肖同陽, 陳小凡, 劉 興, 楊春富, 朱葆華, 潘克厚, 李 赟

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗室(中國海洋大學(xué)), 山東 青島 266003)

灘涂是海潮高潮位與低潮位之間的地帶,由于潮汐的作用,灘涂具有海洋和陸地兩個生態(tài)系統(tǒng)的特征[1]。咸淡水交匯的灘涂是海岸濕地生態(tài)食物鏈的起點(diǎn),各種貝類、鳥類、魚類、軟體動物、節(jié)肢動物等棲息于此[2-3]。微型底棲生物是潮間帶灘涂主要初級生產(chǎn)者,由底棲微藻、光合細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌組成,通常以聚集在沉積物上層1 cm的底棲硅藻為主,生物量可達(dá)1 g·cm-2·d-1[4]。灘涂生境的物理及化學(xué)因子變化相當(dāng)頻繁,受降水、潮汐流、蒸發(fā)量增加或更多的淡水徑流的影響,河口和近岸灘涂鹽度會出現(xiàn)劇烈的變化,了解分布于灘涂的底棲生物對鹽度變化的適應(yīng)特點(diǎn)及適應(yīng)機(jī)制是認(rèn)識灘涂生物生態(tài)功能的重要基礎(chǔ)。

翼內(nèi)繭型藻屬于硅藻門(Bacillariophyta)硅藻綱(Bacillariophyceae)雙菱藻目(Surirellales)內(nèi)繭藻科(Entomoneidaceae)翼內(nèi)繭藻屬(Entomoneis)的單細(xì)胞海洋硅藻。由于該藻種多不飽和脂肪酸特別是花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)含量豐富,目前常作為ARA生產(chǎn)的候選藻株[5]。有關(guān)翼內(nèi)繭型藻的研究主要集中在營養(yǎng)[6-8]、光照[6,8]和溫度[8]對其生長速率和代謝產(chǎn)物積累的影響,但關(guān)于翼內(nèi)繭型藻對鹽度的適應(yīng)性研究仍相當(dāng)有限。

黃河三角洲河口灘涂濕地(37°40′N—38°10′N,118°41′E—119°16′E)位于山東省東營市墾利區(qū)黃河入海口,地處渤海與萊州灣的交匯處,是典型的暖溫帶濱海濕地生態(tài)系統(tǒng),景觀類型多樣且生物資源豐富[9-10]。本研究從黃河口灘涂泥樣中分離出11株翼內(nèi)繭型藻,在比較極端鹽度對11株分離藻生長基礎(chǔ)上,分析了不同鹽度對其中3株藻株生長、光合活性及生理生化的影響,其目的是為了了解分離自灘涂的翼內(nèi)繭型藻對鹽度的適應(yīng)性特點(diǎn)以及鹽度對分離藻株生長、光合作用及主要生化組成的影響,為進(jìn)一步探討灘涂底棲微藻的耐鹽機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 微藻分離鑒定

1.1.1 微藻的分離純化 將從黃河口灘涂采取的泥樣平鋪于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中,厚度約0.5 cm,上面覆蓋一層擦鏡紙,擦鏡紙上放置蓋玻片,封口保濕,并將培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),光暗循環(huán)為12 h∶12 h,光照強(qiáng)度為60 μmol·m-2·s-1,誘使底棲藻類因趨光而遷移至蓋玻片。夾取放置48 h的蓋玻片,解剖鏡下初步觀察蓋玻片遷移底棲生物數(shù)量后,并立即移至盛有30 mL f/2液體培養(yǎng)基的三角瓶中,連續(xù)培養(yǎng)2周,培養(yǎng)基逐漸變成黃褐色。吸取80 μL培養(yǎng)液均勻涂布于f/2固體瓊脂培養(yǎng)基上,10 d后平板上開始出現(xiàn)藻落,進(jìn)一步培養(yǎng)3周后挑出單藻落,在盛有1 mL f/2液體培養(yǎng)基的48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待孔板中的藻液有明顯顏色時,吸取藻液,顯微鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài)特征及分離藻株純度。純化藻株接種在盛有60 mL f/2液體培養(yǎng)基的三角瓶中,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度(23±1) ℃,光照強(qiáng)度60 μmol·m-2·s-1,光暗比12 h∶12 h。

