陳 浩 朱克祥

胰腺癌是預(yù)后最差的消化系統(tǒng)腫瘤,有著“癌癥之王”的稱號(hào)。胰腺癌雖發(fā)生率較低,但在全球癌癥相關(guān)病死率中排第4位,診斷晚、轉(zhuǎn)移早和放化療不敏感是導(dǎo)致其不良結(jié)局的主要原因。腫瘤細(xì)胞多來(lái)源于胰腺導(dǎo)管或腺泡,其中胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)占比超過(guò)90%,整體五年生存率不足10%[1]。早期胰腺癌首選手術(shù)切除后輔助化療,標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合化療FOLFIRINOX方案(5-氟尿嘧啶、亞葉酸鈣、伊立替康、奧沙利鉑)及吉西他濱聯(lián)合nab(白蛋白結(jié)合)-紫杉醇方案可以顯著提高胰腺癌患者生存率,但晚期患者受益有限?；熌退幨菍?dǎo)致晚期患者不良結(jié)局的重要原因,耐藥受腫瘤代謝、增殖和微環(huán)境等多方面因素調(diào)控[2]。本文就未折疊蛋白反應(yīng)如何參與胰腺癌細(xì)胞逃避化療殺傷為化療增敏提供思路。

未折疊蛋白反應(yīng)是細(xì)胞在代謝壓力、化學(xué)毒物等有害因素刺激下做出的應(yīng)激反應(yīng),此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),進(jìn)而啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及下游未折疊蛋白反應(yīng)通路[3]。未折疊蛋白反應(yīng)3條信號(hào)通路(圖1)有各自獨(dú)立的感受器,分別為需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6 (activating transcription factor 6,ATF6)和蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶 (protein kinase-like ER kinase, PERK),未應(yīng)激時(shí),這3種跨膜蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein,GRP78/BIP)結(jié)合處于失活狀態(tài);當(dāng)發(fā)生應(yīng)激時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白數(shù)量增加,觸發(fā)這3種蛋白感受器與GRP78解離,繼而級(jí)聯(lián)激活下游信號(hào)通路,緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝壓力[4]。

圖1 未折疊蛋白反應(yīng)激活3條信號(hào)通路示意圖

未折疊蛋白反應(yīng)能夠在一定程度上減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷,促進(jìn)細(xì)胞生存,化療后腫瘤細(xì)胞通常處于高代謝負(fù)荷狀態(tài),未折疊蛋白反應(yīng)為其提供了一條促生存通路。這一途徑主要通過(guò)上調(diào)分子伴侶表達(dá)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、增加異常折疊蛋白降解及減少蛋白翻譯合成實(shí)現(xiàn)[5]。因此,深入研究未折疊蛋白反應(yīng)與胰腺癌化療耐藥相關(guān)信號(hào)通路及機(jī)制具有重要臨床意義,有望為提高胰腺癌化療敏感度提供新思路。

一、未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路

1.需肌醇酶1通路:需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)為Ⅰ型跨膜蛋白,胞質(zhì)端具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和核糖核酸內(nèi)切酶活性。未折疊蛋白反應(yīng)激活時(shí),IRE1首先自身磷酸化形成二聚體,之后催化剪切X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)mRNA,產(chǎn)生活化XBP1s。XBP1s是一種轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)入細(xì)胞核后會(huì)啟動(dòng)一系列基因轉(zhuǎn)錄[6]。輕度應(yīng)激時(shí),其主要激活靶基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(ER-associated degradation, ERAD)和IRE1依賴的蛋白降解(regulated IRE1-dependent decay, RIDD)途徑,從轉(zhuǎn)錄、翻譯等多個(gè)層次緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),IERE1募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factors 2,TRAF2),進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)及其下游c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的激活,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7,8]。

