王 俊 劉 力 徐穎君 劉俊杰 程 波 張 蒙 龐少臣** 梁 勇 宋茂勇,3

（1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，武漢，430205；2.江漢大學(xué)持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境與健康學(xué)院，武漢，430056；3.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境納米技術(shù)與健康效應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100085）

1 化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新需求（Current requirements of chemicals risk assessment）

截至2022年美國(guó)化學(xué)文摘社（Chemical Abstracts Service,CAS）登記的現(xiàn)有化學(xué)品已達(dá)1.95 億種，且每日有數(shù)千種新開發(fā)的化學(xué)品登記入冊(cè).全球化學(xué)品管理計(jì)劃，如《經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織高產(chǎn)量化學(xué)品》（OECD High Production Volume Chemicals）、《美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局高產(chǎn)量化學(xué)品挑戰(zhàn)》（United States Environmental Protection Agency High Production Volume Challenge）和歐盟《關(guān)于化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、授權(quán)和限制的規(guī)定》（Registration,Evaluation,Authorization and Restriction of Chemicals,REACH）等，都推出了“無(wú)數(shù)據(jù)，無(wú)市場(chǎng)”的指令，強(qiáng)制要求只有已知生態(tài)毒理學(xué)特性的化學(xué)品才會(huì)被授權(quán)商業(yè)化和引入市場(chǎng)[1?2].化學(xué)品毒性安全評(píng)估一般通過哺乳動(dòng)物毒性測(cè)試來(lái)實(shí)現(xiàn)，一種新藥的開發(fā)也需要大量哺乳動(dòng)物開展安全性評(píng)估.然而，隨著全球化學(xué)品的不斷增加和測(cè)試要求的不斷提高，傳統(tǒng)的毒性分析方法不僅存在成本高昂、效率低以及低劑量效應(yīng)難以識(shí)別等問題，還面臨無(wú)法提供化學(xué)品發(fā)揮毒性的機(jī)理信息，在跨劑量、物種和生命階段的數(shù)據(jù)外推中存在不確定性等困境[3?4].并且，傳統(tǒng)的基于哺乳動(dòng)物的毒性評(píng)價(jià)方式不符合“減少，替代，優(yōu)化”的“3R”（Replacement,Reduction,Refinement）原則.因此，美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)提出了21 世紀(jì)毒性測(cè)試的新框架，呼吁利用現(xiàn)代計(jì)算化學(xué)、分子與細(xì)胞生物學(xué)工具加速發(fā)展以高通量體外測(cè)試和非哺乳類動(dòng)物模型替代方法為主的毒性評(píng)價(jià)新模式[5].模式生物斑馬魚作為優(yōu)秀的脊椎動(dòng)物模型，已經(jīng)成為化學(xué)品毒性評(píng)價(jià)的強(qiáng)大工具[6?7].

2 斑馬魚是高通量的藥物篩選和化學(xué)品毒性測(cè)試中重要的動(dòng)物模型（Zebrafish is an important animal model in high-throughput drugs screening and chemicals toxicity testing）

斑馬魚（Daniorerio）是分布于南亞地區(qū)溪流中的一種身體略呈紡錘形，頭小而稍尖，全身布滿深藍(lán)類似斑馬縱紋的熱帶魚類.斑馬魚的胚胎在體外快速發(fā)育，通體透明，易于觀察形態(tài)發(fā)生和器官形成的過程，是研究脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的理想模型.斑馬魚的大規(guī)模遺傳篩選研究獲得了大量基因突變體，并確定了這些突變基因在胚胎發(fā)育中的功能，揭開了斑馬魚可以用于基因、基因組學(xué)和脊椎動(dòng)物發(fā)育過程研究的序幕[8?10].斑馬魚和人類基因組有70%同源性，80%的人類疾病相關(guān)基因與斑馬魚具有同源性[11?12].斑馬魚與人類的生理組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號(hào)、分子功能和調(diào)控過程具有進(jìn)化上的保守相似性[13].斑馬魚已經(jīng)成為人類疾病的強(qiáng)大臨床前模型，被用于各種癌癥、腎臟疾病、心血管疾病、血液疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病及治療藥物的研究[14].

斑馬魚作為藥物活性高通量篩選的脊椎動(dòng)物模型，在人類臨床候選藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮重要作用[15].2000年，人們證明通過直接在培養(yǎng)液中加入少量化合物，就可以在96 孔板中使用斑馬魚進(jìn)行藥物篩選[16].斑馬魚胚胎體型微小，胚胎能在24、48、96 甚至384 孔板中培養(yǎng)，使得高通量地開展實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)成為可能.斑馬魚飼養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，其對(duì)水質(zhì)要求不苛刻，成本低廉，大大降低高通量篩查的成本.根據(jù)歐盟動(dòng)物保護(hù)法，受精5 d 以內(nèi)的斑馬魚胚胎或幼魚不屬于動(dòng)物保護(hù)范疇，可以替代哺乳動(dòng)物測(cè)試，這使得斑馬魚胚胎的使用符合3R 原則.斑馬魚胚胎及幼魚透明或半透明的特性為光學(xué)成像提供便利，允許通過高通量成像技術(shù)對(duì)細(xì)胞、組織和器官等評(píng)價(jià)終點(diǎn)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)測(cè)量，以獲取大量生物表型數(shù)據(jù).另外，斑馬魚遺傳操作方便，已經(jīng)建立了許多細(xì)胞或組織特異性標(biāo)記和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)告的遺傳品系[17]，這些品系不僅可用于表型數(shù)據(jù)的成像記錄，還可用于活體水平的機(jī)制研究.目前，研究人員廣泛使用斑馬魚開展藥物的高通量篩選，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)百個(gè)小分子藥物在魚類和人類中具有保守的生物活性，其中部分藥物還進(jìn)入了臨床轉(zhuǎn)化研究[18].

