鄭華淦,廖 冬,曲和之

(深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司,廣東 深圳 518129)

肝素是從豬小腸黏膜中提取的一種硫酸化糖胺聚糖類化合物,重均分子量為15 000～19 000[1],其分子結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜,至今無(wú)法人工合成。肝素具有迅速抗凝作用,臨床上主要用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病及血液透析抗凝,在非抗凝領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景[2]。低分子肝素是由普通肝素經(jīng)化學(xué)法或酶法裂解制得,與普通肝素相比,其抗Ⅹa因子與抗Ⅱa因子的效價(jià)比更高,能減少抗血栓過(guò)程中的出血副作用,因此得到更廣泛的應(yīng)用[3]。歐洲藥典(EP)根據(jù)不同工藝將低分子肝素分為那屈肝素鈣、達(dá)肝素鈉、依諾肝素鈉、帕肝素鈉和汀肝素鈉[4]。其中那屈肝素鈣的重均分子量為3 600～5 000,取代基有多種可能性,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 那屈肝素鈣的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of Nadroparin Calcium

那屈肝素鈣通過(guò)亞硝酸裂解得到,因此當(dāng)肝素糖鏈上R1為CO-CH3時(shí)可能引發(fā)一些副反應(yīng),仲胺的N與亞硝基形成亞硝胺雜質(zhì),含有N-NO基團(tuán)(圖2)。2021年2月,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)更新了《人用藥品中亞硝胺雜質(zhì)的控制》指南[5],指出在各類藥物中發(fā)現(xiàn)的亞硝胺雜質(zhì)有可能是人類致癌物,需對(duì)藥品中的潛在亞硝胺雜質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,并采取適當(dāng)?shù)拇胧┮詼p少或預(yù)防原料藥和藥物中亞硝胺雜質(zhì)的存在。我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心也指出,亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物,應(yīng)充分評(píng)估藥品中亞硝胺類雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn),并將亞硝胺類雜質(zhì)水平控制在安全限度以下[6]。EP10.0規(guī)定那屈肝素鈣中的N-NO含量應(yīng)≤0.25 μg·g-1。目前,未處理的那屈肝素鈣中N-NO含量遠(yuǎn)高于EP要求,因此需尋找一種簡(jiǎn)易有效的方法去除N-NO,使最終產(chǎn)品合格。為此,作者分別采用氧化法、加熱法、微波照射法、紫外照射法處理那屈肝素鈣粗品,比較N-NO去除效果,進(jìn)行工藝驗(yàn)證及方法學(xué)驗(yàn)證,為高效去除那屈肝素鈣中N-NO提供幫助。

圖2 生成亞硝胺的典型反應(yīng)式Fig.2 Representative reaction of nitrosamine formation

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

那屈肝素鈣粗品,深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司。

30%雙氧水,分析純,西隴科學(xué)股份有限公司;鹽酸、氫氧化鈉,藥用級(jí),湖南爾康制藥公司;乙醇,藥用級(jí),安徽安特食品公司。

TEA-810型熱能分析儀,英國(guó)Ellutia公司;HJ-3型恒溫磁力攪拌器,常州國(guó)華電器有限公司;AB204-S型電子天平、S20型 pH計(jì),梅特勒-托利多公司;BPZ-6063型真空干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Q6(P0)型微波爐,格蘭仕公司;E-6型紫外殺菌器,上海信晨水處理設(shè)備有限公司。

1.2 N-NO去除方法研究

取3批那屈肝素鈣粗品(編號(hào)1#、2#、3#),測(cè)定初始N-NO含量,樣品編號(hào):NQ-01-0、NQ-02-0、NQ-03-0;再分別開展氧化法、加熱法、微波照射法、紫外照射法去除N-NO實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 氧化法

稱取1#、2#那屈肝素鈣粗品各8 g,分別用48 mL水溶解后加入0.8 mL 30%雙氧水,室溫氧化24 h;加入200 mL乙醇,攪拌析出沉淀,過(guò)濾,真空干燥,得到約7.6 g樣品,樣品編號(hào):NQ-01-1、NQ-02-1。

1.2.2 加熱法

稱取1#、2#那屈肝素鈣粗品各8 g,分別用48 mL水溶解后用6 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.5左右,加熱至50 ℃,保持0.5 h;再用2 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10左右,加熱至75 ℃,保持0.5 h;降至室溫,用6 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.0;加入200 mL乙醇,攪拌析出沉淀,過(guò)濾,真空干燥,得到約7.8 g樣品,樣品編號(hào):NQ-01-2、NQ-02-2。

1.2.3 微波照射法

稱取1#、2#那屈肝素鈣粗品各8 g,分別用48 mL水溶解后微波照射5 min(分次,每次10～20 s后靜置,水冷后繼續(xù),避免過(guò)熱);加入200 mL乙醇,攪拌析出沉淀,過(guò)濾,真空干燥,得到約7.8 g樣品,樣品編號(hào):NQ-01-3、NQ-02-3。

1.2.4 紫外照射法

稱取1#、2#那屈肝素鈣粗品各200 g,分別用1 200 mL水溶解,利用蠕動(dòng)泵使料液流經(jīng)紫外殺菌器,打開循環(huán),并打開紫外燈(254 nm)照射10 min,關(guān)閉紫外燈,放料;分別取樣48 mL,加入200 mL乙醇,攪拌析出沉淀,過(guò)濾,真空干燥,得到約7.8 g樣品,樣品編號(hào):NQ-01-4、NQ-02-4。

