周斌 萬少兵 王瑛 余平 典萬康 周瑩 周琴

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）指由各種直接或間接因素造成肺泡上皮細胞及彌漫性毛細血管內皮損傷，臨床表現(xiàn)為低氧血癥及呼吸窘迫，嚴重時可導致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1]。ARDS 的發(fā)病率高達40%[2]，盡管如今醫(yī)療水平不斷提高，但針對ARDS 的有效治療手段仍然十分缺乏。因此，探究ALI/ARDS 的發(fā)病機制和治療手段是肺部疾病的研究熱點之一。ALI 發(fā)病時肺部發(fā)生過度炎癥反應，炎性因子被大量分泌，與效應細胞相互作用，使肺部促炎與抗炎失衡，導致ALI 的持續(xù)發(fā)展[3]。IL-6 在免疫、炎癥、造血、腫瘤等方面具有重要作用，其通過酪氨酸蛋白激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信號傳導與轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3 信號通路轉導細胞信號[4]。近年來，JAK2/STAT3 信號通路被報道參與多種疾病過程，且與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關[5]。有研究顯示IL-6 可能是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導激活STAT 過程中的關鍵因子[6]。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)細胞因子信號轉導抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）通過調控JAK2/STAT3 信號通路改善ALI，且JAK2/STAT3 信號通路通過調控Th17/調節(jié)性T 細胞平衡從而調控ALI[7-8]。但IL-6 能否通過調控JAK2/STAT3 信號通路改善ALI 尚未明確。本研究通過LPS 誘導人肺癌細胞A549 建立ALI 細胞模型，探討IL-6 通過調控JAK2/STAT3 信號通路減輕ALI 的機制。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和儀器 人肺癌細胞A549 來自中國科學院上海細胞庫（貨號：TCHu150）；F12K 完全培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，貨號：21127-022）；PBS（中國Solarbio 公司，貨號：P1010）；減血清培養(yǎng)基Opti-MEM（美國Gibco 公司，貨號：31985-062）；去內毒素質粒提取試劑盒（美國OMEGA，貨號：D6950-02）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen 公司，貨號：11668-027）；Trizol（美國Ambion 公司，貨號：15596026）；細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8, CCK-8）（中國Solarbio 公司，貨號：CA1210）；LPS（德國Sigma 公司，貨號：L2880）；AnnexinV-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，貨號：559763）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（中國Beyotime 公司，貨號：S0063）；TNF-α ELISA檢測試劑盒（中國Bioswamp 公司，貨號：HM10205）；IL-6 ELISA 檢測試劑盒（中國Bioswamp 公司，貨號：HM10001）；IL-1β ELISA 檢測試劑盒（中國Bioswamp公司，貨號：HM10206）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（中國南京建成公司，貨號：A003-1-1）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（中國南京建成公司，貨號：A001-3-2）；RIPA（強）組織細胞快速裂解液（中國Solarbio公司，貨號：R0010）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國Solarbio 公司，貨號：PC0020）；JAK2、STAT3、磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）、磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）、GAPDH 一抗及羊抗兔二抗（中國貝茵萊公司，貨號：PAB47912、PAB46077、ab32101、ab32143、PAB36269、SAB43714）。DMIL LED 倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；T100-Thermal Cycler PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司，貨號：311）；Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；CFX-Connect 96 熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；Nano-300 超微量分光光度計（杭州奧盛公司）；AMR-100 酶標儀（杭州奧盛公司）；NovoCyte流式細胞儀（中國艾森公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及ALI 細胞模型的建立 取A549 細胞接種于F12K 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)并進行傳代培養(yǎng)。取培養(yǎng)的A549 細胞5×106/mL 接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在F12K 完全培養(yǎng)基中加入10 μg/mL LPS，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即建立ALI 細胞模型。

1.2.2 IL-6 基因過表達及干擾質粒構建 設計合成IL-6 目的基因序列和3 個IL-6 干擾序列即IL-6 shRNA1、IL-6 shRNA2 和IL-6 shRNA3，將IL-6 目的基因序列和IL-6 干擾序列酶切線性化，將雙酶切后目的片段與載體進行連接。轉化后進行菌落PCR 鑒定并測序，用去內毒素質粒提取試劑盒提取陽性菌落質粒，質粒用于后續(xù)轉染實驗。