光學(xué)顯微鏡下基于細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分離藻的初步鑒定。經(jīng)初步鑒定為與翼內(nèi)繭型藻形態(tài)相似的藻株編號分別為HaB、HaD1、HaE、HaF、HaL、HaI、HsA、HsD1、HsD2、HsA2、HsD3共11株。

1.1.2 分離藻株的分子鑒定 分離藻株的分子鑒定基于18S rDNA和rbcL基因序列特征進(jìn)行。藻株DNA使用E.Z.N.A.RHP Plant DNA Kit試劑盒提取。提取的DNA-20 ℃保存,用于PCR擴(kuò)增。

本實(shí)驗用于擴(kuò)增微藻18S rDNA基因序列的通用引物為V8F(5’ATAACAGGTCTGTGATGCCCT3’)[11]和1510R(5’CCTTCYGCAGGTTCACCTAC3’)[12];用于擴(kuò)增微藻rbcL基因序列的引物為rbcLF(5’ATGTCTCAATCTGTAWCAGAACGGACTC3’)和rbcLR(5’TAARAAWCKYTCTCTCCAACGCA3’)[13]。50 μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中模板DNA 2 μL,一對引物各1 μL,2×TransStartRFastPfu PCR SuperMix 25 μL,ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)在梯度PCR儀上完成,反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min后,94 ℃變性40 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min共35個循環(huán),隨后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,膠回收純化后送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

將測序獲得的分離藻株18S rDNA和rbcL基因序列分別在NCBI(美國國家生物技術(shù)信息中心,National Center for Biotechnology Information)上進(jìn)行BLAST同源性比對,下載相似性大于95%的序列信息用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究利用MEGA11.0軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,通過自舉(Bootstrap)數(shù)據(jù)集1 000次作為置信度檢測。

1.2 鹽度適應(yīng)性分析

為了解分離藻株的鹽度適應(yīng)性,本試驗首先比較了在鹽度為5和80條件下11株分離藻株的生長情況,接種藻密度為1.5×105cell·mL-1。

隨后對其中3株藻株進(jìn)行了鹽度梯度試驗,梯度試驗中鹽度別為5、25、45、65和85。以天然海水(鹽度30)為基礎(chǔ),用NaCl和無菌去離子水調(diào)節(jié)鹽度。考慮到分離藻生長較慢,接種藻密度調(diào)整為3.0×105cell·mL。在9 d的鹽度梯度實(shí)驗期間,比較不同鹽度條件下3株藻株的生長、光合能力及主要生化組分的變化。其中,生長比較采用每天測定藻細(xì)胞密度,計算并比較微藻的比生長速率。光合能力比較采用每天分析培養(yǎng)微藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和ETRm來評估。生化組分的分析則在培養(yǎng)實(shí)驗結(jié)束時收集藻液,5 000g離心10 min,蒸餾水沖洗藻泥,重復(fù)離心3次,放入真空冷凍干燥機(jī)(Christ,德國)凍干成藻粉,分析藻粉中總脂和多糖含量。光合色素在培養(yǎng)至第9天時取藻液10 mL采用熱乙醇法提取。具體分析方法如下:

1.2.1 微藻生長速率計算 每天定時取樣,基于血球計數(shù)板法測定藻細(xì)胞生長密度。基于細(xì)胞密度的變化,計算比生長速率,比生長速率根據(jù)公式μ=(lnNt-lnN0)/t計算[14],式中,t為培養(yǎng)天數(shù),Nt為第t天細(xì)胞密度值,N0為初始細(xì)胞密度值。

