侯小娟 楊 麗 丁 偉 劉 靜 吳 梅

兒童聽力殘疾多以重度和極重度感音神經(jīng)性聾居多[1]。耳聾病因中60%以上與遺傳因素有關(guān),在我國人群中耳聾基因變異主要來自于GJB2、SLC26A4、線粒體 12SrRNA及GJB3等4個(gè)熱點(diǎn)基因[2]。目前針對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)耳聾基因方面的檢測工作大部分集中在GJB2(35delG、176 _ 191del16、235delC、299_300delAT)、SLC26A4(2168A>G,IVS7-2A>G)、mt12SrRNA(1494C>T,1555A>G)、GJB3(538C>T) 4個(gè)基因的9個(gè)位點(diǎn)上,而在非綜合征型耳聾患者中這9個(gè)突變位點(diǎn)的檢出率在18%左右,大部分非綜合征型耳聾患者無法分析相關(guān)的耳聾致病基因,因此有必要增加耳聾基因突變位點(diǎn)的篩查,為更多的患者明確致病基因提供依據(jù)[3,4]。

對(duì)于重度和極重度耳聾患兒來說,遺傳因素的差異也會(huì)影響人工耳蝸植入后的康復(fù)療效,尤其在語前聾患者中, 基因突變是致聾的關(guān)鍵因素[5,6]。因此本研究將對(duì)重度及極重度非綜合征型耳聾患兒的耳聾基因檢測結(jié)果進(jìn)行分析,可以更好的評(píng)估術(shù)后康復(fù)效果,為指導(dǎo)康復(fù)提供依據(jù)。

資料與方法

1.研究對(duì)象:收集2017～2019年在筆者醫(yī)院耳鼻喉診療中心就診的重度及極重度非綜合征型耳聾患兒,對(duì)所有患者耳聾病史和用藥史等進(jìn)行詳細(xì)詢問并登記,排除耵聹栓塞、外傷、中耳疾病導(dǎo)致的聽力下降以及綜合征型耳聾,最終入選301例患兒。其中男性166例,女性135例,患兒平均年齡4.48±2.58歲。包含漢族51例,維吾爾族224例,哈薩克族20例,回族6例。遵循知情同意原則,收集所有患兒基本信息資料、聽力學(xué)結(jié)果及耳聾基因檢測結(jié)果。本研究通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核通過(倫理學(xué)審批號(hào):2017005)。

2.聽力測試方法:所有聽力檢測項(xiàng)目均在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。所有患者在檢測前均采用電耳鏡檢查鼓膜及外耳道,清除外耳道耵聹。嬰幼兒需自然入睡后或根據(jù)體重給予10%水合氯醛溶液口服入睡后方可進(jìn)行聽力學(xué)檢測。聲導(dǎo)抗測試采用Titan聽力測試平臺(tái),1歲以上患者采用226Hz探測音,1歲以下采用226Hz和 1000Hz探測音;耳聲發(fā)射采用CAPELLA診斷型耳聲發(fā)射儀,采用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emission,DPOAE);聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)采用瑞索Neuro-Audio腦干誘發(fā)電位儀,交替短聲刺激速率為21.1次/秒,分析時(shí)間為15ms,帶通濾波(50～3000)kHz,疊加1024次,刺激聲選用短聲和短純音(0.5kHz和1.0kHz),重復(fù)性佳的V波作為反應(yīng)閾值。短聲聽性腦干反應(yīng)(click-ABR)V波反應(yīng)閾值≤30dBnHL為正常診斷標(biāo)準(zhǔn)。短純音聽性腦干反應(yīng)(Tb-ABR) V波反應(yīng)閾值≤40dBnHL為正常診斷標(biāo)準(zhǔn)。若患兒兩耳聽力損失程度不同時(shí),以聽力損失較輕耳來計(jì)算。聽力損失分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(500、1000、2000、4000Hz平均值):輕度(26～40dBHL),中度(41～60dBHL),重度(61～80dBHL),極重度(≥81dBHL)。

3.耳聾基因檢測:采集非綜合征型耳聾患者的外周靜脈血2ml于EDTA 抗凝管中,利用基因組提取試劑盒從患者全血中提取基因組DNA(內(nèi)含線粒體DNA);以基因組DNA為模板利用所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物純化和sanger測序工作(測序儀為3130DX),根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行目標(biāo)位點(diǎn)多態(tài)性的分析。檢測位點(diǎn)包括GJB2:c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT;SLC26A4:c.281C>T、c.589G>A、c.IVS7-2A>G、c.1174A>T、c.1226 G>A、c.1229C>T、c.IVS15+5G>A、c.1975G>C、c.2027T>A、c.2162C>T、c.2168A>G;mt12S rRNA:c.1494C>T、c.1555A>G、c.1585A>G、c.1047A>G、c.1095T>C、c.960_961insC/961delT;OTOF:c.4023G>A、c.4819C>T;SLC17A8:c.824C>A。

