張京晶, 許景垚, 單婷玉, 趙歷強(qiáng), 鐘欣欣, 張帥帥, 吳家文

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院, 合肥 230012; 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研技術(shù)中心新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 合肥 230038; 3. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院, 合肥 230012; 4. 安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心, 合肥 230012)

兔兒傘(Syneilesisaconitifolia(Bunge)Maxim),又名貼骨傘、龍頭七,為菊科(Compositae)兔兒傘屬草本植物。兔兒傘以根或全草入藥,多用于治療癰疽腫毒、癆疬和抗腫瘤等,極具經(jīng)濟(jì)及藥用價(jià)值[1-2]。

兔兒傘含有三萜、生物堿及黃酮[3]等活性成分,其中,三萜類物質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、生物學(xué)功能豐富的次生代謝產(chǎn)物,可依照結(jié)構(gòu)中所具有的碳環(huán)數(shù)劃分為單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)、四環(huán)和五環(huán)三萜,其中,五環(huán)三萜類物質(zhì)如羽扇豆醇有廣泛的藥理作用及生物活性,具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及抗腫瘤等功效[4-7]。

五環(huán)三萜類化合物經(jīng)MVA(甲羥戊酸)及MEP(甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸)途徑完成其生物合成[8],雖然兩條途徑的起始端及路徑各不相同,但二者都可以產(chǎn)生所有合成萜類的基本單位:IPP(異戊烯基焦磷酸)與DMAPP(二甲丙烯焦磷酸)。IPP和DMAPP結(jié)合為GPP(牻牛兒基焦磷酸),GPP再和IPP在FPPS(法尼基焦磷酸合酶)的作用下以頭尾連接的方式生成FPP(法尼基焦磷酸);而后2分子FPP在SS(角鯊烯合成酶)催化下形成1分子SQ(角鯊烯),再經(jīng)SE(角鯊烯環(huán)氧酶)氧化形成2,3-氧化角鯊烯,此階段是三萜類化合物的公共起始階段;2,3-氧化角鯊烯通過構(gòu)象變化生成dammarenyl陽離子中間體,再轉(zhuǎn)化生成五環(huán)的lupanyl陽離子,進(jìn)而形成五環(huán)三萜類物質(zhì)羽扇豆醇[9-10]。

RNA-Seq(轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù))目前已廣泛用于中草藥功能基因、關(guān)鍵酶基因挖掘及活性成分生物合成途徑研究等方面[11-13]。近年來,研究人員已從人參[14-15]、刺五加[16-18]等植物中獲得了FPPS、SS和SE酶基因,但目前尚未有對(duì)兔兒傘轉(zhuǎn)錄組測序及關(guān)鍵酶基因的研究報(bào)道。本研究通過RNA-Seq對(duì)兔兒傘4個(gè)組織(葉、莖、根及根莖)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,進(jìn)而對(duì)羽扇豆醇生物合成途徑及關(guān)鍵酶基因進(jìn)行分析,并比較其在各組織中的差異表達(dá),為兔兒傘羽扇豆醇生物合成途徑的解析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及總RNA提取

兔兒傘植株于2021年4月采摘自安徽中醫(yī)藥大學(xué)(少荃湖校區(qū))藥園,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山教授鑒定為菊科兔兒傘屬植物兔兒傘。將現(xiàn)采的兔兒傘植株經(jīng)滅菌水沖洗干凈,取其葉、莖、根及根莖4個(gè)組織(各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)),擦干水分后立即置于液氮之中,凍存大約1 h,再放入-80 ℃冰箱備取。使用RNA試劑盒(美國,OMEGA)和安捷倫2100生物分析儀(美國,AGILENT)進(jìn)行4個(gè)組織總RNA的提取,以及對(duì)所提取RNA的完整性及濃度進(jìn)行檢測。

1.2 方法

1.2.1 cDNA文庫構(gòu)建

利用獲取的總RNA完成mRNA純化,將其富集和片段化處理,再加入隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,構(gòu)成雙鏈cDNA,從而進(jìn)行cDNA的5′端磷酸化及3′端加A尾,使其與測序接頭相連。最終,篩選合適的片段,完成PCR擴(kuò)增,構(gòu)建cDNA文庫。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序與組裝