1.2.2 光合潛力分析 每天定時取2 mL藻液進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測量,測量前將微藻樣品暗適應(yīng)20 min,使用脈沖振幅調(diào)制熒光劑(Water-PAM fluorometer,Walz,Effeltrich, Germany)測定不同鹽濃度下藻細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm(PSII的最大光化學(xué)效率)和ETRm(電子傳遞速率最大值)的變化。

光列表參數(shù)設(shè)定為5、8、13、19、28、43、63、97、144、205、284、464、679 μmol/(m2·s),共12個梯度。Fv/Fm值可直接在儀器上讀出,ETRm值則基于擬合方程ETRm=Ps×[α/(α+β)]×[β/(α+β)]β/α計算[15],式中:α為初始斜率;β為光抑制系數(shù);Ps為最大潛在電子傳遞速率。

1.2.3 總脂含量分析 采用重量法測定總脂含量[16]。稱取15 mg經(jīng)真空冷凍干燥后的藻粉(m0),加入2 mL氯仿和1 mL甲醇,渦旋震蕩15 min,搖床震蕩12 h,8 000g離心10 min,收集上層提取液。下層沉淀重復(fù)以上操作。合并2次提取液,加入0.9%NaCl溶液,體積比為5∶1。將混合液漩渦5 min后靜置15 min,分層后收集下層氯仿層,使用10 mL一次性注射器和0.22 μm有機(jī)濾器將氯仿層抽濾到新的離心管中(m1),55 ℃水浴蒸去溶劑氯仿,60 ℃烘干至恒重。稱量所得油脂(m2),通過下列公式計算總脂含量:總脂=(m2-m1)/m0×100%。

1.2.4 光合色素含量分析 采用熱乙醇法[17]測定色素含量。用GF/C玻璃纖維素膜(直徑47 nm,孔徑0.45 μm)收集10 mL藻液,棄濾液,將濾膜外包一層錫箔紙置冰箱-20 ℃條件下暗處理12 h,加入體積分?jǐn)?shù)為95%、80 ℃預(yù)熱的乙醇5 mL,置于80 ℃水浴鍋中2 min,避光靜置6 h進(jìn)行萃取,以3 300g離心10 min,用分光光度計(UV-8000,Metash,上海,中國)測定上清液在480、510、630、664、710 nm處的光密度值(OD值),通過下列公式計算葉綠素[18]和類胡蘿卜素[19]含量。葉綠素a=13.7×OD664-5.76×OD630;類胡蘿卜素=(1 000×OD480-2.05×Chla)/245。

1.2.5 多糖含量分析 采用苯酚-硫酸法[20]測定可溶性多糖含量。準(zhǔn)確稱取5 mg經(jīng)真空冷凍干燥后的藻粉,加入5 mL 0.05 mol/L硫酸,65 ℃抽提1 h,8 228g離心10 min,收集上清液,下層沉淀重復(fù)以上操作。隨后,將1 mL多糖抽提液中加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸并渦旋30 s混勻,室溫放置30 min,以1 mL 6%苯酚溶液與5 mL濃硫酸做參比,使用分光光度計(UV-8000,Metash,上海,中國)在 490 nm 處測量吸光值,通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總多糖濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖,Excel 2010和 SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較分析,P<0.05表示不同處理間具有顯著性差異。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 微藻分離與鑒定

光鏡下分離的11株藻細(xì)胞均呈黃褐色(見圖1),單個細(xì)胞形狀相似,分別呈橢圓形或葫蘆型。每個藻細(xì)胞含2個褐棕色色素體,細(xì)胞長在21～30 μm之間,中央收縮部位寬在5～10 μm之間,最寬部位寬在7～15 μm之間?；谛螒B(tài)特征,初步鑒定分離藻株可能屬于翼內(nèi)繭型藻屬。

