張曉輝, 覃宗敏, 李聰聰, 路福平, 曲 戈, 孫周通

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院, 天津 300457; 2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津 300308; 3. 國(guó)家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心, 天津 300308)

手性胺醇化合物是醫(yī)藥合成中的重要中間體[1-5],目前市場(chǎng)上使用的藥物中含有胺醇結(jié)構(gòu)的約占40%[6]。隨著手性藥物在醫(yī)藥市場(chǎng)上的需求日趨增加,手性醫(yī)藥中間體的綠色生物合成也備受關(guān)注。(S)-2-氨基丁醇是一類(lèi)非常重要的手性砌塊,用于眾多藥物合成中,例如,抗結(jié)核桿菌藥物乙胺丁醇(Ethambutol)、治療哮喘的沙美特羅(Salmeterol)[7]、減緩新型冠狀病毒并發(fā)癥的美托洛爾MTP(Metoprolol)[8-9]、治療增殖性嬰兒血管瘤的阿替洛爾(Atenolol)[10-11]、治療神經(jīng)源性逼尿肌過(guò)度活動(dòng)NDO的特效藥米拉貝隆(Mirabegron)[12]、HIV抑制劑埃替拉韋(Elvitegravur)[2]和一種抗腫瘤藥物PDK1抑制劑[13]等。

合成(S)-2-氨基丁醇的化學(xué)方法存在一些問(wèn)題,如需要昂貴的原料和過(guò)渡金屬催化劑,步驟復(fù)雜,區(qū)域和對(duì)映體選擇性不足,并且需要高壓設(shè)備等。相反,生物催化法因其對(duì)環(huán)境較為友好、產(chǎn)物的對(duì)映選擇性高和參與反應(yīng)時(shí)的條件相對(duì)溫和等優(yōu)勢(shì)而備受青睞,是一種很有發(fā)展前景的替代性方法。目前生物催化法可利用?；负王０访阜纸馔庀?-氨基丁醇來(lái)獲得(S)-2-氨基丁醇[14-15],也可以用轉(zhuǎn)氨酶[16]或氨基酸脫氫酶[17]從2-酮丁酸底物出發(fā),不對(duì)稱(chēng)合成(S)-2-氨基丁醇,還有通過(guò)胺脫氫酶催化1-羥基-2-丁酮直接胺化合成(S)-2-氨基丁醇[18],這些方法存在轉(zhuǎn)化率低,在合成過(guò)程中需要消耗大量氨供體同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物,底物昂貴等問(wèn)題。有研究報(bào)道,在酵母細(xì)胞中構(gòu)建了一條從蘇氨酸出發(fā),通過(guò)4步反應(yīng)合成(S)-2-氨基丁醇的新途徑,首次實(shí)現(xiàn)(S)-2-氨基丁醇的體內(nèi)合成。其中,關(guān)鍵一步是利用羧酸還原酶(Carboxylic acid reductase, CAR)催化還原(S)-2-氨基丁酸生成(S)-2-氨基丁醛,但野生型CAR對(duì)(S)-2-氨基丁酸的底物特異性較差且催化效率低[19]。

雖然CAR在工業(yè)生產(chǎn)醛和各種羧酸的還原衍生物方面具有巨大潛力,受到極大關(guān)注,但是該類(lèi)酶對(duì)極性較強(qiáng)的氨基酸類(lèi)底物活性較差[20]。近年來(lái)亦有針對(duì)CAR的酶工程研究,但大多聚焦于有機(jī)酸類(lèi)底物[21-22]或者開(kāi)發(fā)基于此類(lèi)酶的新反應(yīng)設(shè)計(jì)[23-24],尚未有針對(duì)提升α-氨基酸類(lèi)底物催化活性的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

研究以Segniliparusrugosus來(lái)源的野生型羧酸還原酶SrCAR為研究對(duì)象,以N-Boc-(S)-2-氨基丁酸(N-Boc-1a)為模式底物,通過(guò)設(shè)計(jì)提升SrCAR催化效率并級(jí)聯(lián)醇脫氫酶,還原N-Boc-1a為N-Boc-(S)-2-氨基丁醇(N-Boc-1c),最終通過(guò)脫Boc保護(hù)合成目標(biāo)產(chǎn)物(S)-2-氨基丁醇(1c),見(jiàn)圖1。