利用DNBSEQ測序平臺(tái)[19]完成對(duì)兔兒傘4個(gè)組織的cDNA文庫測序。將原始數(shù)據(jù)內(nèi)質(zhì)量低、接頭受污染、未知堿基N含量高于5%的讀段進(jìn)行篩選清除,獲取高質(zhì)量讀段。通過Trinity[20]軟件完成高質(zhì)量讀段從頭組裝,得到轉(zhuǎn)錄本序列,再運(yùn)用TGICL[21]軟件完成對(duì)轉(zhuǎn)錄本的聚類及去冗余,獲取Unigenes。

1.2.3 Unigenes的富集及注釋

運(yùn)用Map Man軟件進(jìn)一步對(duì)兔兒傘FPKM(Fragments per kilobase million)值大于1的Unigenes于總代謝途徑中進(jìn)行富集與分析。利用NCBI BlastX[22]軟件將Unigenes分別注釋于KOG(蛋白直系同源數(shù)據(jù)庫)、KEGG(京都基因與基因組百科全書)和GO(基因本體論數(shù)據(jù)庫)。

1.2.4 序列比對(duì)、空間結(jié)構(gòu)分析

通過ExPASy Translation Tool(https://web.expasy.org/translate/)檢測兔兒傘FPPS、SS和SE的開放閱讀框(ORF)序列,運(yùn)用DNAMAN(6.0.3.99)和CLUSTALX(1.83)軟件將編碼FPPS、SS和SE的Unigenes序列分別比對(duì)分析,通過Swiss Model在線平臺(tái)(https:∥swissmodel.expasy.org/)及PyMOL軟件對(duì)關(guān)鍵酶FPPS、SS和SE的空間結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行描繪。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)組裝

運(yùn)用DNBSEQ測序平臺(tái)對(duì)兔兒傘進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,共獲取125.2 Gb數(shù)據(jù),其葉、莖、根及根莖的轉(zhuǎn)錄組高質(zhì)量讀段Q30(質(zhì)量值≥30的堿基所占百分比)均大于90%。數(shù)據(jù)組裝高質(zhì)量讀段后,最終生成191 541條Unigenes。

2.2 兔兒傘Unigenes總代謝途徑富集

運(yùn)用MapMan軟件將兔兒傘FPKM值大于1的Unigenes于總代謝途徑中進(jìn)行富集與分析。結(jié)果顯示,在總代謝途徑中,Unigenes主要富集于脂類和次生代謝通路中,并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究分析,發(fā)現(xiàn)在次生代謝通路中Unigenes則主要富集于萜類、黃酮類、苯丙素類代謝途徑(圖1)。

圖1 兔兒傘中FPKM>1的Unigenes在總代謝中的富集及表達(dá)水平Figure 1 Enrichment and expression level of Unigenes(FPKM>1)from S. aconitifolia in total metabolism

2.3 蛋白直系同源數(shù)據(jù)庫(KOG)分類

利用KOG數(shù)據(jù)庫對(duì)組裝獲得的Unigenes進(jìn)行注釋,共有126 126條Unigenes被注釋到25個(gè)類別中。其中,注釋到“一般功能”“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”和“蛋白質(zhì)修飾后翻譯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化或蛋白伴侶”這3類功能的Unigenes最為豐富,分別為24 456、15 705和10 408條(圖2)。

圖2 兔兒傘Unigenes的KOG功能分類Figure 2 Functional classification of S. aconitifolia Unigenes in KOG database

2.4 兔兒傘羽扇豆醇生物合成相關(guān)Unigenes的GO分析

結(jié)果表明,共有6 742條與兔兒傘羽扇豆醇生物合成相關(guān)的Unigenes被注釋GO數(shù)據(jù)庫,并將其歸為分子功能、細(xì)胞組成、生物過程3種類別。其中,分子功能內(nèi)具有“催化活性”的Unigenes為1 628條,具有“結(jié)合”功能的Unigenes為1 050條;細(xì)胞組成內(nèi)含954條Unigenes聚類在“細(xì)胞結(jié)構(gòu)體”,487條Unigenes聚類在“細(xì)胞內(nèi)”;生物過程中聚類在“代謝過程”的Unigenes為1 059條,聚類在“細(xì)胞過程”的Unigenes為946條”(圖3)。

圖3 兔兒傘羽扇豆醇生物合成相關(guān)Unigenes的GO分析Figure 3 GO analysis of Unigenes associated with biosynthesis of lupeol in S. aconitifolia