斑馬魚在藥物活性發(fā)現(xiàn)中的出色表現(xiàn)，為其在化學(xué)品毒性高通量篩查方面應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).斑馬魚作為毒性評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型，早期更多應(yīng)用于環(huán)境污染物的毒性評(píng)價(jià).斑馬魚是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織推薦的化學(xué)品危害及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的常規(guī)測(cè)試魚種，被廣泛應(yīng)用于急性毒性、內(nèi)分泌干擾、發(fā)育毒性、生殖毒性和遺傳毒性的測(cè)試和評(píng)價(jià).在美國(guó)環(huán)保署開展的ToxCast 化學(xué)品毒性測(cè)試項(xiàng)目中，斑馬魚和多種體外細(xì)胞模型被用于化學(xué)品的高通量毒性測(cè)試[3].該項(xiàng)目根據(jù)所獲得的化學(xué)品生物活性和體外特征建立動(dòng)物體內(nèi)毒性效應(yīng)和表型的預(yù)測(cè)方法，為識(shí)別更多潛在有毒化學(xué)品奠定基礎(chǔ).ToxCast Ⅰ和Ⅱ項(xiàng)目利用的斑馬魚毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn)包括死亡率、孵化率和畸形率，這些毒性數(shù)據(jù)能夠?yàn)榛瘜W(xué)品毒性評(píng)估的優(yōu)先排序提供幫助[19].斑馬魚的發(fā)育毒性測(cè)試正在成為登記化學(xué)品致畸性評(píng)估的替代方法被應(yīng)用于藥物安全性評(píng)價(jià)[20].在藥物研發(fā)前期盡早地識(shí)別有毒的候選藥物能夠極大降低后續(xù)研發(fā)中斷導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，這使得利用高通量技術(shù)分析候選藥物對(duì)特定器官毒性的研究興趣不斷增加.近年來(lái)，利用斑馬魚模型開展神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝臟和耳聽力等方面高通量毒性評(píng)價(jià)的研究取得許多新進(jìn)展[21].

斑馬魚作為一個(gè)整體動(dòng)物其分析通量低于培養(yǎng)細(xì)胞.但是，斑馬魚比細(xì)胞具有更高的生物學(xué)相關(guān)性和生理復(fù)雜度，可以提供單細(xì)胞無(wú)法提供的多細(xì)胞生物的動(dòng)態(tài)、互動(dòng)和多器官事件（圖1），可以繞過體外數(shù)據(jù)向體內(nèi)轉(zhuǎn)化的障礙.雖然斑馬魚與人類的相關(guān)性低于小鼠，但是利用斑馬魚模型可實(shí)現(xiàn)高通量的生物分析，獲取大量的數(shù)據(jù)（圖1）[22].斑馬魚既有生物相關(guān)性和復(fù)雜度又具有一定的分析通量，是細(xì)胞與哺乳類動(dòng)物模型之間的橋梁[21].因此，斑馬魚是21 世紀(jì)毒性測(cè)試中重要的非哺乳類動(dòng)物替代模型.

圖1 斑馬魚在化學(xué)品高通量毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用（A）由于斑馬魚既有生物復(fù)雜度又具一定的分析通量，它在高通量的藥物篩選和化學(xué)品毒性測(cè)試中具有獨(dú)特的位置；（B）斑馬魚在化學(xué)品高通量毒性評(píng)價(jià)中的主要應(yīng)用方向，包括發(fā)育毒性、神經(jīng)行為毒性、心血管毒性、內(nèi)分泌干擾毒性、肝臟毒性和耳毒性等方面的評(píng)價(jià).Fig.1 High-throughput toxicity testing of chemicals in zebrafish（A）Zebrafish has a unique position in high-throughput drugs screening and chemicals toxicity testing due to its relative biological complexity and analytical throughput.（B）The main application directions of zebrafish in high-throughput toxicity testing includes assessment of developmental toxicity,neurobehavior behavior toxicity,cardiovascular toxicity,endocrine disrupting toxicity,hepatotoxicity and ototoxicity

3 斑馬魚高通量毒性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展（Advances in high-throughput toxicity assessment by zebrafish）

斑馬魚幼魚體長(zhǎng)為3—5 mm，可以在多孔板中培養(yǎng)和暴露，發(fā)育的前5 d 通過自身的卵黃獲取營(yíng)養(yǎng)，這些特性為高通量實(shí)驗(yàn)和分析提供了便利.斑馬魚受精后發(fā)育至24 hpf（hours post fertilization）所有器官原基基本形成；發(fā)育至48—72 hpf，除了消化系統(tǒng)外的大部分器官發(fā)育完全；發(fā)育至76 hpf，肝臟、胰腺和腸道發(fā)育完全；發(fā)育至96 hpf，胃腸道發(fā)育完全；發(fā)育至5 dpf（days post fertilization），所有器官基本發(fā)育完全[21].斑馬魚作為一種完整脊椎動(dòng)物的模型，被廣泛應(yīng)用于藥物和環(huán)境污染物的急性毒性、胚胎發(fā)育毒性和神經(jīng)行為毒性的高通量篩查.近年來(lái)一些特定器官的毒性評(píng)價(jià)如心血管發(fā)育、肝毒性、耳毒性和腎臟發(fā)育毒性等評(píng)估模型持續(xù)發(fā)展.以下本文將總結(jié)斑馬魚高通量毒性測(cè)試在藥物毒性預(yù)測(cè)和化學(xué)品毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中應(yīng)用的研究進(jìn)展.