(A:HaB; B:HaF; C:HaI; D:HaD1;E:HaE; F:HaL; G:HsD2; H:HsD1; I:HsA2; J:HsD3; K:HsA。)

使用通用引物擴(kuò)增11株分離藻細(xì)胞的18S rDNA和rbcL的部分序列,結(jié)果獲得的18S rDNA和rbcL序列長度分別在700和610 bp左右。BLAST同源性搜索結(jié)果顯示,有23株硅藻的18S rDNA基因序列和rbcL基因序列與11株分離藻的擴(kuò)增序列的相似度達(dá)到95%以上?；讷@得的23株硅藻的18S rDNA和rbcL序列與11個藻株的相應(yīng)擴(kuò)增序列,以小麥(Triticummonococcum)相應(yīng)序列為外類群,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

基于18S rDNA構(gòu)建的NJ樹如圖2所示,本研究中11株分離藻與翼內(nèi)繭型藻(Entomoneissp.)聚為一支?；趓bcL構(gòu)建的NJ樹如圖3所示,分離藻株HaF、HaL、HaI、HsD1、HaE、HsD2、HsD3、HaB、HsA和HsA2仍然與Entomoneissp.完全聚為一支,獲得了100%的支持率。而分離藻株HaD1與Entomoneisinfula的2個藻株聚為一支,獲得了99%的支持率。結(jié)果表明,分離藻株HaD1屬于Entomoneisinfula,而其余10株分離藻株屬于翼內(nèi)繭型藻屬(Entomoneissp.)。

圖2 基于18S rDNA序列構(gòu)建11株分離藻株與相似種的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于rbcL序列構(gòu)建11株分離藻株與相似種的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 分離藻株的鹽度適應(yīng)性分析

2.2.1 分離藻株在極端鹽度下的生長狀況 11株分離藻株在極端鹽度下的生長情況見表1。表1顯示,11株翼內(nèi)繭型藻在2個極端鹽度條件下均能生長,如11株藻株,在鹽度為5的低鹽條件下,最大的藻細(xì)胞密度在1.66×105～13.00×105cell/mL之間,而在鹽度為80的高鹽條件下最大的藻細(xì)胞密度在2.80×105～8.00×105cell/mL之間。但同時也看到同一藻株對2個極端鹽度的耐受性存在顯著差別。如在低鹽條件下,HaI、HaB和HaF藻株的比生長速率分別為0.432、0.428和0.305 d-1,但在高鹽條件下,3個分離藻株的比生長速率則分別為0.151、0.335和0.309 d-1。在2個鹽度條件下,HaF藻株的比生長速率基本一致,而HaI藻株的比生長速率則相差1.86倍。

表1 11株翼內(nèi)繭型藻在低鹽5和高鹽80下比生長速率及最大藻細(xì)胞密度

進(jìn)一步比較不同藻株對同一鹽度的耐受性,結(jié)果顯示不同藻株對同一鹽度的耐受性存在顯著差異(p<0.05)。在鹽度5條件下,HaI藻株的比生長速率最大,為0.432 d-1,HaB藻株的比生長速率其次,為0.428 d-1,而HaL藻株的比生長速率最低,為0.021 d-1,HaI、HaB藻株與HaL藻株相比,比生長速率均相差20倍以上。而在鹽度80條件下,HaB藻株的比生長速率最大,為0.335 d-1,HaF藻株的比生長速率其次,為0.309 d-1,HsA2藻株的比生長速率最低,為0.124 d-1,HaB、HaF藻株與HsA2藻株相比,比生長速率分別相差1.70和1.50倍?；?1株分離藻株在2個極端鹽度的比生長速率,并考慮到藻株培養(yǎng)在f/2培養(yǎng)基上細(xì)胞密度的增長情況,篩選出低鹽5培養(yǎng)條件下比生長速率最高的藻株HaI、高鹽80培養(yǎng)條件下比生長速率次高的藻株HaF和兩個極端培養(yǎng)條件下比生長速率均高的藻株HaB,這些藻株用于進(jìn)一步比較鹽度對翼內(nèi)繭型藻光合能力及生化成分積累能力的影響。