圖1 全細(xì)胞催化合成 (S)-2-氨基丁醇(1c)Figure 1 Whole-cell synthesis of (S)-2-aminobutanol(1c)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與引物來(lái)源

宿主為E.coliBAP1[25];以Segniliparusrugosus來(lái)源的羧酸還原酶SrCAR(GenBank:WP_007468889)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)來(lái)源的醇脫氫酶PfADH(GenBank:AF090329.2)和大腸桿菌(Escherichiacoli)來(lái)源的醛還原酶Ahr(GenBank:WP_001309160.1)均由武漢金開(kāi)瑞生物工程公司合成;引物合成均來(lái)自安升達(dá)(北京)。

1.1.2 試劑與儀器

島津高效液相色譜儀LC-2030C、島津高效氣相色譜儀LC-2030(日本SHIMADZM公司),其他詳見(jiàn)文獻(xiàn)[26],N-Boc-(S)-2-氨基丁酸及其他試劑均由喀斯瑪平臺(tái)的生化公司購(gòu)置。

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基:10 g胰蛋白胨,5 g酵母提取物,10 g氯化鈉,1 000 mL純水;TB培養(yǎng)基:24 g胰蛋白胨,12 g酵母提取物,4 mL甘油,900 mL純水,100 mL TB緩沖液(2.31 g磷酸二氫鉀、16.43 g磷酸氫二鉀,100 mL純水)。將TB培養(yǎng)基與TB緩沖液?jiǎn)为?dú)分裝滅菌(121 ℃滅菌20 min)備用,使用前將TB液體培養(yǎng)基與TB緩沖液以9∶1的比例混合。

1.2 方法

1.2.1 突變體庫(kù)的構(gòu)建

相關(guān)突變體及突變體文庫(kù)均以MegaPCR方法[27]構(gòu)建,共兩輪PCR,以第一輪得到的產(chǎn)物作為第二輪的大引物。PCR擴(kuò)增體系(50 μL):無(wú)菌水(32 μL),10×PCR KOD-Plus-Neo緩沖液(5 μL),模板DNA(1 μL,5 ng),上游引物(1.5 μL,0.3 μmol/L)和下游引物(1.5 μL,0.3 μmol/L),KOD-Plus-Neo DNA聚合酶(1 μL),2 mmol/L dNTPs(5 μL,0.2 mmol/L),25 mmol/L MgSO4(3 μL,1.5 mmol/L)。PCR程序:94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸7 min,以2 kb/min的速率延伸,循環(huán)數(shù)為30次。PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶DpnI處理3 h,然后電轉(zhuǎn)到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBAP1中。如表1所示,根據(jù)G430與K524位點(diǎn)組合和K524與A627組合以NNK(反向?yàn)镸NN)為構(gòu)建單元設(shè)計(jì)引物,根據(jù)表3陽(yáng)性位點(diǎn)的氨基酸突變殘基,設(shè)計(jì)G430/K524/E533/A627簡(jiǎn)并密碼子庫(kù)的引物。

表1 組合突變體文庫(kù)引物列表Table 1 The primers used in the combinatorial mutant libraries

1.2.2 突變體文庫(kù)篩選

96深孔培養(yǎng)板中加入300 μL含有卡納霉素(Kan)(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基。用滅菌后的牙簽挑取SrCAR突變體文庫(kù)的單克隆轉(zhuǎn)移到96深孔培養(yǎng)板中,于37 ℃、800 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取120 μL菌液加入到含有60 μL (60%,體積分?jǐn)?shù))甘油的保菌板中保菌,保菌板用無(wú)菌封口膜封上后放置-80 ℃保存。將含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0.2 mmol/L)和Kan(50 μg/mL)的700 μL TB補(bǔ)加到96深孔培養(yǎng)板中的剩余菌液中,在30 ℃搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。收集細(xì)胞沉淀并用0.5 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)洗滌菌體兩遍,離心后棄上清液。將細(xì)胞沉淀在0.5 mL的含有終濃度為5 mmol/LN-Boc-1a、100 mmol/L葡萄糖、2 mg/mL NADPH依賴(lài)性葡萄糖脫氫酶(GDH)的粗酶粉、10 mmol/L ATP、10 mmol/L氯化鎂(MgCl2)和2 mmol/L NADP+的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)中重懸菌體,并于30 ℃、800 r/min的條件下反應(yīng)5 h[28]。設(shè)置E.coliBAP1/pET24a為陰性對(duì)照,同時(shí)設(shè)置無(wú)菌對(duì)照,其他流程均相同。待反應(yīng)結(jié)束后,通過(guò)離心收集上清液。取100 μL上清液轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板(Costar 3603)中,同時(shí)加入20 μL溴百里酚藍(lán)[29]。將該96孔酶標(biāo)板在室溫下混勻后,用酶標(biāo)儀Neo2在615 nm處檢測(cè)吸光度值,選取吸光度值小于野生型的突變體用于復(fù)篩。