3.1 發(fā)育毒性

發(fā)育毒性和致畸性測(cè)試是化學(xué)品安全性評(píng)估的重要部分，這類測(cè)試通常是在哺乳動(dòng)物中評(píng)估化學(xué)品對(duì)母體和胎兒的毒性.由于成本低、操作簡(jiǎn)單和效率高的優(yōu)勢(shì)，斑馬魚胚胎越來(lái)越多地被用于化學(xué)品的致畸性安全評(píng)價(jià).許多研究機(jī)構(gòu)和藥物公司利用斑馬魚胚胎開發(fā)了致畸性的分析方法和定量預(yù)測(cè)模型[23?29].這些方法一般在4—6 hpf 開始暴露胚胎并持續(xù)至120 hpf，毒性評(píng)價(jià)的終點(diǎn)包括死亡率、孵化率和畸形情況，其中畸形的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括脊柱、腦部、眼睛、耳、下顎、心臟、體節(jié)、脊索、魚鰭、魚鰾等器官的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和形態(tài)，以及活動(dòng)能力、心臟和血液的循環(huán)功能、色素形成、水中的姿態(tài)等，最后根據(jù)濃度-效應(yīng)曲線、畸形指數(shù)或半最大活性濃度判定陽(yáng)性.這些方法與哺乳動(dòng)物發(fā)育毒性研究結(jié)果有很好的一致性，一些實(shí)驗(yàn)室的一致性能夠達(dá)到87%[24]，最低的也能達(dá)到62%[25].由于許多化學(xué)品在不同物種中引起的毒性結(jié)局不同，因此不同動(dòng)物模型的毒性評(píng)價(jià)結(jié)論普遍存在差異.例如，ToxCast 項(xiàng)目中214 種化學(xué)品的發(fā)育毒性測(cè)試結(jié)論在斑馬魚與小鼠（52%）、小鼠與家兔（58%）、家兔和斑馬魚（47%）中的一致性約為50%[30].小鼠（55%）、大鼠（61%）和家兔（58%）單獨(dú)對(duì)120 種致畸性藥物的陽(yáng)性識(shí)別率約為60%，大鼠和家兔組合以后的識(shí)別率可達(dá)到100%[31].另外，嚙齒動(dòng)物和非嚙齒哺乳動(dòng)物模型分別單獨(dú)預(yù)測(cè)上百種已知具有人體毒性的藥物的識(shí)別率僅為71%[32].因此，斑馬魚胚胎是非常有價(jià)值的發(fā)育毒性預(yù)測(cè)模型，正被探討可作為哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育毒性測(cè)試的替代方法用于特殊情況下的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)管[21].另外，不同實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)的差異反映出不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、檢測(cè)終點(diǎn)、畸形指數(shù)計(jì)算方法和陽(yáng)性閾值劃定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)毒性評(píng)估結(jié)論的影響.例如，有些實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為去除絨毛膜暴露增加了毒性反應(yīng)的敏感性[33]，但另一些研究人員認(rèn)為去除絨毛膜增加了復(fù)雜性和不確定性.因此，未來(lái)迫切需要科學(xué)團(tuán)體協(xié)作建立一個(gè)被廣泛接受的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn).目前，已經(jīng)有研究人員對(duì)暴露胚胎形態(tài)學(xué)改變的統(tǒng)一描述術(shù)語(yǔ)提供了建議[34].多個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合梳理出一些導(dǎo)致斑馬魚發(fā)育毒性測(cè)試產(chǎn)生性能差異的影響因素，以尋求當(dāng)前最佳的測(cè)試實(shí)施方案[35?36].

3.2 神經(jīng)行為毒性

神經(jīng)毒性測(cè)試評(píng)估化學(xué)品對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的病理學(xué)和神經(jīng)行為改變，是對(duì)化學(xué)品基本毒性數(shù)據(jù)的補(bǔ)充.神經(jīng)行為不僅能夠反映神經(jīng)系統(tǒng)在分子、細(xì)胞和器官層面的結(jié)構(gòu)完整性，而且能夠綜合指示神經(jīng)系統(tǒng)的功能，因而是神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)的重要組成部分[37].斑馬魚具有豐富且穩(wěn)定的可測(cè)量的行為模式，包括運(yùn)動(dòng)、探索、焦慮、驚嚇、認(rèn)知和社交等[38?39].目前，斑馬魚中已開發(fā)出一系列評(píng)估化學(xué)品對(duì)感覺、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能影響的行為學(xué)測(cè)試方法[40?41]，并且研究發(fā)現(xiàn)精神類藥物、尼古丁、毒死蜱、二嗪農(nóng)、苯并芘、酒精和重金屬等對(duì)斑馬魚行為學(xué)改變與其在哺乳類動(dòng)物中作用相似[42?43].商業(yè)化和自主研發(fā)的行為學(xué)高通量分析系統(tǒng)被廣泛運(yùn)用于環(huán)境化學(xué)品神經(jīng)毒性的評(píng)估[44?51].這些系統(tǒng)通過視頻追蹤記錄和軟件分析幼魚（＜ 7 dpf）運(yùn)動(dòng)的速度、距離和轉(zhuǎn)彎角度等信息，實(shí)現(xiàn)幼魚睡眠與覺醒[52]、光運(yùn)動(dòng)反應(yīng)[53]、視聽刺激運(yùn)動(dòng)[54]、明暗變化運(yùn)動(dòng)反應(yīng)[55]等神經(jīng)行為的高通量分析.三家實(shí)驗(yàn)室分別利用斑馬魚神經(jīng)行為毒性高通量測(cè)試方法對(duì)Tox21 Phase Ⅲ項(xiàng)目確定的91 種參考化學(xué)品進(jìn)行分析，對(duì)神經(jīng)毒物的識(shí)別率分別為49%[46]、62.5%[48]和96%[46].不同實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)的差異，一方面是由于測(cè)試方法設(shè)計(jì)的差別，例如，胚胎暴露之前的脫膜處理可能會(huì)增加胚胎對(duì)毒物反應(yīng)的敏感性，從而增加了陽(yáng)性率[47].另外一方面則是由于不同實(shí)驗(yàn)室判定神經(jīng)毒物標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格程度不同[46,48]，神經(jīng)行為異?？赡苁怯捎诠趋老到y(tǒng)或者肌肉系統(tǒng)異常導(dǎo)致，在無(wú)明顯發(fā)育毒性濃度下考察神經(jīng)行為變化情況的判定方法更加科學(xué)合理[48].利用斑馬魚大規(guī)模開展化學(xué)品的神經(jīng)行為毒性測(cè)試的研究相比于發(fā)育毒性研究要少很多，未來(lái)需要更多高質(zhì)量的數(shù)據(jù)證明斑馬魚神經(jīng)行為測(cè)試方法對(duì)人類神經(jīng)毒物的預(yù)測(cè)能力.