2.2.2 3株篩選藻株生長的最適鹽度比較 圖4為篩選藻株HaF、HaI和HaB在不同鹽度條件下的比生長速率。圖4顯示,當(dāng)初始接種密度從1.5×105cell/mL增加至3.0×105cell/mL時,3株分離藻在鹽度5時,比生長速率均分別從0.305、0.432和0.428 d-1降至0.121、0.183和0.165 d-1。當(dāng)鹽度增至25時,3個分離藻株的比生長速率均急劇升高,其中HaF藻株和HaI藻株比生長速率達(dá)到最大值,分別為0.411和0.233 d-1。隨著鹽度增加,HaF藻株和HaI藻株比生長速率均逐漸降低,當(dāng)鹽度為85時,其比生長速率分別只有0.159和0.092 d-1。而HaB藻株的比生長速率則在鹽度為45時達(dá)到最大值,為0.322 d-1。說明高鹽和低鹽環(huán)境對3個分離藻株的生長均造成了顯著的抑制效應(yīng),3株藻生長的最適鹽度分別是25、25和45。

圖4 鹽度對HaF、HaI和HaB比生長速率的影響

進(jìn)一步比較3個藻株在5個鹽度條件下比生長速率的變化,結(jié)果顯示,HaF藻株的比生長速率在0.121～0.411 d-1之間,HaI藻株比生長速率在0.092～0.233 d-1之間,HaB藻株的比生長速率在0.166～0.322 d-1之間。相對而言,在5個試驗鹽度下,HaB藻株比生長速率均比較高,說明該藻株對鹽度的適應(yīng)能力更強(qiáng)。

2.2.3 鹽度對3株翼內(nèi)繭型藻光合活性的影響 圖5a—5f顯示鹽度對3株翼內(nèi)繭型藻光合潛力的影響。單因子方差分析結(jié)果表明,整個培養(yǎng)周期中,不同鹽度組對葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和ETRm均有顯著影響(p<0.05)。

圖5 不同鹽度對HaF藻株(a和b)HaI藻株(c和d)和HaB藻株(e和f)的Fv/Fm和ETRm值的影響

不同鹽度下HaF藻株葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化如圖5a和5b所示。從圖5a中可以看到,培養(yǎng)的第2天,鹽度5、45、65和85實(shí)驗組Fv/Fm均達(dá)到最大值,分別為0.621、0.664、0.656和0.631,培養(yǎng)的第3天,鹽度25實(shí)驗組Fv/Fm達(dá)到最大值,為0.649。隨后5個實(shí)驗組均呈逐漸下降的趨勢,培養(yǎng)末期Fv/Fm值與各實(shí)驗組的峰值相比,分別下降了41.46%、12.47%、25.51%、20.14%和24.95%。從圖5b中可以看到,培養(yǎng)的第2天,鹽度5、65實(shí)驗組的ETRm值均達(dá)到最大值,培養(yǎng)的第3天,鹽度25、45、85實(shí)驗組的ETRm值均達(dá)到最大值,隨后5個實(shí)驗組均呈逐漸下降的趨勢。至培養(yǎng)末期,鹽度5實(shí)驗組的Fv/Fm和ETRm值均顯著低于鹽度25、鹽度45、鹽度65和鹽度85組。

不同鹽度下HaI藻株葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化如圖5c和5d所示。從圖5c中可以看到,5個實(shí)驗組中,Fv/Fm最大值分別為0.678、0.667、0.663、0.628、0.598,低鹽實(shí)驗組Fv/Fm值大于高鹽實(shí)驗組。從圖5d中可以看到在鹽度5～85培養(yǎng)條件下,HaI藻株的ETRm數(shù)值也隨著鹽度升高而呈降低的趨勢。至培養(yǎng)末期,鹽度85實(shí)驗組的Fv/Fm和ETRm值均顯著低于鹽度5、鹽度25、鹽度45和鹽度65組。