1.2.3 細胞轉染 IL-6 過表達實驗分組：對照組、空載組、IL-6 過表達質粒。IL-6 干擾實驗分組：對照組、IL-6 shRNA1 組、IL-6 shRNA2 組、IL-6 shRNA3 組和陰性對照組。用減血清培養(yǎng)基Opti-MEM 稀釋各組質粒DNA，和減血清培養(yǎng)基Opti-MEM 稀釋的Lipofectamine 2000 混勻，靜置20 min。將500 μL 復合物加到準備好的含有細胞的培養(yǎng)板孔中，來回輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板。將細胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，轉染4 h 后換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。收集細胞，Trizol 法提取總RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA 為模板，進行qRTPCR 擴增。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，用2-ΔΔCt法計算IL-6 相對表達水平，并比較3 個IL-6 干擾序列的干擾效率，篩選最佳干擾效率進行后續(xù)實驗。

1.2.4 實驗分組及干預 將處于對數(shù)生長期的細胞分為空白對照組、LPS 組、LPS+IL-6 過表達組、LPS+IL-6干擾組和LPS+空載組。空白對照組細胞正常培養(yǎng)48 h；LPS 組LPS 處理細胞24 h 后繼續(xù)培養(yǎng)24 h；LPS+IL-6過表達組LPS 處理細胞24 h 后，IL-6 過表達質粒轉染細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h；LPS+IL-6 干擾組LPS 處理細胞24 h 后，IL-6 干擾質粒轉染細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h；LPS+空載組LPS 處理細胞24 h 后，空載質粒轉染細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.5 細胞增殖率檢測 采用CCK-8 法。收集細胞，調整細胞懸液濃度，分于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。按照不同分組處理細胞。取出細胞培養(yǎng)板，向每孔加入CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用酶標儀測量各孔450 nm 波長處的吸光度（optical density，OD）值。以對照組細胞增殖率為100%，計算各組細胞增殖率。細胞增殖率=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.2.6 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。收集各組細胞，PBS 重懸細胞，用AnnexinV-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒檢測，即加入Annexin V-PE 和7-AAD，輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min；加入PBS，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡，NovoExpress 分析軟件分析并計算細胞凋亡率。

1.2.7 細胞氧化應激因子ROS、MDA、SOD 水平檢測采用試劑盒法。使用ROS 檢測試劑盒檢測ROS 水平，即用無血清培養(yǎng)液稀釋好的DHE 懸浮細胞并使細胞濃度為1×107/mL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。洗滌并收集各組細胞，上流式細胞儀檢測ROS，NovoCyte分析軟件進行分析。嚴格按照MDA 檢測試劑盒和SOD 檢測試劑盒說明書檢測MDA 和SOD 水平。

1.2.8 細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平檢測 采用ELISA 法。收集各組細胞，1 000 g 室溫離心15 min，取上清液。嚴格按照ELISA 檢測試劑盒說明書測定細胞上清液中各炎癥因子水平。

1.2.9 細胞中IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。根據(jù)Trizol 法提取總RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA 為模板，進行qRT-PCR 擴增。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算IL-6、JAK2 和STAT3 mRNA 相對表達水平。引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.10 細胞中JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。從培養(yǎng)箱中取出各組細胞，吸去培養(yǎng)液，適量預冷的1×PBS 洗滌2次。吸去PBS，按照每1×106個細胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液200 μL，4 ℃充分裂解細胞，將細胞刮入1.5 mL EP 管中，在4 ℃12 000 g 離心10 min，取上清液，使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE 膠，上樣電泳并轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜，一抗與膜室溫孵育1 h。PBS 洗滌干凈后加入二抗，繼續(xù)室溫孵育1 h。PBS 洗滌后，顯色成影。通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Duncan 檢驗。本實驗重復3 次。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-6 過表達及干擾轉染效率驗證 與對照組和空載組比較，過表達IL-6 組IL-6 mRNA 表達水平升高（均P＜0.05），表明IL-6 過表達質粒轉染成功，見圖1A。與對照組和陰性對照組比較，IL-6 干擾組即IL-6 shRNA1 組、IL-6 shRNA2 組、IL-6 shRNA3 組IL-6 mRNA 表達水平均降低（均P＜0.05），表明IL-6 干擾質粒轉染成功，見圖1B。其中，3 條干擾質粒中shRNA1 干擾效率最高，故后續(xù)干擾試驗均選用shRNA1。