以野生型SrCAR為模板,和另外42條已報(bào)道的CAR序列[30]進(jìn)行多序列比對(duì),導(dǎo)出FASTA格式的結(jié)果文件,提交到Comulator網(wǎng)站(https://comulator.bio-prodict.com)[31],對(duì)G430、E533和K524等3個(gè)陽(yáng)性位點(diǎn)進(jìn)行共進(jìn)化分析。

1.2.3 酶活性分析

為進(jìn)一步篩選出優(yōu)勢(shì)突變體,將經(jīng)過(guò)96孔板初篩得到的突變體在250 mL廣口錐型搖瓶中擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率驗(yàn)證。將所得突變體接種至含有Kan(50 μg/mL)的5 mL LB試管中,220 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)10 h。然后,將1 mL菌液轉(zhuǎn)接入含Kan(50 μg/mL)的50 mL TB培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至菌體OD600值達(dá)到0.8左右。隨后,以終濃度0.1 mmol/L IPTG以過(guò)表達(dá)羧酸還原酶,在20 ℃恒溫振蕩繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)約15 h。離心后用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)洗滌菌體兩遍,棄上清液,稱(chēng)取濕菌體重量,置于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。SrCAR及其突變體生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的0.5 mL反應(yīng)體系如下:羧酸還原酶全細(xì)胞0.1 g/mL,葡萄糖脫氫酶GDH粗酶粉2 mg/mL,5 mmol/LN-Boc-1a,2 mmol/L NADP+,100 mmol/L葡萄糖,磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4),于2 mL EP管中反應(yīng),在恒溫金屬浴中30 ℃,1 000 r/min反應(yīng)1 h,0.5 h時(shí)調(diào)節(jié)pH 7.4,以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min收集反應(yīng)液。取200 μL的上清液于新的2 mL EP管中,加入飽和的NaCl,再加入二倍體積乙酸乙酯400 μL使蛋白質(zhì)充分變性,并將產(chǎn)物萃取出來(lái),在室溫下用恒溫振蕩混勻儀振蕩5 min后,于12 000 r/min、3 min的條件下離心收集上清液。取200 μL上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)膜后進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)[32]。檢測(cè)條件如表2。

表2 氣相色譜檢測(cè)條件Table 2 Detection conditions of gas chromatography

全細(xì)胞催化(S)-2-氨基丁酸的檢測(cè):12 000 r/min室溫離心5 min收集反應(yīng)液。取150 μL的上清液于新的2 mL EP管中,加入500 μL乙腈以使其中的蛋白質(zhì)充分變性,充分振蕩后,12 000 r/min離心3 min收集上層反應(yīng)液。用Marfey’s試劑(14 mmol/L,溶于乙腈,避光備用)衍生[33]:取100 μL乙腈+40 μL碳酸氫鈉(1 mol/L)+30 μL衍生劑+50 μL上述上層反應(yīng)液,在恒溫金屬浴中于80 ℃、1 000 r/min的條件下衍生10 min。衍生結(jié)束后,用10 μL濃鹽酸(4 mol/L)淬滅反應(yīng)。取200 μL反應(yīng)液用0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾后進(jìn)行液相檢測(cè)。檢測(cè)條件:液相色譜柱Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),340 nm處,室溫下流速為1 mL/min。進(jìn)樣體積為10 μL,A泵為純水[含0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸],B泵為甲醇[含0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸],前3 min以40%的甲醇[含0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸]洗脫,4～13 min以60%的甲醇(體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸)洗脫,14～20 min以60%的甲醇(體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸)洗脫。(S)-2-氨基丁酸保留時(shí)間為14.3 min,(S)-2-氨基丁醇保留時(shí)間為12.5 min。

