH 8.0 Tris-HCl 重懸洗滌兩次,8 000 r/min 4 ℃離心15 min,超聲破碎(功率200 W、超5 s停10 s),收集上清液和破碎后沉淀,SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。

1.4 包涵體蛋白純化與變復(fù)性

將超聲破碎后的細菌沉淀用包涵體洗滌液(50 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 8.0)洗滌2次,再用含8 mol/L尿素的Tris-HCl緩沖溶液溶解包涵體;BCA法測定蛋白濃度,并將包涵體蛋白加入到鎳柱中,4 ℃震蕩2 h,用含有8 mol/L尿素不同濃度的咪唑緩沖溶液(20, 50, 100, 250和500 mmol/L)進行洗脫,并收集洗脫液,將洗脫后的蛋白稀釋到100 mg/L;用含有6, 5, 4, 3, 2, 1和0 mol/L尿素的蛋白復(fù)性緩沖溶液(50 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽, 1 mmol/L還原性谷胱甘肽, 5%甘油, 10 mmol/L甘氨酸和1%精氨酸)進行梯度透析復(fù)性(每個濃度透析4 h);透析后的重組蛋白用超濾膜濃縮。

1.5 Western-blot檢測目的蛋白EoCarE592

SDS-PAGE檢測1.4節(jié)復(fù)性后的蛋白。用含1%脫脂奶粉的TBST按1∶5 000(v/v)稀釋一抗(Anti 6×His-Tag 小鼠多克隆抗體), 4 ℃過夜孵育,洗膜5次;1∶50 000 (v/v)稀釋二抗(HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG),37 ℃孵育2 h,洗膜5次;ECL(Ultrasensitive ECL Chemiluminscence Kit)染色液避光染色1 min, 曝光15 s觀察顯色情況。

1.6 EoCarE592酶活性測定

固藍B鹽比色法測定EoCarE592的酶活性(周帥, 2013)。1 mol/L 1-萘酚(無水乙醇溶)稀釋為0, 60, 120, 240, 360, 480和600 mmol/L的梯度溶液;取25 μL 1-萘酚梯度溶液至2.925 mL的pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中,再加入50 μL氯化四氮鄰二甲氧基苯胺(固藍B鹽),30 ℃避光水浴10 min測定OD600值, 每個濃度梯度重復(fù)3次。以O(shè)D600值和1-萘酚濃度分別作橫縱坐標(biāo),作1-萘酚濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線;酶活性單位定義:單位時間內(nèi)催化產(chǎn)生1 μmol 1-萘酚所需酶量定義為1個酶活性單位:1 U=1 μmol/(mL·min)(周帥, 2013)。

參照1-萘酚濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法,添加100 μL復(fù)性后的重組EoCarE592,以100 μL 100 mg/L牛血清白蛋白(BSA)為空白對照,底物為25 μL 30 mmol/L 1-乙酸萘酯,30 ℃ 避光水浴10 min,測定OD600值,根據(jù)1-萘酚濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算1-萘酚的產(chǎn)量,平行重復(fù)3次。

1.7 溫度、pH對EoCarE592酶活性的影響測定

參照1.6節(jié)酶活測定方法,設(shè)置15, 20, 25, 30, 35, 40和50 ℃溫度梯度;每個溫度梯度在pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中避光水浴10 min。以添加100 μL 100 mg/L牛血清白蛋白為空白對照,紫外分光光度計測定梯度溫度下OD600值,每個梯度平行重復(fù)3次。根據(jù)1-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算1-萘酚的產(chǎn)量,以確定EoCarE592酶活性的最適溫度。

參照1.6節(jié)酶活測定方法,設(shè)置不同梯度的pH值(3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0和10.0)的緩沖溶液,每組pH梯度在30 ℃避光水浴10 min,紫外分光光度計測定不同pH梯度下OD600值,每個梯度平行重復(fù)3次根據(jù)1-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算1-萘酚的產(chǎn)量,以確定EoCarE592酶活性的最適pH。

1.8 金屬離子對EoCarE592酶活性影響的測定

以不含任何金屬離子的Tris-HCL溶液中(pH 8.0)作為緩沖體系,參照1.6節(jié)酶活性測定方法,向EoCarE592酶促反應(yīng)中添加Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Al3+和Fe3+。每種金屬離子的終濃度均5 mmol/L,在30 ℃下孵育 10 min,再加入底物1-乙酸萘酯反應(yīng)10 min,測定產(chǎn)物的量來計算其酶活性,空白對照組不添加任何金屬金屬離子,相同條件下測定1-萘酚的產(chǎn)量。每組實驗重復(fù)3次,以空白對照組為參考,評定不同金屬離子對酶促反應(yīng)的影響。