3.3 心血管毒性

目前，評(píng)價(jià)藥物和環(huán)境污染物心臟毒性的體內(nèi)和體外方法相對(duì)有限，主要評(píng)價(jià)終點(diǎn)包括心臟的結(jié)構(gòu)、電生理和收縮性等[56].電生理變化是當(dāng)前主要的心臟毒性評(píng)價(jià)方法，但由于人類和嚙齒類動(dòng)物心肌細(xì)胞中離子通道表達(dá)的差異，導(dǎo)致兩者的心臟電生理存在明顯不同[56].相比于嚙齒類動(dòng)物，斑馬魚心臟電生理特征與人類更加相似[57]，因而是化學(xué)品心臟毒性評(píng)價(jià)的重要替代方法.研究人員已經(jīng)在斑馬魚成魚和幼魚中開發(fā)出多種心電圖測(cè)定的方法[58?60].另外，許多針對(duì)幼魚的成像及分析方法可以測(cè)定心率、心電圖QT 間隔、射血分?jǐn)?shù)、房室傳導(dǎo)、心房和心室的搏動(dòng)節(jié)律及血液動(dòng)力學(xué)特征[61?64]，為高通量的心血管毒性評(píng)價(jià)提供了有力工具.利用心率和搏動(dòng)節(jié)律兩個(gè)評(píng)價(jià)終點(diǎn)對(duì)23 個(gè)已知可導(dǎo)致人類心電圖QT 間隔延長(zhǎng)的藥物進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)斑馬魚識(shí)別心臟毒物的特異性為76%，敏感性為80%；針對(duì)水溶性差的藥物改用顯微注射的暴露方式可以將預(yù)測(cè)的敏感性增加至96%[65].針對(duì)96 種有心臟毒性報(bào)道的藥物，研究人員比較分析人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞和斑馬魚幼魚兩種模型的預(yù)測(cè)能力，發(fā)現(xiàn)斑馬魚模型具有更好的心臟毒性預(yù)測(cè)能力[66].利用針對(duì)幼魚的心臟輸出量、心率和血流3 個(gè)心血管參數(shù)的高通量分析方法，研究人員發(fā)現(xiàn)32 個(gè)心血管藥物中17 個(gè)藥物產(chǎn)生明顯心血管毒性，并且在3 個(gè)藥物中觀察到的最低效應(yīng)濃度接近環(huán)境劑量[67].另外，心血管系統(tǒng)是脊椎動(dòng)物胚胎中第一個(gè)發(fā)揮功能的器官系統(tǒng)，反映出心血管系統(tǒng)在發(fā)育和懷孕期間的關(guān)鍵作用.斑馬魚胚胎發(fā)育過程中血管新生的動(dòng)態(tài)特征被用于識(shí)別阻燃劑對(duì)胚胎血管損壞的早期事件[68?69].這顯示出斑馬魚在環(huán)境污染物心血管毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用前景.