1.2.4 優(yōu)勢(shì)突變體酶學(xué)性能表征

在1.2.3節(jié)所述0.5 mL反應(yīng)體系中,30 ℃,1 000 r/min反應(yīng),測(cè)定在底物濃度0.2～40 mmol/L范圍內(nèi)反應(yīng)的初速度。經(jīng)計(jì)算得到反應(yīng)速率和底物濃度,利用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行米氏方程的非線性擬合,得到Km和Vmax,最后計(jì)算得kcat[34]。

羧酸還原酶的熱穩(wěn)定性測(cè)試:以蛋白質(zhì)構(gòu)象受溫度影響變性一半時(shí)的熔解溫度Tm為指標(biāo),利用圓二色光譜(Circular dichroism,CD)分析酶蛋白樣品的熱穩(wěn)定性[26]。對(duì)目的蛋白進(jìn)行鎳柱親和層析,經(jīng)脫鹽后,用脫鹽液將純酶液稀釋到0.2 mg/mL左右,經(jīng)過(guò)高速低溫離心的純酶液上樣檢測(cè)。根據(jù)CD儀器記錄曲線經(jīng)擬合后得到Tm。

1.2.5 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬

以SrCAR(PDB編號(hào)5MSW)[35]為模板,通過(guò)在線SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模得到XH7的模型。使用Autodock 4.2[36]的拉馬克遺傳算法(LGA)將底物N-Boc-1a對(duì)接到SrCAR與XH7的活性口袋中,將獲得的能量最低的復(fù)合物結(jié)構(gòu)作為分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu)。研究中模擬了2個(gè)體系,分別為野生型SrCAR+N-Boc-1a,突變體SrCAR(XH7)+N-Boc-1a兩個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)。所有的分子動(dòng)力學(xué)模擬均使用AMBER 20軟件包[37]運(yùn)行。蛋白質(zhì)由amber ff14SB力場(chǎng)描述[38],并使用GAFF[39]生成小分子的力場(chǎng)參數(shù)。將TIP3P[40]水分子添加到八面體的周期性盒子中進(jìn)行模擬,距離溶質(zhì)的距離為1.2 nm,以避免邊緣效應(yīng)的影響。通過(guò)加入適當(dāng)數(shù)量的中和離子,使整個(gè)系統(tǒng)成為電中性的。用SHAKE算法[41]約束所有涉及氫原子的鍵,長(zhǎng)程靜電相互作用采用PME算法[42]來(lái)處理,截?cái)喟霃綖? nm。對(duì)2個(gè)系統(tǒng)通過(guò)最陡下降算法和共軛梯度算法模擬各5 000步,使系統(tǒng)能量最小化。之后,在NVT系綜下逐漸加熱到298 K,最終,在NPT系綜下對(duì)每個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行了50 ns的模擬,并平行重復(fù)3次,所有模擬的時(shí)間步長(zhǎng)均為2 fs。

1.2.6 產(chǎn)物脫Boc與分離純化

反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液以4 000 r/min離心30 min,收集上清液,并用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L, pH 7.4)洗滌菌體3次,隨后在收集到的反應(yīng)液中加入飽和氯化鈉和乙酸乙酯進(jìn)行萃取,取上層萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),再加入二氯甲烷溶解,加入濃HCl(12 mol/L)至pH 2進(jìn)行脫Boc保護(hù)[43],室溫反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后加入飽和碳酸氫鈉淬滅反應(yīng),通過(guò)分液漏斗分離下層有機(jī)溶液,并用無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥,最后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得(S)-2-氨基丁醇粗提物。用純水溶解上述固體后,再通過(guò)離子交換樹(shù)脂Doex 50WX8-100對(duì)產(chǎn)物進(jìn)一步提純[18],獲得(S)-2-氨基丁醇純品。具體操作如下:首先將離子交換柱和產(chǎn)物粗提物分別用5%(體積分?jǐn)?shù))的硫酸酸化,再用超純水洗滌柱子,接著以低流速緩慢加入酸化好的樣品,用超純水洗滌至pH 7.0左右,再用100 mL 9%(體積分?jǐn)?shù))的氨水將樣品洗脫,得到的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到(S)-2-氨基丁醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物(S)-2-氨基丁酸的N-Boc保護(hù)