圖1 IL-6 過表達及干擾轉染效率驗證（A：IL-6 過表達；B：IL-6 干擾）

2.2 IL-6 過表達及干擾處理對細胞IL-6 mRNA 表達的影響 與空白對照組比較，LPS 組和LPS+空載組IL-6 mRNA 表達水平均上升（均P＜0.05）；與LPS 組和LPS+空載組，LPS+IL-6 過表達組IL-6 mRNA 表達水平上升，LPS+IL-6 干擾組IL-6 mRNA 表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 IL-6 過表達及干擾處理后細胞IL-6 mRNA 表達水平的比較

2.3 IL-6 過表達及干擾處理對細胞增殖的影響 與空白對照組，LPS 組和LPS+空載組細胞增殖率均下降（均P＜0.05）；與LPS 組和LPS+空載組比較，LPS+IL-6過表達組細胞增殖率下降，LPS+IL-6 干擾組細胞增殖率上升，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 IL-6 過表達及干擾處理后細胞增殖率的比較

2.4 IL-6 過表達及干擾處理對細胞凋亡的影響 與空白對照組，LPS 組和LPS+空載組細胞凋亡率均上升（均P＜0.05）；與LPS 組和LPS+空載組比較，LPS+IL-6 過表達組細胞凋亡率上升，LPS+IL-6 干擾組細胞凋亡率下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4（插頁）。

圖4 IL-6 過表達及干擾處理后細胞凋亡率的比較（A：各組細胞流式圖；B：各組細胞凋亡率的比較）

2.5 IL-6 過表達及干擾處理對細胞氧化應激因子ROS、MDA 和SOD 水平的影響 與空白對照組比較，LPS 組和LPS+空載組細胞ROS 和MDA 水平均上升，SOD 水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與LPS 組和LPS+空載組比較，LPS+IL-6 過表達組細胞ROS 和MDA 水平均上升，SOD 水平下降；LPS+IL-6 干擾組細胞ROS 和MDA 水平均下降，SOD水平上升，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖5。

圖5 IL-6 過表達及干擾處理后細胞氧化應激因子ROS、MDA 和SOD 水平的比較（A：各組細胞ROS 流式圖；B：各組細胞ROS 水平的比較；C：各組細胞MDA 水平的比較；D：各組細胞SOD 水平的比較）

2.6 IL-6 過表達及干擾處理對細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平的影響 與空白對照組比較，LPS 組和LPS+空載組細胞TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均上升（均P＜0.05）；與LPS 組和LPS+空載組比較，LPS+IL-6過表達組細胞TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均上升，LPS+IL-6 干擾組細胞TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖6。

圖6 IL-6 過表達及干擾處理后細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平的比較（A：各組細胞TNF-α 水平的比較；B：各組細胞IL-6的比較；C：各組細胞IL-1β 的比較）

2.7 IL-6 過表達及干擾處理對細胞JAK2、STAT3 mRNA 和蛋白表達水平的影響 與空白對照組比較，LPS 組和LPS+空載組細胞JAK2、STAT3 mRNA 及p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達水平均上升（均P＜0.05）；與LPS 組和LPS+空載組比較，LPS+IL-6 過表達組細胞JAK2、STAT3 mRNA 及p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達水平均上升，LPS+IL-6 干擾組細胞JAK2、STAT3 mRNA及p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。此外，各組間游離的JAK2、STAT3 蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖7-8。

圖7 IL-6 過表達及干擾處理后細胞JAK2、STAT3 mRNA 表達水平的比較（A：各組細胞JAK2 mRNA 表達水平的比較；B：各組細胞STAT3 mRNA 表達水平的比較）

圖8 IL-6 過表達及干擾處理后細胞JAK2、STAT3 蛋白表達水平的比較（A：各組細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達的電泳圖；B：各組細胞p-JAK2 蛋白表達水平的比較；C：各組細胞JAK2 蛋白表達水平的比較；D：各組細胞p-STAT3 蛋白表達水平的比較；E：各組細胞STAT3 蛋白表達水平的比較）