3.4 內(nèi)分泌干擾

斑馬魚的內(nèi)分泌系統(tǒng)在發(fā)育前5 d 基本發(fā)育完全[70].例如，垂體激素基因從48 hpf 開始表達(dá)[71]，催化雄激素合成的芳香化酶和雌激素受體等基因在24 hpf 就能檢測(cè)到[72?73]，甲狀腺?gòu)? dpf 開始產(chǎn)生甲狀腺激素[74].在斑馬魚中已開發(fā)出許多內(nèi)分泌信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因報(bào)告品系，包括雌激素信號(hào)Tg（ERE:GFP）[75]和Tg（ERE:Gal4ff;UAS:GFP）[76?77]，甲狀腺激素信號(hào)Tg（tshβ:EGFP）[78]，以及糖皮質(zhì)激素信號(hào)Tg（GCRE-HSV:U123:EGFP）[79].利用這些轉(zhuǎn)基因品系的幼魚可以開展具有內(nèi)分泌干擾作用化學(xué)品的高通量毒性測(cè)試.例如，利用轉(zhuǎn)基因Tg（ERE:Gal4ff;UAS:GFP）的半透明Casper斑馬魚和高內(nèi)涵成像系統(tǒng)，研究人員開發(fā)了雌激素干擾物檢測(cè)的半自動(dòng)定量方法[80].Casper斑馬魚中的兩個(gè)色素基因（roy和nacre）突變，使得在Tg（ERE:Gal4ff;UAS:GFP）-Casper中能夠檢測(cè)到更強(qiáng)的報(bào)告基因信號(hào).通過共聚焦成像可以檢測(cè)到EE2 在環(huán)境濃度（ng·L?1）下的雌激素激動(dòng)作用，展示出該方法在未來(lái)活體高通量?jī)?nèi)分泌干擾評(píng)價(jià)中的應(yīng)用前景.但是，高內(nèi)涵系統(tǒng)成像的分辨率要低于共聚焦，成像精度會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度.例如，該研究中高內(nèi)涵只檢測(cè)到1000 μg·L?1的BPA 暴露胚胎中的信號(hào)，而共聚焦成像在62.5 μg·L?1的BPA 暴露胚胎就能檢測(cè)到信號(hào).因此，增加高通量檢測(cè)的成像分辨率是未來(lái)重要的研究方向.

3.5 肝臟毒性

目前，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)藥物的肝臟毒性是藥物開發(fā)中的一個(gè)挑戰(zhàn).不同物種肝臟中生物轉(zhuǎn)化和代謝途徑的差異使得肝臟相比于其它器官中毒性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率要低[81].近年來(lái)利用斑馬魚模型開展藥物肝臟毒性高通量篩查的研究興趣不斷增加[81?82].相比于哺乳動(dòng)物，斑馬魚肝臟包含除免疫細(xì)胞（Kuffer 細(xì)胞）以外的所有細(xì)胞類型，這些肝臟細(xì)胞執(zhí)行膽汁分泌、糖原儲(chǔ)存、外源物代謝與解毒、脂類生成，以及分泌血清蛋白等功能[83].人類肝臟中負(fù)責(zé)外源物質(zhì)Ⅰ相和Ⅱ相的代謝酶在斑馬魚都能找到同源基因[84].盡管許多藥物和環(huán)境污染物在斑馬魚和人類中的代謝過程不完全相同，但大部分保持相似的代謝路徑[84].通過轉(zhuǎn)基因?qū)肴嗽吹募?xì)胞色素P450 酶基因可以提高斑馬魚肝代謝毒性的預(yù)測(cè)能力[85].斑馬魚幼魚的肝臟毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn)包括肝臟大小、肝臟組織凋亡、卵黃脂類消耗和滯留情況[64].兩家藥物公司比較了體外培養(yǎng)肝細(xì)胞高內(nèi)涵分析方法與斑馬魚體內(nèi)基于肝臟表型的分析方法對(duì)50 種已知肝毒性藥物的預(yù)測(cè)能力，發(fā)現(xiàn)斑馬魚與哺乳動(dòng)物預(yù)測(cè)結(jié)果一致率為84%，敏感度為86%，特異性為77%，表明斑馬魚與哺乳類動(dòng)物模型的肝臟毒性預(yù)測(cè)有良好相關(guān)性[82].并且，將斑馬魚模型與2D 或3D 培養(yǎng)肝細(xì)胞的體外模型結(jié)合有望提高毒性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性[82].目前已有一些利用斑馬魚幼魚研究環(huán)境污染物對(duì)水生魚類肝毒性的研究[36,86?87]，但以斑馬魚幼魚肝毒性模型開展大規(guī)模化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)分類的研究相對(duì)較少.未來(lái)需要更多的研究來(lái)評(píng)估斑馬魚幼魚與人類外源物代謝的相關(guān)程度，以及針對(duì)幼魚開發(fā)更多的肝毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn).

3.6 耳毒性

斑馬魚的身體外側(cè)有一個(gè)由毛細(xì)胞組成的稱為側(cè)線的感覺系統(tǒng)，它能夠感應(yīng)水流對(duì)身體不同部位的微小變化.側(cè)線毛細(xì)胞的生理行為跟哺乳類內(nèi)耳的毛細(xì)胞很相似.與哺乳類動(dòng)物的毛細(xì)胞被耳朵包裹在內(nèi)部的復(fù)雜解剖學(xué)結(jié)構(gòu)不同，斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞位于身體表面，容易通過成像進(jìn)行觀察和定量，這使得斑馬魚的側(cè)線被開發(fā)成篩查具有損傷聽力耳毒性藥物的高通量模型[88].側(cè)線毛細(xì)胞模型已經(jīng)被用于評(píng)價(jià)水環(huán)境污染物如雙酚A、銅離子、微塑料、納米銀等對(duì)水生生物感覺系統(tǒng)的不利影響[89?95]，目前該模型還沒有被應(yīng)用于大規(guī)?；瘜W(xué)品毒性篩查.

4 斑馬魚高通量分析技術(shù)的研究進(jìn)展（Advances in high-throughput technology for assay in zebrafish）

體外培養(yǎng)細(xì)胞的高通量自動(dòng)化分析技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但目前斑馬魚的高通量分析還未能達(dá)到體外高通量分析的吞吐力，操作、放置和分析斑馬魚胚胎仍然是勞動(dòng)密集型的工作.下文將總結(jié)近年來(lái)高通量的藥物篩選和化學(xué)品毒性評(píng)價(jià)中魚卵收集、分類和轉(zhuǎn)移、培養(yǎng)和暴露、成像及分析4 個(gè)步驟中的技術(shù)革新情況，以展示斑馬魚高通量毒性測(cè)試涉及的實(shí)驗(yàn)室任務(wù)自動(dòng)化的前景.