構(gòu)建大腸桿菌全細(xì)胞催化底物(S)-2-氨基丁酸(1a)反應(yīng)體系,發(fā)現(xiàn)在空載體對(duì)照及含有SrCAR重組菌均有87%的底物消耗,且未檢測(cè)到產(chǎn)物1c[圖2(a)]。此外,利用純酶反應(yīng)驗(yàn)證,如圖2(b)所示,在不含酶的陰性對(duì)照反應(yīng)體系中存在60%的底物消耗,但無(wú)產(chǎn)物生成;在含有SrCAR與醛還原酶Ahr純酶的反應(yīng)體系中,檢測(cè)到80%的底物消耗,且有20%的產(chǎn)物(S)-2-氨基丁醇生成。在全細(xì)胞催化體系中存在底物1a的背景消耗問(wèn)題,可能被大腸桿菌內(nèi)源酶代謝消耗。上述結(jié)果表明,SrCAR純酶能夠與大腸桿菌來(lái)源的醛還原酶Ahr級(jí)聯(lián),催化1a生成1c,但是存在明顯的底物背景消耗問(wèn)題,說(shuō)明1a并非理想底物。

(a)全細(xì)胞反應(yīng)催化底物1a[(S)-2-氨基丁酸],全細(xì)胞反應(yīng)體系為0.1 g/mL的全細(xì)胞、NADP+(2 mmol/L)、1a(5 mmol/L)、ATP(10 mmol/L)、Mg2+(10 mmol/L)、GDH(2 mg/mL)和葡萄糖(100 mmol/L),反應(yīng)條件為1 000 r/min,24 h;(b)純酶反應(yīng)催化底物1a[(S)-2-氨基丁酸],純酶反應(yīng)體系為SrCAR純酶(75 μmol/L)、Ahr純酶(150 μmol/L)、NADPH(10 mmol/L)、1a(5 mmol/L)、ATP(10 mmol/L)和Mg2+(10 mmol/L),反應(yīng)條件為800 r/min,24 h,Control為不含純酶但與實(shí)驗(yàn)組一致;(c)1a[(S)-2-氨基丁酸]、N-Fmoc-1a和N-Boc-1a在空載全細(xì)胞反應(yīng)體系中的消耗情況;(d)SrCAR對(duì)底物N-Boc-1a的底物消耗與產(chǎn)物生成情況;(c)和(d)為全細(xì)胞反應(yīng)底物不同,其他成分同(a),反應(yīng)時(shí)間為1 h。圖2 全細(xì)胞與純酶催化還原(S)-2-氨基丁酸反應(yīng)Figure 2 Reduction of (S)-2-aminobutyric acid by whole cells and purified enzymes

為解決上述背景消耗問(wèn)題,采用Boc及Fmoc氨基保護(hù)1a,即N-Boc-1a和N-Fmoc-1a作為底物,通過(guò)全細(xì)胞催化體系考察這兩種底物的消耗情況。結(jié)果如圖2(c)所示,在空載(pET24a)體系中,1a的消耗為94%,N-Fmoc-1a的消耗為91%,而N-Boc-1a的消耗僅為18%。說(shuō)明大腸桿菌內(nèi)源基因可代謝消耗底物1a及Fmoc保護(hù)的底物,但對(duì)Boc保護(hù)的底物識(shí)別能力較差,因此后續(xù)研究選擇N-Boc-1a作為模式底物。此外,在SrCAR催化體系中,產(chǎn)物生成和底物消耗均為80%[圖2(d)],推測(cè)在含有SrCAR及其突變體過(guò)表達(dá)的全細(xì)胞反應(yīng)體系中,可競(jìng)爭(zhēng)性催化還原模式底物,從而一定程度上避免了內(nèi)源性的背景消耗。說(shuō)明對(duì)底物1a的-NH2進(jìn)行Boc保護(hù),能夠有效降低背景消耗,并且促進(jìn)產(chǎn)物生成,因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)以N-Boc-1a為模式底物開(kāi)展。