3 討論

臨床上多種疾病均可能引起ALI。ALI 的主要病理生理特征為肺容積減少、肺泡-毛細血管膜通透性增加、肺順應性降低等，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫、進行性低氧血癥[9]。ALI 的發(fā)病機制非常復雜，目前主要認為與氧化應激和炎癥反應有關，但尚無明確的治療措施[10]。IL 是由白細胞產生又在白細胞間起調節(jié)作用的細胞因子，目前已發(fā)現(xiàn)38 種IL 因子，功能復雜。其中IL-6 是一種多功能細胞因子，在免疫穩(wěn)態(tài)、造血、炎癥、發(fā)育和代謝中發(fā)揮重要作用[4]。研究表明，ALI 患者IL-6 蛋白表達水平高于健康者，且重度ALI 組患者IL-6 蛋白表達水平高于輕微-中度ALI 組患者[11]。IL-6 也可作為輸血所致ALI 的預測靶點之一[12]。本研究證明了，過表達IL-6 后，LPS 誘導的ALI 模型細胞增殖率下降，凋亡率上升，而干擾IL-6 則相反。結果表明IL-6 與ALI 關系密切，IL-6 低表達可對ALI 產生保護作用。

ROS 指泛含氧的化學物質，具有很高的化學反應活性。SOD 具有抗氧化作用，可清除對機體有害的超氧離子。MDA 是常見的膜脂過氧化指標。當組織、細胞中氧化應激增加時，ROS 和MDA 被大量產生，SOD則會減少。IL-6、TNF-α 和IL-1β 是重要的促炎細胞因子，在膿毒癥誘導的ALI 中加速其進展，形成肺水腫[13]。有研究表明，IL-6 與胰腺炎誘導的肺損傷中氧化應激和炎癥反應關系密切[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達IL-6 可以使LPS 誘導的ALI 模型細胞ROS 和MDA水平上升、SOD 水平下降，促炎因子IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平上升，而干擾IL-6 則出現(xiàn)相反現(xiàn)象，表明IL-6 可以減輕LPS 誘導的ALI 模型細胞中的氧化應激和炎癥反應。

IL-6 的進一步信號傳遞是由JAK/STAT 和絲裂原激活的蛋白激酶/磷脂酰肌醇-3-羥激酶兩種途徑進行的[15]。JAK/STAT 是一種由細胞因子刺激的信號通路，參與機體多種生理過程，在先天免疫和適應性免疫反應及抑制炎癥反應中起關鍵作用，是許多疾病的研究靶點之一[16]。JAK 可激活STAT 的磷酸化，進而調控下游基因的表達。研究表明，JAK2 參與細胞的信號轉導，而STAT3 與細胞生長、分化和凋亡有關[17]。JAK2/STAT3 信號通路參與免疫反應與炎癥因子的表達，可雙向調節(jié)以維持機體的免疫穩(wěn)定[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3 信號通路與呼吸系統(tǒng)疾病關系密切。SOCS3 可以通過抑制JAK2/STAT3 信號通路的激活，刺激抗炎因子、抑制炎性因子，保護細胞，抵抗大鼠嚴重急性胰腺炎引起的肺部炎癥[19]。Kim 等[20]發(fā)現(xiàn)，薄荷油可降低暴露于PM10 哮喘小鼠IL-6 的水平，且JAK2/STAT3 的磷酸化降低。研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁可通過抑制JAK2/STAT3 信號通路保護膿毒癥誘導的ALI[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達IL-6 后，LPS 誘導的ALI 模型細胞中JAK2 和STAT3 mRNA 表達水平均上升；在蛋白水平檢測中發(fā)現(xiàn)，JAK2 和STAT3 蛋白磷酸化水平上升。而干擾IL-6 后，發(fā)現(xiàn)細胞中JAK2 和STAT3 mRNA 表達水平和蛋白磷酸化水平均下降。這提示，IL-6 通過激活JAK2/STAT3 的磷酸化從而減輕LPS 誘導的ALI。

綜上所述，IL-6 可以通過JAK2/STAT3 信號通路降低LPS 誘導的ALI 模型細胞的氧化應激和炎癥反應，從而提高細胞的增殖率并降低細胞的凋亡率，減輕細胞ALI，對細胞產生保護作用。本研究完善了IL-6 保護ALI 的機制研究，為ALI 的治療提供了一個新的治療靶點。