不同鹽度下HaB藻株葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化如圖5e和5f所示。從圖5e中可以看到5個實(shí)驗組中Fv/Fm最大值分別為0.643、0.656、0.669、0.657和0.651,最高值出現(xiàn)在鹽度45實(shí)驗組;而從圖5f中可以看到ETRm最高值出現(xiàn)在鹽度25實(shí)驗組,但不同實(shí)驗組差別不大,反映出鹽度對HaB藻株光合潛力的影響不大。

2.2.4 不同鹽度對3株藻生化組分的影響 表2顯示鹽度對HaF、HaI和HaB藻株總脂、多糖、葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響。單因子方差分析結(jié)果表明,不同鹽度組對3株分離藻生化組分含量均有顯著影響(p<0.05)。

表2 不同鹽度培養(yǎng)下HaF、HaI、HaB生化組分的變化

3個實(shí)驗藻株總脂含量的最高值均出現(xiàn)在鹽度5實(shí)驗組,分別為68.231%、60.125%和63.324%。HaF和HaI藻株總脂含量的最低值均出現(xiàn)在鹽度25實(shí)驗組,分別為37.422%和45.168%,HaB藻株總脂含量的最低值出現(xiàn)在鹽度45實(shí)驗組,為36.523%。出現(xiàn)最低總脂含量的實(shí)驗組鹽度恰好是各分離藻株比生長速率最高的鹽度。

但與總脂含量的變化相反,3個實(shí)驗藻株多糖含量的最低值均出現(xiàn)在鹽度5實(shí)驗組,最高值均出現(xiàn)在鹽度85實(shí)驗組,3個藻株多糖含量的最高值分別比最低值高92.75%、32.74%和44.24%。

3個分離藻株各鹽度實(shí)驗組的光合色素含量最高值及最低值均與藻株比生長速率最高值和最低值的實(shí)驗鹽度相一致。如HaF和HaI藻株葉綠素a和類胡蘿卜素含量的最大值均出現(xiàn)在鹽度25實(shí)驗組中,HaF藻株分別為3.731和1.472 μg/mL,HaI藻株分別為3.228和0.926 μg/mL,最低值均出現(xiàn)在鹽度5和85極端鹽度的實(shí)驗組。2個藻株在2個極端鹽度實(shí)驗組的葉綠素a和類胡蘿卜素含量均有顯著差異,如鹽度5實(shí)驗組,HaF藻株的葉綠素a和類胡蘿卜素分別為0.433和0.124 μg/mL,而HaI藻株的葉綠素a和類胡蘿卜素分別為1.053和0.354 μg/mL;HaF藻株鹽度25實(shí)驗組的葉綠素a和類胡蘿卜素含量分別比鹽度5實(shí)驗組高7.62倍和10.87倍。但是HaB藻株2種色素含量的最大值均出現(xiàn)在鹽度45實(shí)驗組,分別為3.507和1.372 μg/mL,最低值僅出現(xiàn)在5實(shí)驗組,分別為0.878和0.291 μg/mL。鹽度45實(shí)驗組藻株的葉綠素a和類胡蘿卜素含量分別比鹽度5實(shí)驗組的高2.99倍和3.72倍,比較而言,HaB藻株對高鹽度有更強(qiáng)的耐受性。