2.2 羧酸還原酶的理性設(shè)計(jì)

2.2.1 單位點(diǎn)突變體的篩選

以N-Boc-1a為模式底物,基于實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)展的催化機(jī)制解析及酶-底物相互作用分析等工作[21,34],對(duì)已構(gòu)建的12個(gè)單點(diǎn)飽和突變體文庫(kù)(T265、S266、G267、H315、S408、G430、T505、D507、Y519、R522、K524、E533)進(jìn)行全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化篩選測(cè)試。其中,G430、K524和E533位點(diǎn)上的突變體活性提高幅度最大,突變體G430V、G430K、G430V、K524A、K524Q、E533F等對(duì)N-Boc-1a的轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%(5 mmol/L)。因?yàn)檫@3個(gè)位點(diǎn)陽(yáng)性突變較多且突變體轉(zhuǎn)化率能達(dá)到99%,所以理性選取G430、K524和E533為陽(yáng)性位點(diǎn)。

2.2.2 陽(yáng)性位點(diǎn)共進(jìn)化分析

為探索陽(yáng)性位點(diǎn)G430、E533和K524是否與酶蛋白其他位點(diǎn)存在共同進(jìn)化關(guān)系,對(duì)上述3個(gè)位點(diǎn)采用在線工具Comulator進(jìn)行共進(jìn)化分析。結(jié)果表明,只有K524位點(diǎn)存在共進(jìn)化關(guān)聯(lián)位點(diǎn)A627。因此,對(duì)A627位點(diǎn)開(kāi)展單點(diǎn)飽和突變測(cè)試。其中,A627V、A627N和A627L對(duì)5 mmol/L底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%。

2.2.3 組合飽和突變

為進(jìn)一步提高SrCAR突變體活性,以轉(zhuǎn)化率大于90%為標(biāo)準(zhǔn),選取G430、K524、E533和A627單點(diǎn)飽和突變體文庫(kù)中的優(yōu)勢(shì)突變殘基作為構(gòu)建單元:G430位點(diǎn)選取的是賴(lài)氨酸(K)、色氨酸(W)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、谷氨酸(E)以及野生型甘氨酸(G);據(jù)此G430位點(diǎn)設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并密碼子為RWA和KGG。K524位點(diǎn)選擇的是丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)以及野生型賴(lài)氨酸(K);對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并密碼子為MAA和GCG。E533位點(diǎn)選取的是苯丙氨酸(F)和野生型谷氨酸(E);因沒(méi)有同時(shí)滿(mǎn)足需求的簡(jiǎn)并密碼子,所以對(duì)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)的密碼子為GAA和TTT。A627位點(diǎn)選擇的氨基酸為纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)以及野生型丙氨酸(A);設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并密碼子為KTA、ATT和GCG。以上述簡(jiǎn)并密碼子設(shè)計(jì)引物構(gòu)建G430/K524/E533/A627“小而精”的突變體文庫(kù)(表3),最終從432個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選獲得優(yōu)勢(shì)突變體XH7(G430V/E533F/A627N),轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%。

表3 陽(yáng)性位點(diǎn)突變體分析Table 3 Analysis of positive site mutants

為進(jìn)一步檢驗(yàn)獲得的系列優(yōu)勢(shì)突變體,提升底物N-Boc-1a濃度至20 mmol/L并進(jìn)行3 h的催化反應(yīng)。結(jié)果如圖3所示,突變體A627N、K524F/A627V、G430V/E533F/A627N的生成N-Boc-1c的轉(zhuǎn)化率分別為49%、48%和78%。突變體XH7(G430V/E533F/A627N)的轉(zhuǎn)化率最高,因此后續(xù)開(kāi)展對(duì)XH7的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定與放大反應(yīng)分析。