2.活化轉(zhuǎn)錄因子6通路:活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)是堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)家族轉(zhuǎn)錄因子,未折疊蛋白反應(yīng)激活時(shí)轉(zhuǎn)移到高爾基體上切割活化,剪切作用由高爾基體膜蛋白酶S1P(site 1 protease) 和S2P(site 2 protease) 介導(dǎo),產(chǎn)生活性片段ATF6P50,ATF6P50隨后進(jìn)入細(xì)胞核與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件(ER stress response element, ERSE)相互作用,激活GRP78、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)、GRP94、鈣聯(lián)蛋白等下游分子伴侶基因,加強(qiáng)對(duì)未折疊蛋白處理能力。另外ATF6能協(xié)同IRE1增加X(jué)BP1轉(zhuǎn)錄,強(qiáng)化其降解未折疊蛋白能力。嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),ATF6能夠激活CHOP(C/EBP-homologous protein)凋亡通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9,10]。

3.蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶通路:蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase like endoplasmic reticulum kinase,PERK)同樣為Ⅰ型跨膜蛋白,胞質(zhì)端具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。未折疊蛋白反應(yīng)激活時(shí),自身磷酸化形成二聚體,同時(shí)磷酸化真核翻譯起始因子2α (eukaryotic initiation factor,eIF2α),磷酸化后eIF2α失活,后續(xù)mRNA翻譯停滯,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷。磷酸化PERK選擇性激活活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4),ATF4介導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)稱為整合應(yīng)激反應(yīng) (integrated stress response,ISR),激活靶基因GADD34和CHOP,STAT4/GADD34通路為一條負(fù)反饋通路,能夠去磷酸化P-EIF2α,導(dǎo)致整合應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)終止,細(xì)胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),ATF4激活CHOP凋亡通路,級(jí)聯(lián)啟動(dòng)caspase-12表達(dá)活化,細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)[11,12]。

二、未折疊蛋白反應(yīng)與胰腺癌耐藥

1.未折疊蛋白反應(yīng)與藥物外排:ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC)家族作為藥物外排泵廣泛參與多種腫瘤耐藥,48種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中有19種可以外排抗癌藥物,其中ABC亞家族B成員1(ABCB1)、ABC亞家族C成員1(ABCC1)、ABC亞家族G成員2(ABCG2)與多藥耐藥相關(guān),能非特異性外排蒽環(huán)類、紫杉烷類、長(zhǎng)春花生物堿類及酪氨酸激酶抑制劑等化療藥物,因此又被稱為多藥耐藥相關(guān)蛋白[13]。

Dauer等[14]研究發(fā)現(xiàn),與單用吉西他濱或紫杉醇處理胰腺癌細(xì)胞比較,聯(lián)用siGRP78(GRP78小干擾RNA)后兩種藥物外排百分比分別由27.1%和2.9%下降至0.56%和0.68%,即干擾GRP78表達(dá)能夠減少化療藥外排,此過(guò)程由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo),并由轉(zhuǎn)錄因子NRF2調(diào)控。NRF2為PERK下游靶基因,其激活后上調(diào)應(yīng)激反應(yīng)蛋白、藥物代謝酶和ABCB1編碼的多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance 1,MDR1)表達(dá),提升對(duì)化療藥物抵抗力[15]。因此PERK/NRF2/MDR1軸可能參與胰腺癌化療藥物外排,抑制該代謝通路有望提高胞內(nèi)藥物濃度,強(qiáng)化其殺傷作用。

2.未折疊蛋白反應(yīng)與自噬:化療藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)也能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,與凋亡必定導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡不同,自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定程度保護(hù)性作用[16]。一方面,其能夠幫助腫瘤細(xì)胞清除失活的細(xì)胞器和蛋白質(zhì), 減輕化療藥物的毒性損傷;另一方面,其會(huì)在應(yīng)激時(shí)觸發(fā)自噬依賴性細(xì)胞死亡, 從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。因此, 自噬在腫瘤化療耐藥中所起作用是雙向的[17,18]。