2.5 兔兒傘羽扇豆醇生物合成差異表達(dá)基因(DEGs)分析

兔兒傘以根或全草入藥,本研究將其根與其他各組織的差異基因表達(dá)水平進(jìn)行比較分析[圖4(a)];在3個(gè)比較組中含24條共有的DEGs參與羽扇豆醇生物合成,其中,有3條(CL12331-1、CL12331-2、CL4703-5)編碼HMGR,3條(CL12247-8、CL4159-1、CL4159-4)編碼DXS,1條(Un46968)編碼MVK,1條(Un63137)編碼FPPS,1條(CL3814-6)編碼SS,1條(Un69301)編碼SE[圖4(b)]。

(a)兔兒傘羽扇豆醇生物合成途徑中DEGs數(shù)目,與葉、莖及根莖相比,根中具有高或低表達(dá)水平的DEGs分別定義為“上調(diào)”和“下調(diào)”;(b)參與羽扇豆醇生物合成中差異表達(dá)基因比較維恩圖。圖4 兔兒傘羽扇豆醇生物合成途徑差異基因數(shù)目Figure 4 Number of differentially expressed genes involved in lupeol biosynthesis by S. aconitifolia

2.6 通過KEGG鑒定羽扇豆醇生物合成相關(guān)Unigenes

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)兔兒傘Unigenes進(jìn)行注釋,發(fā)現(xiàn)14條與其他次生代謝生物合成相關(guān)的通路,其中,注釋到“苯丙素生物合成途徑”的Unigenes數(shù)目最多[圖5(a)],而在與羽扇豆醇生物合成代謝相關(guān)的途徑中,Unigenes最為豐富的是“萜類骨架生物合成途徑”[圖5(b)]。萜類骨架生物合成途徑、倍半萜和三萜生物合成途徑是羽扇豆醇合成的主要代謝途徑,包括AACT、DXS、IPPI等17個(gè)關(guān)鍵酶(表1)。

(a)其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑分類及相關(guān)Unigenes數(shù)目;(b)羽扇豆醇生物合成途徑分類及相關(guān)Unigenes數(shù)目。圖5 兔兒傘Unigenes的KEGG生物合成途徑分類Figure 5 KEGG biosynthetic pathway classification of S. aconitifolia Unigenes

以FPKM>1及Q值<0.05為篩選條件,在MVA途徑中分別有6、3、6、2、3、3、4條Unigenes編碼AACT、HMGS、HMGR、MVK、PMK、MVD和IPPI,在MEP途徑中分別有3、3、2、3、1、3、3、4條Unigenes編碼DXS、DXR、MCT、CMK、MDS、HDS、HDR和IPPI,而在生成羽扇豆醇的過程中有4、6、2條Unigenes分別編碼FPPS、SS和SE。以上關(guān)鍵酶的Unigenes在4個(gè)組織中基因表達(dá)水平的差異分別以熱圖形式呈現(xiàn)(圖6)。

粗體字表示羽扇豆醇生物合成途徑中涉及的關(guān)鍵酶;熱圖表示編碼關(guān)鍵酶的基因在4個(gè)組織中的表達(dá)水平,紅色和綠色分別代表基因表達(dá)水平的高和低;L、S、R、Rh分別表示葉、莖、根、根莖4個(gè)組織。圖6 兔兒傘羽扇豆醇生物合成途徑Figure 6 Biosynthesis pathway of lupeol in S. aconitifolia

2.7 SaFPPS、SaSS和SaSE的序列和結(jié)構(gòu)分析

本研究在兔兒傘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘了羽扇豆醇生物合成途徑中4個(gè)SaFPPS、6個(gè)SaSS和2個(gè)SaSE的基因序列,分別選擇了其中具有完整讀碼框且表達(dá)量較高的基因(CL622-3、CL3814-1和CL1863-7)為研究對(duì)象,分別以杜仲(Eucommiaulmoides)的FPPS晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 7bux.1)[23]、人類的SS晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3vj8.1)[24]和人類的SE晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 6c6n.1)[25]為模板構(gòu)建了SaFPPS、SaSS和SaSE的空間結(jié)構(gòu)模型。

SaFPPS的空間結(jié)構(gòu)是同源二聚體,其單體以α螺旋為主要元件,包含5個(gè)保守區(qū)域(Motif I～Motif V),具有典型的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶保守功能域即富含天冬氨酸的酶活性中心,分別是“93DDIMD97”和“232DDYLD236”(圖7)。