1.2.5 紫外照射法進(jìn)一步研究

稱取3份(A組、B組、C組)3#那屈肝素鈣粗品各200 g,分別用1 200 mL水溶解,用蠕動(dòng)泵使料液流經(jīng)紫外殺菌器,打開循環(huán),并打開紫外燈(254 nm)照射;分別間隔不同時(shí)間,取樣48 mL,每組取樣5個(gè),共計(jì)15個(gè)樣品,分別加入200 mL乙醇,攪拌析出沉淀,過(guò)濾,真空干燥,得到約7.8 g樣品。

1.3 N-NO含量測(cè)定方法驗(yàn)證

參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部[7],對(duì)熱能分析儀[8]測(cè)定N-NO含量的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同方法對(duì)N-NO的去除效果比較(表1)

表1 不同方法對(duì)N-NO的去除效果比較Tab.1 Comparison of removal effects of N-NO in Natroparin Calcium by different methods

由表1可知,采用氧化法、加熱法、微波照射法均只能去除約50%的N-NO,而采用紫外照射法可以去除約95%的N-NO。因此,采用紫外照射法開展進(jìn)一步研究。

紫外照射不同時(shí)間的樣品編號(hào)及樣品中N-NO含量見(jiàn)表2,N-NO含量隨紫外照射時(shí)間的變化曲線見(jiàn)圖3。

表2 紫外照射不同時(shí)間的樣品編號(hào)及樣品中N-NO含量Tab.2 Number and N-NO content of samples irradiated different time

圖3 N-NO含量隨紫外照射時(shí)間的變化曲線Fig.3 Change curve of N-NO content with UV irradiation time

由表2可知,采用紫外照射法去除N-NO的速度先快后慢:照射0～10 min時(shí)N-NO含量下降較快,從14.25 μg·g-1降至0.83 μg·g-1(A組);照射10～20 min時(shí)N-NO含量下降緩慢,從0.96 μg·g-1降至0.23 μg·g-1(B組);照射20～90 min時(shí)N-NO含量幾乎不變,在0.21～0.23 μg·g-1之間(C組)。 由此可見(jiàn),紫外照射20 min能有效去除N-NO,N-NO含量符合EP要求(≤0.25 μg·g-1)。

紫外照射90 min后那屈肝素鈣的關(guān)鍵指標(biāo)見(jiàn)表3。

表3 紫外照射90 min后那屈肝素鈣的關(guān)鍵指標(biāo)Tab.3 Key indexes of Nardraparin Calcium after 90 min UV irradiation

由表3可知,紫外照射90 min對(duì)那屈肝素鈣無(wú)不良影響,關(guān)鍵指標(biāo)如分子量與分子量分布、抗Ⅹa因子效價(jià)等基本不變?？紤]到不同批次間可能存在的差異,將那屈肝素鈣生產(chǎn)工藝中的紫外照射時(shí)間定為20～60 min。

2.2 工藝驗(yàn)證

按紫外照射20～60 min的方法連續(xù)生產(chǎn)3批那屈肝素鈣產(chǎn)品,批號(hào)分別為20210902(照射20 min)、20210903(照射40 min)、20210904(照射60 min),測(cè)得N-NO含量分別為0.19 μg·g-1、0.20 μg·g-1、0.21 μg·g-1,表明3批那屈肝素鈣產(chǎn)品均符合EP要求。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

對(duì)測(cè)定N-NO含量的熱能分析儀法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 N-NO含量測(cè)定方法的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Methodology verification results for determination of N-NO content

由表4可知,該方法適用于那屈肝素鈣中N-NO含量的測(cè)定。

2.4 討論

綜上,采用氧化法、加熱法、微波照射法難以去除那屈肝素鈣產(chǎn)品中的N-NO,而紫外照射20～60 min可以有效去除,使那屈肝素鈣產(chǎn)品符合EP要求,且長(zhǎng)時(shí)間紫外照射對(duì)關(guān)鍵指標(biāo)無(wú)影響。研究表明,紫外照射法去除N-NO可能存在3條路徑,即光致水解、光致消去和光氧化[9]。光致水解需在弱酸條件下進(jìn)行,而本研究中紫外照射的溶液pH值接近中性,且采用單波長(zhǎng)254 nm照射,不易產(chǎn)生臭氧,因此本研究中N-NO的去除機(jī)理可能主要是光致消去,即高能量的輻射使N-NO基團(tuán)中的N-N鍵發(fā)生電子躍遷,共價(jià)鍵斷裂,形成仲胺和亞硝酸根,進(jìn)而達(dá)到去除N-NO的目的。此外,紫外照射下可能產(chǎn)生水合電子,對(duì)N-NO共價(jià)鍵斷裂也起到了促進(jìn)作用[10]。紫外照射法具有操作簡(jiǎn)便、對(duì)設(shè)備要求不高、對(duì)產(chǎn)品其它指標(biāo)無(wú)影響等優(yōu)點(diǎn),易于生產(chǎn)放大。紫外照射法還適用于亞硝酸裂解法生產(chǎn)的其它低分子肝素(如達(dá)肝素鈉)中N-NO的去除。

3 結(jié)論

分別采用氧化法、加熱法、微波照射法、紫外照射法處理那屈肝素鈣粗品,發(fā)現(xiàn)氧化法、加熱法、微波照射法去除N-NO效果不明顯(去除50%左右),而紫外照射20～60 min可以有效去除95%以上的N-NO,使那屈肝素鈣產(chǎn)品符合EP要求(N-NO含量≤0.25 μg·g-1)。長(zhǎng)時(shí)間紫外照射對(duì)產(chǎn)品其它關(guān)鍵指標(biāo)如分子量與分子量分布、效價(jià)無(wú)影響。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,熱能分析儀適用于那屈肝素鈣中N-NO含量的檢測(cè)。