1.9 EoCarE592對高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的降解率測定

以丙酮為溶劑分別配制2 g/L的高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威標(biāo)準(zhǔn)品溶液,依次用丙酮稀釋母液為25, 50, 100, 200和400 mg/L的工作液,測定每個工作液中高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的氣相色譜峰面積,以峰面積對應(yīng)的濃度制作高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。

處理組在5.3 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液分別添加100 μL復(fù)性后的EoCarE592、 600 μL 2 g/L高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(終濃度200 mg/L);空白對照組添加100 μL 100 mg/L BSA,混勻后于30 ℃避光分別孵育0, 4, 8, 12, 16, 20和24 h;處理組反應(yīng)中加入12 mL 二氯甲烷震蕩萃取15 min;6 000 r/min離心15 min,吸取上層水相于另一離心管中加入12 mL 二氯甲烷二次震蕩萃取15 min;合并兩次萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑。加入6 mL 丙酮超聲溶解產(chǎn)物;氣相色譜檢測檢測處理組和對照組中高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的殘留量,依據(jù)高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算高效氯氟氰菊酯、甲基對硫磷和異丙威的殘留濃量,每組反應(yīng)重復(fù)3次。降解率(%)=(C0-C1)÷C0×100,C0為BSA對照組中農(nóng)藥濃度,C1為重組蛋白EoCarE592孵育后農(nóng)藥濃度。

在Matlab/Simulink中建立基于模糊控制器的機械臂拾取系統(tǒng)的仿真模型如圖3，圖4為機械臂拾取系統(tǒng)模型。

高效氯氟氰菊酯氣相色譜條件參考國標(biāo)《GB/T 20695-2021》,色譜柱: 30 m×0.250 mm×0.25 μm(型號Agilent 1909I1-433,HP-5)進樣量1 μL,無分流比,載氣(N2)2.0 mL/min,氫氣60 mL/min,空氣300 mL/min,氣化室溫度280 ℃,柱溫:230 ℃恒溫保持14 min,FID檢測器溫度280 ℃。

甲基對硫磷氣相色譜條件:進樣量1 μL,無分流比,載氣(N2) 1.0 mL/min,氫氣30 mL/min,空氣300 mL/min,氣化室溫度280 ℃,柱溫:70 ℃保持1 min,以20 ℃/min升溫到180 ℃,再以50 ℃/min升溫至280 ℃保持3 min,FID檢測器溫度250 ℃。

異丙威氣相色譜條件:進樣量1 μL,無分流比,載氣(N2) 1.0 mL/min,氫氣30 mL/min,空氣300 mL/min,氣化室溫度280 ℃,柱溫:初始70 ℃保持1 min, 然后20 ℃/min升高至180 ℃,再以30 ℃/min到230 ℃保持1 min,FID檢測室溫度250 ℃。

1.10 數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPASS Statistic 27分析金屬離子對酶活性的影響,采用單因素方差分析和LSD多重分析比較差異性和顯著性, Origin 2018軟件用于作圖。

2 結(jié)果

2.1 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹

茶尺蠖EoCarE592的多序列對比如圖1所示,EoCarE592與蘋果卷葉蛾Ectropispostvittana的EpCarE(GenBank登錄號: 7MP4_H)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua的SeCarE(GenBank登錄號: CAH0692026.1)、家蠶Bombyxmori的BmCarE(GenBank登錄號: NP_001182393.1)、大豆尺夜蛾Chrysodeixisincludens的CiCarE(GenBank登錄號: CAH0585492.1)具有高度的保守性, 羧酸酯酶家族的催化三聯(lián)體活性中心如圖中黑色方框所示, 為Ser(183)-Glu(313)-His(436),親核活性中心的Ser所在的五肽氨基酸序列(G-C-S-A-G)如圖藍色方框所示。茶尺蠖羧酸酯酶EoCarE592與鱗翅目昆蟲羧酸酯酶在進化上高度保守,具有α/β水解酶超家族成員的催化三聯(lián)體活性中心和保守的五肽序列。