結(jié) 果

對(duì)301例就診非綜合征型耳聾患兒進(jìn)行耳聾致病基因檢測,共計(jì)篩查出陽性突變患者80例,總檢出率為26.58%(80/301),其中純合突變35例,雜合突變29例,復(fù)合雜合突變12例,雙基因雜合突變4例。

GJB2基因總突變率為10.96%(37/301),主要突變形式為c.235delC,占突變?nèi)藬?shù)的37.50%(30/80),其中純合突變占突變?nèi)藬?shù)的20.00%(16/80),攜帶雜合突變占突變?nèi)藬?shù)的17.50%(14/80);其次突變率較高的為c.35delG,占突變?nèi)藬?shù)的8.75%(7/80),其中純合突變占突變?nèi)藬?shù)的5.00%(4/80),攜帶雜合突變占突變?nèi)藬?shù)的3.75%(3/80)SLC26A4基因總突變率為12.62%(38/301),主要突變形式為c.IVS7-2A,占突變?nèi)藬?shù)的26.25%(21/80), 其中純合突變占突變?nèi)藬?shù)的2.50%(2/80),攜帶雜合突變占突變?nèi)藬?shù)的23.75%(19/80)。其次突變率較高的為c.1174 A>T,占突變?nèi)藬?shù)的11.25%(9/80),其中純合突變占突變?nèi)藬?shù)的2.50%(2/80),攜帶雜合突變占突變?nèi)藬?shù)的8.75%(7/80)。

mt12SrRNA基因總突變率為4.32%(13/301)。主要突變形式為c.960_961insC/961delT,占突變?nèi)藬?shù)的7.50%(6/80), 其中純合突變占突變?nèi)藬?shù)的5.00%(4/80),攜帶雜合突變占突變?nèi)藬?shù)的2.50%(2/80)。同時(shí)還有c.1555A>G,占突變?nèi)藬?shù)的5.00%(4/80), 其中純合突變占突變?nèi)藬?shù)的3.75%(3/80),攜帶雜合突變占突變?nèi)藬?shù)的1.25%(1/80)。各突變位點(diǎn)在非綜合征型耳聾患者中的檢出情況如表1所示。

表1 301例重度及極重度非綜合征型耳聾患者中耳聾基因突變位點(diǎn)匯總表

4例雙基因雜合突變包括2例c.235delC/c.IVS7-2A>G突變;1例c.IVS7-2A>G/c.2027 T>A/c.960_961insC/961delT突變;1例c.235delC/c.1555A>G突變。1例c.1555A>G純合突變患兒同時(shí)攜帶c.1226 G>A和c.2027 T>A雜合突變, 1例c.1585A>G純合突變患兒同時(shí)攜帶c.2027 T>A雜合突變,1例c.960_961insC/961delT純合突變患兒同時(shí)攜帶c.IVS7-2A>G 雜合突變;1例c.960_961insC/961delT純合突變同時(shí)攜帶c.176_191del16雜合突變。未檢測出OTOF中的c.4023G>A、c.4819C>T突變和SLC17A8中的c.824C>A突變。

將GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA基因中各突變位點(diǎn)在漢族和維吾爾族中的分布情況進(jìn)行比較,詳見表2,漢族中突變位點(diǎn)的總檢出率極顯著高于維吾爾族(χ2=19.064、P<0.001)。在漢族和維吾爾族中突變頻次最高的是235delC和 IVS7-2A>G位點(diǎn),235delC位點(diǎn)(χ2=14.824、P<0.001)、IVS7-2A>G位點(diǎn)(χ2=11.225、P=0.003)和2168 A>G位點(diǎn)(P=0.006)在漢族中的分布極顯著高于維吾爾族,兩個(gè)民族其他突變位點(diǎn)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各突變位點(diǎn)在漢族和維吾爾族中的檢出情況[n(%)]

討 論

本研究通過對(duì)301例重度和極重度非綜合征型耳聾患兒進(jìn)行耳聾基因篩查,陽性率達(dá)26.58%,與前期本地區(qū)檢出情況比較檢出比率有所提高,與增加了耳聾基因篩查位點(diǎn)有關(guān)[3,4]。其中GJB2、SLC26A4為主要的突變基因,突變率分別為10.96%和12.62%。由于哈薩克族和回族患兒樣本量較少,筆者僅對(duì)漢族和維吾爾族患兒檢測結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比,漢族中突變位點(diǎn)的總檢出率極顯著高于維吾爾族,由于這兩個(gè)民族在常見耳聾基因的突變譜中差異很大,維吾爾族中可能存在其他突變熱點(diǎn),有待后續(xù)進(jìn)一步研究[3]。