(a)4個(gè)SaFPPS基因的氨基酸序列比對(duì)(綠色方框示意保守結(jié)構(gòu)域Motif I～Motif V、五角星示意FARM第1個(gè)天冬氨酸富含區(qū)、三角形示意SARM第2個(gè)天冬氨酸富含區(qū))。(b)SaFPPS同源二聚體。(c)和(d)SaFPPS單體[(c)中深藍(lán)色、綠色、橙色、熒光藍(lán)和紅色分別示意保守區(qū)域Motif I～Motif V;(d)中黃色和綠色球形結(jié)構(gòu)分別示意93DDIMD97、232DDYLD236酶活性位點(diǎn)]。圖7 SaFPPS氨基酸序列比對(duì)及蛋白空間結(jié)構(gòu)模型Figure 7 Sequence alignment and structure model of SaFPPS

SaSS是一個(gè)單體球狀蛋白,活性中心位于以α螺旋環(huán)繞所構(gòu)成的中央疏水區(qū)域,含6個(gè)保守區(qū)域(Motif I～Motif VI),“47VSRSF51、77DTVED81、213DYLED217、R225”4個(gè)酶活性相關(guān)位點(diǎn)位于保守區(qū)域內(nèi)(圖8)。

(a)6個(gè)SaSS基因的氨基酸序列比對(duì)(紅色方框示意保守結(jié)構(gòu)域Motif I～Motif VI、五角星示意47VSRSF51、77DTVED81、213DYLED217、R225 4個(gè)酶活性相關(guān)位點(diǎn))。(b)～(d)SaSS單體[(c)中深藍(lán)色、綠色、紅色、黃色、熒光藍(lán)和橙色分別示意保守區(qū)域Motif I～Motif VI;(d)中綠色、紫色、熒光藍(lán)、橙色球形結(jié)構(gòu)分別示意47VSRSF51、77DTVED81、213DYLED217、R225酶活性相關(guān)位點(diǎn)]。圖8 SaSS氨基酸序列比對(duì)及蛋白空間結(jié)構(gòu)模型Figure 8 Sequence alignment and structure model of SaSS

SaSE空間結(jié)構(gòu)模型是一個(gè)呈“U型”結(jié)構(gòu)的同源二聚體,每個(gè)SaSE單體含有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(Motif I、Motif II),分別為“81DVIIV…VIER110”的NAD[P]結(jié)合域和“359PGALL…IVLL389”的底物結(jié)合域(圖9)。

(a)兩個(gè)SaSE基因的氨基酸序列比對(duì)(紅色方框示意保守結(jié)構(gòu)域Motif I、Motif II);(b)SaSE同源二聚體;(c)SaSE單體(紅色和深藍(lán)色分別示意“81DVIIV…VIER110”的NAD[P]結(jié)合域和“359PGALL…IVLL389”的底物結(jié)合域)。圖9 SaSE氨基酸序列比對(duì)及蛋白空間結(jié)構(gòu)模型Figure 9 Sequence alignment and structure model of SaSE

3 討論與結(jié)論

五環(huán)三萜類物質(zhì)羽扇豆醇是中草藥兔兒傘內(nèi)的活性成分,含有豐富的生理活性,如抗炎、抗癌及抗腫瘤[26-27]等,在中藥研究領(lǐng)域備受關(guān)注。目前對(duì)兔兒傘的研究主要是在其有效成分的提取、鑒定及藥理作用等方面,而未見有對(duì)兔兒傘轉(zhuǎn)錄組及功能基因的研究報(bào)道,這一定程度上限制了兔兒傘基因資源的研發(fā)與利用。本研究通過高通量測序技術(shù)獲取了兔兒傘中葉、莖、根及根莖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),并利用功能基因注釋進(jìn)一步發(fā)掘兔兒傘羽扇豆醇生物合成途徑相關(guān)酶基因,結(jié)果顯示,有160 534條(83.81 %)Unigenes成功獲得了功能注釋,但因目前缺乏兔兒傘基因組信息,其中,31 007條(16.19 %)Unigenes未能獲得注釋,故兔兒傘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中仍存在少數(shù)Unigenes功能未知,有待進(jìn)一步挖掘。