3 討論

18S rDNA、28S rDNA、ITS、rbcL、psbA以及COI是常用的用于鑒定硅藻物種的分子標(biāo)記[21],多標(biāo)記組合使用已經(jīng)成為微藻分子生物學(xué)鑒定的常見方法,龔少華等[22]推薦使用rbcL-3P、5.8S rDNA和ITS2組合用于硅藻物種的種屬鑒定。郭立亮等[23]以18S rDNA、ITS、UPA、COI和rbcL5個標(biāo)記作為硅藻物種鑒定的分子生物學(xué)標(biāo)簽進(jìn)行有效性評估,發(fā)現(xiàn)18S rDNA和rbcL對硅藻物種的區(qū)分度效果最好。本研究采取18S rDNA和rbcL兩個分子標(biāo)記相組合,將分離藻株擴(kuò)增序列與其相似性最高的翼內(nèi)繭型藻屬的其他微藻種的相應(yīng)序列進(jìn)行比對,結(jié)果顯示,分離藻株與翼內(nèi)繭型藻屬存在更近的親緣關(guān)系。

已有研究顯示,鹽度影響著硅藻物種的生態(tài)位[24-25]。本研究分離的藻株采自黃河口灘涂,受季節(jié)性降雨以及上游淡水注入,加之灘涂水分蒸發(fā),灘涂鹽度處于頻繁的變化之中。結(jié)合黃河口灘涂鹽度變化范圍[24],本研究初篩實(shí)驗鹽度為5和80,研究結(jié)果表明,11株分離藻株在2個極端鹽度下生長狀況差異顯著,其中鹽度5培養(yǎng)條件下,有8株分離藻的最大藻細(xì)胞密度和比生長速率在7.0×105cell/mL和0.330 d-1以上,但在鹽度80培養(yǎng)條件下,只有2株分離藻的最大藻細(xì)胞密度和比生長速率在7.0×105cell/mL和0.330 d-1以上,這說明本研究分離的多數(shù)藻株對低鹽的適應(yīng)能力普遍強(qiáng)于對高鹽的適應(yīng)能力。

關(guān)于翼內(nèi)繭型藻對鹽度的適應(yīng)性研究,Yamamoto等[14]發(fā)現(xiàn)翼內(nèi)繭型藻(Entomoneisjaponica)在2～30鹽度范圍內(nèi)比生長速率從0.151 d-1上升到0.232 d-1,鹽度30時,其比生長速率達(dá)到最高值,鹽度50時比生長速率下降至0.074 d-1,幾乎停止生長。本研究將3株翼內(nèi)繭型藻分別培養(yǎng)在5～85實(shí)驗鹽度下,3株藻均可以生長,如在鹽度5～45培養(yǎng)條件下,HaB藻株的比生長速率從0.166 d-1上升到0.323 d-1,而在鹽度45～85培養(yǎng)條件下其比生長速率從0.323 d-1下降至0.219 d-1。相對而言,從黃河口灘涂上分離的翼內(nèi)繭型藻藻株對鹽度具有比較突出的適應(yīng)性能力。

光合色素含量的高低與光合能力的強(qiáng)弱正相關(guān),生長狀況越好的藻體光合色素含量越高[26-27]。本研究結(jié)果顯示HaF、HaI和HaB藻株光合色素(葉綠素a和類胡蘿卜素)含量最高值時的實(shí)驗鹽度均與其生長的最適鹽度完全一致,說明鹽度對實(shí)驗微藻光合能力的影響也與其對光合色素合成的影響有關(guān)。本研究葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETRm和Fv/Fm的分析結(jié)果顯示,HaF藻株在鹽度為5的培養(yǎng)條件下Fv/Fm和ETRm值均顯著降低,說明在低鹽條件下HaF藻株的光合能力受到顯著抑制。HaI藻株Fv/Fm和ETRm值均在鹽度為5的培養(yǎng)條件下達(dá)到最大值,這一方面說明HaI藻株對低鹽環(huán)境具有較高的耐受性,低鹽脅迫對HaI藻株的光合能力具有一定的刺激作用。HaB藻株在5個不同實(shí)驗組Fv/Fm和ETRm差別不大,這表明鹽度變化對HaB藻株光合能力影響不大。 張奇等[28]發(fā)現(xiàn),在鹽度0～50條件下培養(yǎng)小球藻,鹽度為0實(shí)驗組中小球藻藻液的溶氧量最低,藻液中溶氧量降低不僅與小球藻光合作用降低有關(guān),也與呼吸耗氧增強(qiáng)有關(guān)。Hagemann等[29]發(fā)現(xiàn),低鹽條件下呼吸作用產(chǎn)生的 ATP增多,用于在鹽適應(yīng)過程中為 P 型 ATP 酶或其他需要能量的過程提供能量。Billini 等[30]發(fā)現(xiàn)Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在低鹽培養(yǎng)基中可能是離子穩(wěn)態(tài)所必需的。這些結(jié)果表明,鹽度脅迫可增強(qiáng)呼吸作用,從而為相關(guān)耗能的生理活動提供必需的能量需求。本研究HaI藻株在鹽度5實(shí)驗組光合潛力最高,但藻細(xì)胞生長較慢,生物量積累有限,這可能與鹽度為5時,HaI藻株呼吸作用增強(qiáng),為平衡低鹽脅迫而耗能過高有關(guān)。這些結(jié)果同時說明3株翼內(nèi)繭型藻藻株對鹽度脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制存在明顯不同。