Thakur等[19]研究顯示,單用自噬抑制劑氯喹或STF-083010(IRE1通路抑制劑)處理胰腺癌細(xì)胞可抑制其自噬過(guò)程,但不足以延緩腫瘤生長(zhǎng),然而當(dāng)與吉西他濱聯(lián)合使用時(shí),氯喹和STF-083010具有附加的抗腫瘤療效。聯(lián)合用藥荷瘤小鼠腫瘤體積明顯小于單獨(dú)用藥小鼠,雙藥聯(lián)用毒性不良反應(yīng)沒(méi)有明顯增加,但動(dòng)物存活率更高。此外有研究表明,抑制乳腺癌細(xì)胞IRE1/JUK-beclin-1自噬通路能提高化療藥物療效。因而未折疊蛋白反應(yīng)IRE1/TRAF2/JUNK自噬通路抑制劑能在不增加毒性不良反應(yīng)情況下增強(qiáng)化療藥物殺傷作用,自噬抑制劑與化療藥物聯(lián)用有望改善胰腺癌耐藥[20]。

3.未折疊蛋白反應(yīng)與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化:研究表明,上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān),EMT腫瘤細(xì)胞喪失極性,與周圍細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞黏附力降低,胰腺癌出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的重要原因,而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在胰腺癌早期轉(zhuǎn)移中作用不可忽視,其同樣在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用,上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化作為胰腺癌最顯著和關(guān)鍵的特征之一,最終導(dǎo)致胰腺癌不良預(yù)后[21]。

吖啶黃(acriflavine,ACF)早期被當(dāng)作染料及抗菌藥使用,近年來(lái)研究顯示,其可作為抗癌劑和缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia Inducible Factor,HIF)抑制劑。Dekervel等[22]研究發(fā)現(xiàn),用TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1)或氯化鈷模擬嚴(yán)重缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,再用吖啶黃處理可抑制此轉(zhuǎn)化過(guò)程?；蚋患治鲲@示,吖啶黃阻斷了eIF2α磷酸化并減少ATF4翻譯,從而抑制未折疊蛋白反應(yīng)PERK/eIF2α/ATF4通路,即吖啶黃恢復(fù)了獲得耐藥胰腺癌細(xì)胞株的藥物敏感度。因此,靶向PERK/eIF2α/ATF4通路可以抑制胰腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,有望提高胰腺癌化療療效。

4.未折疊蛋白反應(yīng)與腫瘤干細(xì)胞:在導(dǎo)致腫瘤耐藥的諸多因素中,腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)的作用不容忽略。在胰腺癌中,CSCs僅占胰腺癌細(xì)胞總數(shù)的0.2%～0.8%,但目前認(rèn)為其廣泛參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥[23]。目前有研究顯示,胰腺導(dǎo)管腺癌中CSCs并非實(shí)體而是一種“狀態(tài)”,其具有獨(dú)特的侵襲、代謝、增殖特性,能夠自我更新并逃避化療,未針對(duì)CSCs池靶向殺傷可能是胰腺導(dǎo)管腺癌化療失效的部分原因,因此如何識(shí)別并清除CSCs將直接關(guān)系到胰腺導(dǎo)管腺癌化療效果[24]。

Nomura等[25]研究發(fā)現(xiàn),胰腺CSCs高表達(dá)CD133和GRP78,CD133能調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝以維持低氧化還原水平,使其處于藥物持續(xù)性耐受狀態(tài);GRP78與胰腺CSCs關(guān)聯(lián)機(jī)制尚不明確,但有研究表明,在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells,GSC)中,GRP78/micRNA-205軸在GSC維持和抗輻照性上起重要作用[26]。Dauer等[27]在敲低GRP78表達(dá)后觀察到胰腺CSCs克隆原性和自我更新性降低,化療敏感度增加,但具體機(jī)制尚不清楚。因而CD133有望成為胰腺導(dǎo)管腺癌CSCs標(biāo)志物,靶向未折疊蛋白反應(yīng)核心GRP78相關(guān)通路可為清除胰腺CSCs提供了新治療思路。