圖3 全細(xì)胞反應(yīng)催化還原底物N-Boc-1aFigure 3 Reduction of N-Boc-1a by whole cells

2.3 優(yōu)勢(shì)突變體酶學(xué)性能表征

為評(píng)估SrCAR及其獲得的優(yōu)勢(shì)突變體XH7的催化效率,對(duì)工程化羧酸還原酶的Km、kcat、kcat/Km及比酶活4個(gè)參數(shù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)表征。其中,優(yōu)勢(shì)突變體XH7的Km值為0.45 mmol/L,與野生型(0.92 mmol/L)相比降低了2倍多,而kcat值與野生型接近,分別為4.41 s-1和4.46 s-1。XH7的催化效率動(dòng)力學(xué)參數(shù)kcat/Km為10.21 s-1mmol/L-1,是模板SrCAR(4.78 s-1mmol/L-1)的2.1倍,但比酶活與野生型無(wú)明顯差異(分別為0.67 U/mg和0.69 U/mg),見(jiàn)表4。因此,優(yōu)勢(shì)突變體活性的提高主要在于底物N-Boc-1a與酶的親和力增加。此外,CD檢測(cè)結(jié)果顯示XH7的Tm值比野生型提高了2.3 ℃,說(shuō)明該突變體在kcat/Km提升的同時(shí),其熱穩(wěn)定性也略有提升(表4)。

表4 SrCAR優(yōu)勢(shì)突變體的動(dòng)力學(xué)和熱穩(wěn)定性參數(shù)Table 4 Kinetic parameters and specific activity of SrCAR mutants

2.4 分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

為闡明突變體催化活性及熱穩(wěn)定性提高的可能分子機(jī)制,開(kāi)展相關(guān)計(jì)算解析。通過(guò)分子對(duì)接獲得野生型WT及突變體XH7的蛋白-配體-底物復(fù)合體結(jié)構(gòu)[圖4(a)];接下來(lái)對(duì)獲得的復(fù)合體結(jié)構(gòu)開(kāi)展分子動(dòng)力學(xué)模擬。通過(guò)對(duì)50 ns的模擬軌跡進(jìn)行均方根偏差(RMSD)分析發(fā)現(xiàn),XH7的RMSD值分布比野生型更集中,主要富集在0.38 nm附近[圖4(b)],說(shuō)明其在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。另外,在XH7中627位點(diǎn)由丙氨酸(A)突變?yōu)樘於０?N)后,其酰胺側(cè)鏈可與底物N-Boc-1a形成2個(gè)氫鍵作用(d2和d3),同時(shí)也可以與AMP形成氫鍵相互作用(d4),而在WT中只有骨架N上的氫原子可以與底物形成氫鍵(d1)[圖4(c)]。因此,該位點(diǎn)突變后新形成的相互作用可能更有利于穩(wěn)定底物N-Boc-1a在口袋中發(fā)生活化反應(yīng)。雖然WT與XH7中430位點(diǎn)的骨架原子與AMP都存在氫鍵相互作用,但在XH7中甘氨酸(G)突變?yōu)槔i氨酸(V)后,V430側(cè)鏈可以與F294形成烷基-π共軛作用(d5),此外,遠(yuǎn)離活性中心的533位點(diǎn)由谷氨酸(E)突變?yōu)楸奖彼?F)后,可以與Y604形成π-π共軛效應(yīng)(d6),由此可知,G430V/E533F突變可能通過(guò)與鄰近殘基的作用而利于提高突變體的熱穩(wěn)定性。進(jìn)一步分析發(fā)生以上相互作用關(guān)系的殘基間距離隨模擬時(shí)間變化的趨勢(shì)可知,G430V/E533F/A627N與底物、輔因子以及關(guān)鍵殘基的距離均維持在0.4 nm左右[圖4(d)],說(shuō)明上述相互作用在模擬過(guò)程中比較穩(wěn)定。

(a)野生型WT及突變體XH7與底物分子N-Boc-1a對(duì)接后的復(fù)合體結(jié)構(gòu)圖;(b)野生型WT及突變體XH7體系的RMSD結(jié)果對(duì)比;(c)與突變殘基G430V/E533F/A627N相關(guān)的殘基間相互作用分析;(d)相互作用距離在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中隨時(shí)間變化情況。圖4 野生型WT和突變體XH7與N-Boc-1a的分子對(duì)接以及復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果分析Figure 4 Molecular docking of wild-type WT and mutant XH7 with N-Boc-1a and analysis of molecular dynamics simulation results of the complex