4.1 斑馬魚胚胎收集的高效化

斑馬魚懷卵量大、繁殖力強(qiáng)，使得斑馬魚胚胎或幼魚特別適合高通量的生物分析.隨著實(shí)驗(yàn)數(shù)量和規(guī)模的增加，時(shí)間、空間和工作量都會(huì)不同程度的增加，實(shí)驗(yàn)室收集魚卵的傳統(tǒng)方法不再能滿足大規(guī)模和高通量實(shí)驗(yàn)的需求.長(zhǎng)期從事斑馬魚化學(xué)篩選的Leonard Zon 實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種能夠快速收集大量處于相近發(fā)育階段斑馬魚胚胎的新系統(tǒng)[96].這種方法利用魚類在淺水中產(chǎn)卵的自然趨勢(shì)，允許多達(dá)350 條的斑馬魚同時(shí)進(jìn)行繁殖，同一條魚被安排在多個(gè)時(shí)間間隔內(nèi)產(chǎn)卵以收集到發(fā)育階段相近的胚胎.整個(gè)系統(tǒng)由3 個(gè)主要部分組成：外室、產(chǎn)卵平臺(tái)和分離器.系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)會(huì)充滿水，將雌魚和雄魚分別放置在產(chǎn)卵平臺(tái)內(nèi)并且位于分離器下方和上方.分離器被移除，雄魚和雌魚在深水中一起游動(dòng)，產(chǎn)卵平臺(tái)升起后雄魚和雌魚在淺水中交配產(chǎn)卵.受精卵會(huì)從產(chǎn)卵平臺(tái)的底部掉下來(lái)，將魚從繁殖容器中取出后可收集容器底部的受精卵.這種方法極大地利用了斑馬魚的繁殖力，能夠在10 min 內(nèi)獲得最高可達(dá)1 萬(wàn)顆發(fā)育時(shí)期相近的胚胎，是對(duì)傳統(tǒng)方法的一次巨大的改進(jìn).

4.2 斑馬魚胚胎分類和轉(zhuǎn)移自動(dòng)化

化學(xué)篩選需要將單個(gè)斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)的多孔板中，斑馬魚胚胎的手工轉(zhuǎn)移是一項(xiàng)繁瑣費(fèi)力的工作.COPAS（Complex Object Parametric Analyzer And Sorter）系統(tǒng)是能夠分選20—1500 μm 生物顆粒的商業(yè)化流式分選和檢測(cè)系統(tǒng).該系統(tǒng)可根據(jù)胚胎的光學(xué)長(zhǎng)度、光密度和熒光信號(hào)等分選參數(shù)對(duì)不同生存情況或熒光信號(hào)的斑馬魚胚胎進(jìn)行分選.類似于流式細(xì)胞儀，COPAS 通過鞘流精確地將胚胎分配到多孔板或培養(yǎng)容器中，速度最高可達(dá)1 個(gè)胚胎/秒，分選純度達(dá)98%，并且對(duì)斑馬魚胚胎的生存能力沒有明顯的影響.COPAS 的分析和分選功能已被應(yīng)用于肺結(jié)核病的新型抗生素和胰島素治療藥物的斑馬魚高通量自動(dòng)篩選研究中[97?98].但是，COPAS 的價(jià)格接近流式細(xì)胞分選儀，高昂的價(jià)格限制了該系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用.實(shí)驗(yàn)室研究人員開發(fā)了另一種成本相對(duì)較低的可將單顆斑馬魚胚胎批量轉(zhuǎn)移到96 孔板的自動(dòng)化系統(tǒng)[99].該系統(tǒng)包括一個(gè)放置96 孔板的平臺(tái)和與之相匹配的用于捕獲和固定胚胎的定制24 孔板.該裝置通過抽掉裝置底部空氣形成的低真空環(huán)境達(dá)到固定和排列單顆斑馬魚胚胎的效果.隨后，翻轉(zhuǎn)該裝置并通過相機(jī)的幫助與平臺(tái)上96 孔板的1/4 相對(duì)齊，完成胚胎的轉(zhuǎn)移.該系統(tǒng)完成一個(gè)96 孔板的胚胎轉(zhuǎn)移大約需要360 s，成功率可達(dá)94.3%.此外，研究人員還設(shè)計(jì)了微機(jī)械大顆粒流式分揀機(jī)（micromechanical large particle in flow sorter,MILPIS），該系統(tǒng)利用受精卵和非受精卵光學(xué)透明度的不同，在微流控芯片中嵌入紅外發(fā)射和接收器，通過檢測(cè)區(qū)分透明度來(lái)分選兩類胚胎[100].