關(guān)于翼內(nèi)繭型藻培養(yǎng)條件改變對生化組分積累的影響,Thierry等[7]發(fā)現(xiàn)翼內(nèi)繭型藻(E.paludosa)在硅限制培養(yǎng)條件下細(xì)胞總脂含量最高,為59%,與對照組相比總脂含量提高了63%。本研究結(jié)果顯示,HaF、HaI和HaB藻株3株翼內(nèi)繭型藻均在鹽度5的培養(yǎng)條件下總脂含量最高,分別為68.231%、60.125%和63.324%,而在優(yōu)化的鹽度下總脂含量最低,總脂含量最高值與最適鹽度實(shí)驗組相比,分別提高了82.33%、33.12%和3.38%。García等[31]也發(fā)現(xiàn)在低鹽度時T.weissflogii的脂質(zhì)含量最高。李嘉穎等[32]發(fā)現(xiàn)在鹽度0～30培養(yǎng)范圍內(nèi)淡水柵藻細(xì)胞總脂與多糖含量變化趨勢一致,隨鹽度的升高其含量逐漸降低,而本實(shí)驗中3株分離藻株多糖與總脂含量的變化趨勢相反,鹽度為5時,總脂含量最高而多糖含量最低,可見不同藻種的生化合成能力對鹽度變化的反應(yīng)是不同的。推測低鹽下積累總脂、高鹽下合成多糖可能是黃河口灘涂底棲翼內(nèi)繭型藻應(yīng)對鹽度波動的適應(yīng)方式。

4 結(jié)語

本文利用平板涂布方法從黃河口灘涂泥樣中分離出底棲微藻,經(jīng)18S rDNA和rbcL兩個分子標(biāo)記組合鑒定其中11株為翼內(nèi)繭型藻,隨后主要研究了不同鹽度培養(yǎng)條件對分離藻株生長速率、光合潛力和生化組分積累的影響。研究結(jié)果表明,河口灘涂上分離的翼內(nèi)繭型藻藻株對鹽度具有突出的適應(yīng)性能力,實(shí)驗鹽度下都可以生長,但同時也看到不同藻株的最適生長鹽度不同,光合潛力也存在顯著變化,這表明分離藻株鹽度適應(yīng)性存在差異。不同鹽度培養(yǎng)條件下,多糖含量均表現(xiàn)出隨鹽度增加而上升的現(xiàn)象,最大值出現(xiàn)在高鹽實(shí)驗組,而總脂含量最大值出現(xiàn)在低鹽實(shí)驗組,3株代表性藻株的色素含量均與比生長速率的變化趨勢一致。這表明光合色素的高低與藻體生長狀態(tài)呈正相關(guān),同時低鹽積累總脂,高鹽分泌多糖可能是黃河口灘涂底棲硅藻應(yīng)對鹽度波動的良好策略。