登錄NCBI數(shù)據(jù)庫對茶尺蠖EoCarE592的氨基酸序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析,該蛋白屬于羧酸酯酶家族(GenBank登錄號: PFAM00135),其功能結(jié)構(gòu)域位于第102-189位氨基酸, 為α/β水解酶超家族成員(GenBank登錄號: PFAM07859);具有絲氨酸、谷氨酸天冬氨酸或組氨酸的催化三聯(lián)體特征。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,茶尺蠖EoCarE592與粉紋夜蛾、大豆尺夜蛾CarE親緣關(guān)系最近,與鱗翅目昆蟲CarE歸為一個分支(圖2)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的茶尺蠖EoCarE592 和其他物種CarE的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 重組EoCarE592的表達

如圖3(A)所示,得到表達、融合蛋白EoCarE592共有644個氨基酸,相對分子質(zhì)量78 kD、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后的蛋白在78 kD左右出現(xiàn)表達量較高的條帶(圖3: A, 泳道3),與EoCarE592理論分子量大小相符,重組EoCarE592在細胞內(nèi)以包涵體蛋白形式存在(圖3: A, 泳道4);Ni柱親和層析結(jié)果如圖3(B)所示,最適洗脫咪唑濃度為250 mmol/L(圖3: B,泳道10),Western blot檢測結(jié)果(圖3: C)表明重組EoCarE592正確表達。復(fù)性后的重組EoCarE592采用BCA法進行定量,根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出復(fù)性后的蛋白濃度為0.0917 mg/mL,超濾濃縮后的重組EoCarE592蛋白含量0.212 mg/mL。

圖3 重組EoCarE592表達(A)和純化(B) SDS-PAGE及Western blot檢測(C)

2.3 重組EoCarE592的酶活性

圖4 溫度(A)、pH(B)及金屬離子(C)對重組EoCarE592酶比活力的影響

與空白對照組(無任何金屬離子孵育后的重組EoCarE592酶活性)相比,Mg2+和K+對重組EoCarE592的酶活性具有促進作用,其中添加了Mg2+的相對活性提高了33%左右,Ca2+, Li+, Na+, Ni2+, Cd2+, Zn2+, Fe3+, Fe2+, Al3+和Cu2+對重組EoCarE592的酶活性具有明顯的抑制作用(圖4: C)。

2.4 重組EoCarE592對3種農(nóng)藥的降解率

如圖5所示,與BSA處理的空白對照相比,3種農(nóng)藥與重組EoCarE592孵育24 h后的殘留量分別為35.28, 27.16和38.00 mg/L,重組EoCarE592對高效氯氟氰菊酯、 甲基對硫磷和異丙威具有降解作用, 且24 h內(nèi)對3種農(nóng)藥的降解率分別為81.30%, 83.94%和79.83%。

圖5 重組EoCarE592對高效氯氟氰菊酯(A)、甲基對硫磷(B)和異丙威(C)的24 h內(nèi)降解曲線

3 討論

羧酸酯酶是生物體內(nèi)重要的多功能水解酶之一,不僅與昆蟲生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝和環(huán)境適應(yīng)密切相關(guān),還與農(nóng)業(yè)害蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性密切相關(guān)(Wangetal., 2020)。由于羧酸酯酶在昆蟲體內(nèi)參與化學(xué)農(nóng)藥試劑的代謝和和隔離作用,其被認為是一種昆蟲農(nóng)藥解毒劑,能夠良好地消除農(nóng)藥對昆蟲產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和殺傷作用(Zhang, 2013)與細胞色素P450(Lu, 2021)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Vandenholeetal., 2021)并稱昆蟲的三大解毒基因(Amezianetal., 2021)。因此,羧酸酯酶在農(nóng)業(yè)害蟲防治和昆蟲抗藥性機理方面越來越受到重視和關(guān)注。