5．未折疊蛋白反應(yīng)與黏蛋白:黏蛋白(mucins,MUC)是一類高相對(duì)分子質(zhì)量糖蛋白,主要分為分泌型黏蛋白和跨膜黏蛋白兩大類。胰腺導(dǎo)管腺癌的一個(gè)重要特征是分泌型黏蛋白產(chǎn)生異常,過(guò)量表達(dá)的黏蛋白形成物理屏障,阻止藥物到達(dá)預(yù)定部位;以MUC-4為代表的跨膜黏蛋白相較正常組織,在卵巢癌、胰腺癌等腫瘤中明顯差異表達(dá),廣泛參與腫瘤細(xì)胞代謝重排、免疫逃避、侵襲及耐藥等過(guò)程,因此黏蛋白不僅在功能上參與腫瘤進(jìn)展,同時(shí)有望成為新型腫瘤標(biāo)志物[28]。

硼酸衍生物硼替佐米作為蛋白酶體抑制劑已用作血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體腫瘤的治療藥物,其本身能夠削弱腫瘤細(xì)胞內(nèi)泛素化標(biāo)記異常蛋白降解能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。Wissniowski等[30]研究表明,沉默胰腺癌細(xì)胞MUC-4基因表達(dá),硼替佐米誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率上升,此凋亡過(guò)程由XBP-1剪切激活的CHOP凋亡通路介導(dǎo)。沉默MUC基因在減少黏蛋白合成量的同時(shí)強(qiáng)化未折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平,因而針對(duì)MUC-4/XBP-1/CHOP凋亡通路研究具有重要意義,相關(guān)研究有望削弱胰腺癌、結(jié)直腸癌等黏蛋白高表達(dá)腫瘤對(duì)化療藥物的抵抗作用。

三、展 望

未折疊蛋白反應(yīng)的時(shí)長(zhǎng)和強(qiáng)度直接決定了細(xì)胞最終結(jié)局。短期、輕度應(yīng)激狀態(tài)下,細(xì)胞激活適應(yīng)性促生存通路,慢性或強(qiáng)烈應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前針對(duì)腫瘤耐藥提出的方案包括兩方面:一方面,抑制未折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)的逃避化療藥物殺傷途徑;另一方面,持續(xù)應(yīng)激誘發(fā)細(xì)胞凋亡。但持續(xù)應(yīng)激狀態(tài)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性不良反應(yīng),在未找到靶向凋亡誘導(dǎo)劑之前,目前解決胰腺癌耐藥主要研究方向仍是阻斷其促生存通路。

未折疊蛋白反應(yīng)體現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白代謝失衡過(guò)程的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié),其調(diào)控機(jī)制精密且復(fù)雜,3條主要通路研究較完善,但仍有部分問(wèn)題尚未解決,如決定GRP78合成數(shù)量的上游機(jī)制,GRP78如何感應(yīng)并衡量蛋白代謝壓力大小,GRP78激活3條通路有無(wú)傾向性,GRP78同時(shí)調(diào)控蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和鈣離子代謝,它們之間是否相互影響,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶是一群功能復(fù)雜的“裝配機(jī)器“,共同參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)折疊、組裝及降解,除已知的通路外,可能還有未知的通路或調(diào)控機(jī)制參與未折疊蛋白反應(yīng),要切斷未折疊蛋白反應(yīng)為胰腺癌化療耐藥提供的促生存通路,上述問(wèn)題都亟待解決。

綜上所述,未折疊蛋白反應(yīng)在胰腺癌化療耐藥多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用,腫瘤細(xì)胞通過(guò)強(qiáng)化促生存相關(guān)通路增加對(duì)化療藥物抵抗力,遺憾的是目前相關(guān)研究?jī)H停留在細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平,后續(xù)藥物研究及臨床試驗(yàn)仍有待于完善,如何靶向打破腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)其凋亡有待于進(jìn)一步研究。因此,改善胰腺癌化療耐藥研究仍具有很大潛力,選擇性阻斷胰腺癌未折疊蛋白反應(yīng)逃避化療藥物殺傷途徑,有望改善其不良預(yù)后。