運(yùn)用Map Man軟件分析兔兒傘FPKM>1的Unigenes,發(fā)現(xiàn)它們主要富集在次生代謝通路中的萜類、黃酮類、苯丙素類代謝途徑。GO分析顯示與兔兒傘羽扇豆醇生物合成相關(guān)的Unigenes主要聚集于生物過程中的“代謝過程”和分子功能中的“催化活性”功能,這些Unigenes的富集可為后期研究兔兒傘羽扇豆醇生物合成途徑提供相應(yīng)的基因信息。

兔兒傘中羽扇豆醇生物合成途徑的395條Unigenes編碼17個(gè)關(guān)鍵酶,參與了此途徑中的各個(gè)關(guān)鍵步驟,其中,FPPS、SS和SE是兔兒傘羽扇豆醇生物合成下游階段起始端的關(guān)鍵酶。本研究對(duì)這3個(gè)關(guān)鍵酶進(jìn)行了序列及結(jié)構(gòu)分析,為進(jìn)一步闡明兔兒傘羽扇豆醇化合物生物合成的分子機(jī)制及其關(guān)鍵酶的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。根中與羽扇豆醇生物合成代謝途徑有關(guān)的特異性差異表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn),很可能對(duì)兔兒傘羽扇豆醇產(chǎn)量的調(diào)控研究具有重要意義。

FPPS是羽扇豆醇合成起始階段的關(guān)鍵酶,可催化IPP和GPP合成轉(zhuǎn)化為FPP,其催化活性中心由一個(gè)大的中心腔構(gòu)成[28]。釀酒酵母FPPS保守結(jié)構(gòu)域中的天冬氨酸殘基發(fā)生突變,會(huì)顯著降低FPPS的催化活性[29]。青蒿中的FPPS基因進(jìn)行高表達(dá)可增加轉(zhuǎn)基因青蒿植株中青蒿素的產(chǎn)量,而通過對(duì)人參發(fā)根中的FPPS過表達(dá)則可提高人參總皂苷的產(chǎn)量[30-31]。以上表明FPPS酶對(duì)代謝產(chǎn)物的合成起著關(guān)鍵作用。SaFPPS中Motif Ⅱ內(nèi)的FARM基序有決定鏈長(chain length determination,CLD)的作用,Motif V內(nèi)SARM基序上游含有一個(gè)保守序列(命名為FQ),FQ氨基酸位于底物結(jié)合腔中,維持GPP與IPP縮合所需的適當(dāng)構(gòu)象[32]。

SaSS能夠催化FPP轉(zhuǎn)變?yōu)镾Q,其兩個(gè)富含天冬氨酸的區(qū)域是與Mg2+的結(jié)合位點(diǎn),主要結(jié)合異戊烯磷酸基團(tuán),是催化2分子FPP縮合為SQ的關(guān)鍵活性位點(diǎn)[33]。通過正向誘導(dǎo)刺激人參[34](Panaxginseng)、刺五加[35](Eleutherococcussenticosus)中SS的酶活性,使得植物中三萜類物質(zhì)的含量顯著提高。SaSE可催化反式角鯊烯于“C=C”雙鍵中插入1個(gè)氧原子形成2,3-氧化鯊烯,是三萜類物質(zhì)生物合成的第一個(gè)氧化反應(yīng)。SaSE中的NAD[P]結(jié)合域內(nèi)含有三萜及甾醇類物質(zhì)合成必需的催化活性位點(diǎn)[36]。對(duì)人參SE基因進(jìn)行誘導(dǎo)使其高表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)三萜類物質(zhì)產(chǎn)量明顯增加[37]。在解脂耶氏酵母中通過對(duì)SE和SS進(jìn)行過表達(dá),羽扇豆醇的產(chǎn)量能提高兩倍左右[38]。由此可知,FPPS、SS、SE這3個(gè)關(guān)鍵酶在羽扇豆醇生物合成中均發(fā)揮著重要作用,它們的酶蛋白氨基酸序列具有高度保守的結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn),很可能在藥用植物中調(diào)控著五環(huán)三萜類物質(zhì)的合成與積累。

本研究建立了兔兒傘葉、莖、根及根莖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,并對(duì)其功能基因進(jìn)行了深入解析,通過分析其羽扇豆醇生物合成途徑,挖掘此途徑中的關(guān)鍵酶基因,為揭示羽扇豆醇合成的分子機(jī)制及關(guān)鍵酶結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究提供了依據(jù),為未來利用基因工程技術(shù)提高羽扇豆醇化合物的產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。