本研究前期從菊酯類殺蟲劑刺激茶尺蠖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到羧酸酯酶基因片段(尹恒等, 2022),該基因片段全長1 626 bp,共編碼644個氨基酸片段。通過生物信息學(xué)分析表明,茶尺蠖EoCarE592與其他20中鱗翅目昆蟲羧酸酯酶有較高的同源性,其中與斜翅科昆蟲粉紋夜蛾、大豆尺夜蛾羧酸酯酶親緣關(guān)系最近(圖2);多序列比對結(jié)果表明,茶尺蠖羧酸酯酶EoCarE592與蘋果卷葉蛾、大豆尺夜蛾、家蠶和甜菜夜蛾的氨基酸序列具有高度的保守性(圖1),其α/β水解超基因家族的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)和保守的五肽序列完全一致,分別為Ser(183)-Glu(313)-His(436)和G-C-S-A-G,二級結(jié)構(gòu)分析表明(圖1),茶尺蠖羧酸酯酶EoCarE592有17個α螺旋、16個β折疊,其余為無規(guī)則卷曲,保守的氨基酸殘基貫穿整個蛋白序列。

大腸桿菌異源表達羧酸酯酶EoCarE592為無活性的包涵體蛋白,通常情況下原核表達蛋白速率過快,蛋白質(zhì)二硫鍵不能正確的的折疊。異源表達的EoCarE592可以通過8～0 mol/L的尿素變復(fù)性,復(fù)性后的蛋白酶活性為29.8 U。其在15～50 ℃內(nèi)都具有一定的活性,最適溫度為30 ℃左右(圖4: A),在pH小于6.0或大于9.0時活性降低。最適pH在7.0～8.0左右(圖4: B)。Mg2+能夠顯著提升EoCarE592酶活性,推測其為酶的活性中心或者啟動劑,而Li+, Ni2+, Cd2+, Zn2+, Fe3+, Fe2+, Al3+, Cu2+對重組EoCarE592的酶活具有明顯的抑制作用(圖5: B)。

已有文獻報道,羧酸酯酶作用于氨基甲酸酯類,擬除蟲菊酯和其他含酯類農(nóng)藥的酯鍵,使其發(fā)生水解反應(yīng)進而分裂為相應(yīng)的羧酸和醇(Yan, 2014)。EoCarE592在30 ℃、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中能降解大部分始濃度為200 mg/L高效氯氟氰菊酯,降解率達到81.30%(圖5: A)。Ding等(2022)的研究表明,羧酸酯酶CarCB2使得高效氯氟氰菊酯的酯鍵斷裂,生成產(chǎn)物主要為3-苯氧基苯甲醛,且3-苯氧基苯甲醛的色譜峰出現(xiàn)在未降解的高效氯氟氰菊酯色譜峰之后,與本研究的結(jié)果一致。Li等(2020)異源表達棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的羧酸酶基因CarE001A和CarE001H均能夠水解β-氯氰菊酯(β-cypermethrin),高效氯氟氰菊酯和毒死蜱(chlorpyrifos),但是對甲基對硫磷沒有降解作用。這種底物特異性可能與羧酸酯酶的催化三聯(lián)體活性中心的“?；Y(jié)合袋”相關(guān)(Oakeshottetal., 1999),也有可能與農(nóng)藥和羧酸酯酶催化三聯(lián)體的結(jié)合程度相關(guān)(Lietal., 2021)。另外,農(nóng)藥化學(xué)結(jié)構(gòu)不同或者空間位阻不同也可能導(dǎo)致酶的底物轉(zhuǎn)一性不同(Baietal., 2019)。

羧酸酯酶是昆蟲抵御各種殺蟲劑等外源物質(zhì)的重要物質(zhì)之一(Wheelocketal., 2005),昆蟲通過大量表達羧酸酯酶參與有機磷類農(nóng)藥的解毒,羧酸酯酶與有機磷農(nóng)藥的結(jié)合,從而屏蔽有機磷農(nóng)藥的毒害作用(Farnsworthetal., 2010);或者通過水解作用分解有機磷類農(nóng)藥進而參與農(nóng)藥的解毒(Cuietal., 2011)。EoCarE592表現(xiàn)出對有機磷類農(nóng)藥甲基對硫磷(圖5: B),在24 h內(nèi)降解率達到了83.94%,表明EoCarE592對甲基對硫磷存在降解作用而非屏蔽作用(Chevillonetal., 1999)。這與Sanchez-Hernandez等(2019)研究中甲基對硫磷抑制蚯蚓羧酸酯酶的活性作用不同。周帥(2014)異源表達小鼠羧酸酯酶,研究發(fā)現(xiàn)該酶對甲基對硫磷和聯(lián)苯菊酯都具有顯著的降解作用。推測EoCarE592可能作用于甲基對硫磷的磷酯鍵。研究結(jié)果為茶尺蠖解毒機理的研究提供新的思路與依據(jù)。