GJB2基因編碼縫隙連接蛋白Cx26,并與相鄰細(xì)胞的縫隙連接蛋白組成通道,是電解質(zhì)、第二信使和代謝產(chǎn)物在細(xì)胞間轉(zhuǎn)換的重要通道[7]。該基因的突變,會(huì)影響縫隙連接蛋白通道的正常開閉,使K+回流入內(nèi)淋巴液的循環(huán)受阻,導(dǎo)致毛細(xì)胞的損傷,從而引起聽力損失,GJB2突變的患者聽力損失程度大多表現(xiàn)為重度或極重度耳聾[8]。GJB2相關(guān)性耳聾者的外毛細(xì)胞退化,血管紋發(fā)育不全,但螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量正常,因此CI術(shù)后能夠獲得滿意聽覺和言語康復(fù)效果具有理論基礎(chǔ)以及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),故明確的基因突變致聾對(duì)重度或極重度耳聾患耳的治療和CI術(shù)后康復(fù)有重要意義[9,10]。GJB2突變的主要形式為c.235delC和c.35delG。劉海燕等[11]在對(duì)天津市重度和極重度非綜合征型聾患兒常見耳聾基因篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)GJB2突變的主要形式為c.235delC和c.299-300deiT,這種差別可能與新疆維吾爾自治區(qū)為少數(shù)民族聚居區(qū)有關(guān)。楊曦等[3]研究顯示,新疆維吾爾自治區(qū)少數(shù)民族c.35delG的突變率較高。

SLC26A4 也是一種常見的遺傳性耳聾基因,與前庭水管綜合征和Pendred 綜合征密切相關(guān)[12]。SLC26A4基因的突變會(huì)導(dǎo)致其編碼的突變體蛋白不能到達(dá)細(xì)胞膜,而是停留在細(xì)胞內(nèi),使氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,破壞內(nèi)淋巴液平衡,引起液體儲(chǔ)留在內(nèi)淋巴囊以及骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致非綜合征型聾[13]。本次研究中SLC26A4突變的主要形式為c.IVS7-2A和c.1174A>T,但以雜合突變的形式居多,需進(jìn)一步進(jìn)行SLC26A4測序來明確致病原因。關(guān)于SLC26A4 突變與CI 植入術(shù)后療效相關(guān)性的研究結(jié)果也存在差異性[14,15]。后續(xù)本研究也將在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究。

mt12SrRNA基因是引起氨基糖苷類抗生素耳毒性和非綜合征性聾的熱點(diǎn)突變區(qū)域[16]。線粒體基因具有母系遺傳特點(diǎn),對(duì)突變攜帶者,指導(dǎo)其母系家庭成員安全用藥,可在一定程度上避免或減緩聾病發(fā)生或發(fā)展,逐步降低藥物性聾的發(fā)生率。mt12SrRNA主要突變形式為c.960_961insC/961delT和c.1555A>G,分別占突變?nèi)藬?shù)的7.50%和5.00%。線粒體12SrRNA c.A1555G 突變在耳聾患者人群中的檢出率有所降低,與耳毒性藥物使用量降低有關(guān)。

本研究中就診的患兒平均年齡為4.48±2.58歲,大部分為初次就診,而在嬰幼兒聽力損失診斷與干預(yù)指南中要求篩查未通過的嬰兒,應(yīng)該在出生后3個(gè)月內(nèi)接受全面的聽力學(xué)及醫(yī)學(xué)評(píng)估;確診為永久性聽力損失的嬰兒均應(yīng)該在6個(gè)月內(nèi)盡快接受干預(yù)服務(wù)[17]。本研究中患者的平均確診年齡與指南中要求有差距,因此提高聽力篩查未通過嬰幼兒的隨訪率、及早對(duì)聽力損失患兒進(jìn)行確診和早期干預(yù)是我們新生兒聽力篩查工作中的重點(diǎn)。同時(shí)開展耳聾基因篩查可以將患兒聽力診斷時(shí)間縮短,更利于早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)[18]。對(duì)于重度及極重度耳聾患兒進(jìn)行基因檢測還可以更好地評(píng)估CI術(shù)后康復(fù)效果,為指導(dǎo)耳聾治療及康復(fù)提供依據(jù)。