通過(guò)在線網(wǎng)站(https://www.expasy.org/resources/protscale)分析突變體XH7與WT的氨基酸疏水性強(qiáng)度。發(fā)現(xiàn)突變體XH7與野生型WT相比,430位點(diǎn)由甘氨酸(G)突變?yōu)槔i氨酸(V)后,以及遠(yuǎn)離活性中心的533位點(diǎn)由谷氨酸(E)突變?yōu)楸奖彼?F)后,它們周?chē)氖杷悦黠@增強(qiáng),更有利于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,可能也是Tm值略有提高的原因。

2.5 放大反應(yīng)

為檢驗(yàn)工程化的SrCAR能否實(shí)現(xiàn)制備級(jí)轉(zhuǎn)化,用優(yōu)勢(shì)突變體XH7全細(xì)胞催化20 mmol/LN-Boc-1a(10 mL反應(yīng)體系)。檢測(cè)結(jié)果顯示中間產(chǎn)物積累較多[圖5(a)],推測(cè)可能是因?yàn)榇竽c桿菌內(nèi)源醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)還原力不足。據(jù)此,利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的ADH酶庫(kù)(共包含90種不同物種來(lái)源ADH),以5 mmol/L的中間產(chǎn)物N-Boc-1b為底物篩選合適的ADH,最終選取轉(zhuǎn)化率最高(57%)的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)來(lái)源醇脫氫酶PfADH,與突變體XH7建立共表達(dá)體系。全細(xì)胞催化底物20 mmol/LN-Boc-1a放大反應(yīng)結(jié)果[圖5(a)]所示,在PfADH-XH7共表達(dá)體系催化反應(yīng)中,中間產(chǎn)物N-Boc-1b的積累明顯減少。在5 h時(shí),底物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物的量達(dá)到99%[圖5(b)]。經(jīng)強(qiáng)酸脫Boc并用離子交換樹(shù)脂進(jìn)一步純化后,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了NMR分析。結(jié)果為1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 3.60(d, J=9.5 Hz, 1H), 3.30(t, J=8.5 Hz, 1H), 2.74(s, 3H), 1.47(dd, J=13.1, 6.4 Hz, 1H), 1.44～1.25(m, 1H), 0.94(t, J=7.1 Hz, 3H)。1H NMR結(jié)果分析顯示,分離獲得的產(chǎn)物為(S)-2-氨基丁醇,其分離得率為60%。

(a)中間產(chǎn)物N-Boc-1b生成情況;(b)產(chǎn)物N-Boc-1c生成情況。圖5 XH7與PfADH-XH7中間產(chǎn)物積累與產(chǎn)物生成情況Figure 5 Accumulation and product formation of XH7 and PfADH-XH7 intermediates

3 討論

(S)-2-氨基丁醇是一類(lèi)非常重要的手性醫(yī)藥中間體,本研究選擇晶體結(jié)構(gòu)已知[35]、催化機(jī)制較為清晰[21,34]的SrCAR為模式酶,以N-Boc保護(hù)的(S)-2-氨基丁醇(N-Boc-1a)為模式底物。為提高SrCAR催化還原非天然底物N-Boc-1a的活性,通過(guò)構(gòu)建兩輪突變體文庫(kù)并篩選得到優(yōu)勢(shì)突變體XH7(G430V/E533F/A627N),其kcat/Km是野生型模板SrCAR的2.1倍。催化活性提升的同時(shí),其熱穩(wěn)定性(Tm值)同步提高2.3 ℃。包含XH7與異源醇脫氫酶PfADH的重組大腸桿菌能夠在10 mL反應(yīng)體系中5 h內(nèi)完成底物N-Boc-1a(20 mmol/L)的轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%,并經(jīng)一步脫保護(hù),獲得終產(chǎn)物(S)-2-氨基丁醇。反應(yīng)體系中所用的ATP比較昂貴,后期可采用磷酸激酶實(shí)現(xiàn)由AMP到ATP再生,從而進(jìn)一步提高放大體系的應(yīng)用潛力。綜上,研究為生物合成(S)-2-氨基丁醇提供新思路,也為羧酸還原酶催化氨基酸類(lèi)底物提供了理論參考。