4.3 斑馬魚胚胎培養(yǎng)和暴露自動(dòng)化

斑馬魚胚胎暴露一般在靜態(tài)或半靜態(tài)的多孔板中進(jìn)行，一些可編程的自動(dòng)移液工作站已經(jīng)廣泛應(yīng)用于胚胎的暴露和換液操作[101].近年來(lái)，微流控芯片技術(shù)為胚胎的培養(yǎng)及暴露提供了許多自動(dòng)化運(yùn)行的解決策略[102?103].與傳統(tǒng)多孔板相比，微流控芯片技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是可實(shí)現(xiàn)多個(gè)操作的自動(dòng)化.例如，Donald Wlodkowic 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的微流控芯片可快速裝入和固定魚卵，并且實(shí)現(xiàn)了胚胎暴露微環(huán)境的自動(dòng)灌注，避免了傳統(tǒng)的耗時(shí)耗力的液體處理任務(wù)[104?105].該微流控芯片設(shè)計(jì)了可容納12×21 個(gè)胚胎的腔室陣列，利用胚胎自身重力和底部的低壓吸力捕獲和固定斑馬魚胚胎[105].微流體芯片通過定制接口與液體蠕動(dòng)泵相連，使得胚胎長(zhǎng)期固定在流動(dòng)的暴露液中[105].該微流控芯片的培養(yǎng)環(huán)境與普通靜態(tài)培養(yǎng)條件下測(cè)定的硫酸銅等化學(xué)品對(duì)胚胎的死亡率和致畸率有良好的相關(guān)性，但該系統(tǒng)只能捕獲及固定有絨毛膜保護(hù)的圓形斑馬魚胚胎，只適用于受精后48 h 之內(nèi)的測(cè)試[105].另外，微流控芯片可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化功能的集成，如梯度發(fā)生器[106?109]和溫度控制[110]等功能.研究人員將微流控培養(yǎng)腔室陣列與濃度梯度發(fā)生器相結(jié)合，設(shè)計(jì)出一種可為7 個(gè)胚胎培養(yǎng)腔室獨(dú)立輸送并連續(xù)給藥的芯片裝置[109].胚胎被手動(dòng)轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室中，每個(gè)培養(yǎng)室可容納幾個(gè)胚胎，將芯片傾斜20°放置可以清除廢物和排出廢液.這種微灌流暴露方式可以克服化學(xué)品揮發(fā)和被吸附導(dǎo)致的暴露濃度下降的問題.除了水溶液的給藥方式，自動(dòng)顯微注射技術(shù)可以為易揮發(fā)和難溶化學(xué)品提供更直接高效的遞送[111].

4.4 斑馬魚成像及數(shù)據(jù)分析自動(dòng)化

通過自動(dòng)化成像及分析技術(shù)高效地獲取發(fā)育毒性、行為學(xué)改變、特定組織器官變化和心率等生理指標(biāo)變化的數(shù)據(jù)是整個(gè)斑馬魚高通量篩查中最重要的環(huán)節(jié).針對(duì)不同檢測(cè)終點(diǎn)的高通量成像策略各不相同.利用簡(jiǎn)單的成像設(shè)備如數(shù)碼相機(jī)和細(xì)胞成像儀等可以快速進(jìn)行發(fā)育毒性分析.Donald Wlodkowic 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的微流控芯片采用透明的聚甲基丙烯酸甲酯樹脂制造，為固定胚胎的成像提供了便利[105,112].芯片外形大小特地設(shè)計(jì)成96 孔板的尺寸，方便利用高分辨相機(jī)或細(xì)胞成像儀采集圖像.這種微流控芯片技術(shù)圖像采集方便，同時(shí)集成了自動(dòng)化捕獲、固定、暴露胚胎等功能，為發(fā)育毒性和致畸性評(píng)價(jià)提供了一個(gè)廉價(jià)的高通量、自動(dòng)化的解決策略.

雖然成年斑馬魚具有更豐富的行為學(xué)特征和檢測(cè)方法[41]，但是成魚的分析通量要低于幼魚.針對(duì)幼魚行為的高通量檢測(cè)方法主要是測(cè)定及量化幼魚自發(fā)或刺激誘發(fā)運(yùn)動(dòng)行為中的各類特征，包括位置偏好、位移、速度、運(yùn)動(dòng)啟動(dòng)頻率、休息期時(shí)長(zhǎng)、軀干彎曲程度和方向變化等[113?115].斑馬魚幼魚的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)一般在燈箱或光板上的培養(yǎng)皿或多孔板中進(jìn)行，照相機(jī)從頂上方拍攝，圖像采集軟件可同時(shí)自動(dòng)追蹤及拍攝多條幼魚的運(yùn)動(dòng)視頻.無(wú)論采用高幀率或低幀率的相機(jī)都可開發(fā)出匹配算法和軟件[55,116]，量化幼魚運(yùn)動(dòng)中各種可測(cè)量的特征，以確定藥物或化學(xué)品誘導(dǎo)的行為學(xué)表型.商業(yè)化的分析軟件如Zebralab（Viewpoint Life Sciences）和Ethovision（Noldus Information Technology）提供一些量化行為學(xué)特征的標(biāo)準(zhǔn)分析流程，并且在實(shí)驗(yàn)視頻記錄同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，大大提高分析速度；一些開源的軟件包則提供可靠和靈活數(shù)據(jù)處理方法.

胚胎或幼魚中特定細(xì)胞或組織器官的清晰且高通量的成像需要更加復(fù)雜光學(xué)成像設(shè)備和輔助硬件的支撐.這類成像面臨的首要挑戰(zhàn)是如何使胚胎或幼魚固定并將其旋轉(zhuǎn)至能清晰檢測(cè)到感興趣細(xì)胞和組織的成像面.脊椎動(dòng)物自動(dòng)篩查技術(shù)Vertebrate Automated Screening Technology（VAST）系統(tǒng)是目前針對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚最成熟的自動(dòng)化成像系統(tǒng).該系統(tǒng)通過微流控液流將胚胎或幼魚從多孔板送入一個(gè)超薄硅硼酸鹽玻璃毛細(xì)管中，通過步進(jìn)馬達(dá)精確控制毛細(xì)管繞中心軸旋轉(zhuǎn)（360 度），使斑馬魚胚胎可以根據(jù)用戶定義自動(dòng)定向[117].毛細(xì)玻璃管組件安裝在一個(gè)三軸定位臺(tái)上，可支持寬場(chǎng)和共聚焦熒光顯微鏡成像，成像速度可達(dá)每條魚20 s，可在35 min 內(nèi)掃描完成一個(gè)96 孔板.經(jīng)優(yōu)化后，整個(gè)系統(tǒng)的操作流程可自動(dòng)地多線程運(yùn)行，檢測(cè)速度大大提高[118].該系統(tǒng)已被Union Biometrica 公司以VAST BioImager 商標(biāo)商業(yè)化[119].研究人員將VAST 與定制的轉(zhuǎn)盤共聚焦結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘的高分辨自動(dòng)成像[120].最近，一種利用聲波來(lái)操縱液體和液體中顆粒的聲學(xué)流體技術(shù)被應(yīng)用于斑馬魚的非接觸式固定[121].研究人員研制出的聲流體旋轉(zhuǎn)鑷子通過聲波激發(fā)的偏振單流渦旋對(duì)流體通道內(nèi)的幼魚旋轉(zhuǎn)，采集幼魚旋轉(zhuǎn)過程中的二維圖像序列，最后利用基于計(jì)算機(jī)視覺的算法將二維圖像重建成三維模型.這種精細(xì)的聲學(xué)流體控制技術(shù)可降低旋轉(zhuǎn)不均勻?qū)е碌娜S模型失真.這種聲流體旋轉(zhuǎn)鑷子可靈活地與多種光學(xué)顯微鏡兼容.這些裝載、固定和卸載胚胎及幼魚的樣品制備自動(dòng)化技術(shù)極大地推動(dòng)了光片顯微成像[122?123]和光學(xué)投影斷層掃描[124?125]等高速三維成像技術(shù)在斑馬魚表型評(píng)估中應(yīng)用.

隨著高通量自動(dòng)顯微成像技術(shù)的進(jìn)步，利用有效的計(jì)算機(jī)策略對(duì)大規(guī)模圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的需求增加.基于體外細(xì)胞圖像的高內(nèi)涵分析方法在化學(xué)篩選中已經(jīng)非常成熟[126]，這些針對(duì)細(xì)胞的圖像解決策略在基于圖像的斑馬魚表型分析中具有巨大的應(yīng)用潛力.目前，已有許多針對(duì)斑馬魚特定分析需求的自動(dòng)化圖像分析方法[127?128].例如，可用于發(fā)育毒性和致畸性評(píng)價(jià)中胚胎形態(tài)識(shí)別和分類的圖像處理方法.其中，F(xiàn)ishInspector 能夠自動(dòng)識(shí)別圖像中幼魚的輪廓、眼睛、下顎尖、卵黃囊、魚鰾、耳石、脊索和色素等；根據(jù)幼魚3D 重建模型，研究人員計(jì)算幼魚的表面向量與X軸之間角度，通過角度分布的直方圖精細(xì)地量化幼魚身體的形態(tài)特征，包括水腫和體軸彎曲程度等[121].斑馬魚中圖像自動(dòng)處理的應(yīng)用還包括熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目的定量[98,120,129]，組織和器官大小測(cè)量[121,130?131]，行為特征的無(wú)監(jiān)督聚類分析[52?53]和基因表達(dá)的三維解剖學(xué)結(jié)構(gòu)注釋[124,132]等.相比于過去遺傳和藥物篩選中依靠人工視覺的表型判斷，計(jì)算機(jī)技術(shù)提供的自動(dòng)和無(wú)偏向分析方法不僅提供可靠的定量數(shù)據(jù)，而且使得分析流程具有可追塑性和可重復(fù)性.隨著高通量成像技術(shù)的不斷發(fā)展，斑馬魚中高通量圖像分析未來(lái)面臨的挑戰(zhàn)是如何根據(jù)各類成像技術(shù)的特點(diǎn)創(chuàng)建匯聚各項(xiàng)分析功能的精簡(jiǎn)平臺(tái)，以便科研人員容易掌握及廣泛使用.

5 總結(jié)與展望（Conclusion and prospect）

斑馬魚已成為強(qiáng)有力推動(dòng)人類臨床前研究的脊椎動(dòng)物模型，在高通量的藥物篩選和化學(xué)品毒性評(píng)價(jià)中發(fā)揮重要作用.本文系統(tǒng)地總結(jié)了當(dāng)前斑馬魚高通量毒性測(cè)試及高通量分析技術(shù)的研究進(jìn)展和所面臨的問題挑戰(zhàn).為進(jìn)一步促進(jìn)斑馬魚高通量分析技術(shù)在化學(xué)品毒性預(yù)測(cè)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中應(yīng)用，助力新污染物治理中化學(xué)物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系的建設(shè)，未來(lái)在以下幾個(gè)方面有待開展更多的研究：（1）需要有效整合高通量分析流程中各個(gè)功能模塊，建立經(jīng)濟(jì)、集約化的斑馬魚高通量分析平臺(tái)；（2）需要一個(gè)斑馬魚高通量毒性測(cè)試的實(shí)施指南，為可靠的毒性預(yù)測(cè)提供統(tǒng)一的實(shí)施建議；（3）需要建立大量化學(xué)品的斑馬魚高通量毒性評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)庫(kù)，方便系統(tǒng)比較不同研究平臺(tái)的測(cè)試結(jié)論，以優(yōu)化測(cè)試指標(biāo)和方法，并提供斑馬魚毒性預(yù)測(cè)能力的大數(shù)據(jù)支持；（4）需要將斑馬魚體內(nèi)模型與其它高通量分析模型如3D 培養(yǎng)細(xì)胞或類胚體等組合，努力提高毒性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性.