張含林 林輝 郭航遠

312000 紹興市人民醫(yī)院(浙江大學紹興醫(yī)院)心內(nèi)科

國際糖尿病聯(lián)合會預測,到2040年,糖尿病的患病率將達10.4%(6.42億)。糖尿病的主要并發(fā)癥之一是糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)[1]。DCM的特征是代謝紊亂,通常伴有局部炎癥、氧化應(yīng)激、心肌纖維化和心肌細胞凋亡[2]。在心肌纖維化過程中,細胞外基質(zhì)主要來源于心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CFs)[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)被認為是誘導CFs向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的最強的促纖維化細胞因子[4]。DCM中,高糖等因素可活化TGF-β1,從而促進CFs活化,表現(xiàn)為表達收縮蛋白,如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達增加,并合成大量的細胞外基質(zhì),包括波形蛋白(Vimentin)和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)[5-6]。目前研究認為,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在DCM發(fā)病和進展中起著關(guān)鍵作用[7]。同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1(homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-like domain member 1,Herpud1)是一種廣泛表達于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白。Herpud1已被報道與糖尿病和阿爾茨海默病等多種疾病有關(guān)[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Herpud1介導的ERS在動脈粥樣硬化和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)可塑性中起重要作用[8],敲除Herpud1可保護血管緊張素Ⅱ誘導的內(nèi)皮細胞凋亡[9]。?；切苋パ跄懰?tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)是公認的ERS抑制劑[10]。有研究發(fā)現(xiàn),TUDCA可減輕壓力負荷引起的心功能障礙[11],并通過抑制ERS減少糖尿病小鼠心肌缺血再灌注后巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤,從而減少心肌細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[12]。我們推測,TUDCA通過Herpud1介導的ERS通路可抑制CFs活化。但TUDCA對DCM的緩解作用及其可能機制仍需要進一步驗證。本研究旨在通過TUDCA干預TGF-β1誘導的CFs,比較藥物干預前后CFs的活化情況,為臨床應(yīng)用TUDCA治療DCM提供實驗依據(jù),并闡明Herpud1基因在TGF-β1誘導的CFs活化中的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

6周齡的SPF級SD大鼠,均自南京大學模式動物研究所購得。根據(jù)《國家衛(wèi)生研究院實驗動物關(guān)愛使用指南》,所有動物方案均經(jīng)紹興市人民醫(yī)院動物關(guān)愛利用委員會批準。所有動物實驗均在紹興市人民醫(yī)院實驗動物中心完成,動物使用許可證號:SYXK(浙)2017-0007,SPF級環(huán)境,濕度為40%～60%,室溫為22～28℃,晝夜交替循環(huán)時間為12 h。食物和水自由供應(yīng)。TUDCA、鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)和嘌呤霉素均為美國MCE公司產(chǎn)品。高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、鏈霉素-青霉素混合液、Lipofectamine 3000、Opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均為美國Gibco公司產(chǎn)品。TGF-β1和Ⅱ型膠原酶為美國Cell signaling公司產(chǎn)品。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、α-SMA、Vimentin、Herpud1、CollaganⅠ、Anti-beta Actin和Troponin T抗體均為美國Abcam公司產(chǎn)品。5-Brdu為美國Sigma公司產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和Western blot相關(guān)試劑均為江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。siHerpud1、Control組的病毒和轉(zhuǎn)染的P液為上海吉凱生物公司產(chǎn)品。對照質(zhì)粒以及Herpud1過表達質(zhì)粒為上海和元生物公司產(chǎn)品。HE染色、馬松染色以及免疫組織化學試劑盒均為北京索萊寶公司產(chǎn)品。Transwell小室為美國Corning公司產(chǎn)品。

1.2 模型構(gòu)建和實驗分組

為確定TGF-β1對ERS通路相關(guān)因子及纖維化相關(guān)因子的影響,用TGF-β1誘導高糖培養(yǎng)下的CFs,采用隨機數(shù)字表法將CFs分為Control組、6 h、12 h和24 h組。為確定Herpud1在心臟中的表達,分別提取原代心肌細胞和CFs進行下一步的研究。為檢測TUDCA對CFs活性的影響,將高糖培養(yǎng)下的CFs用不同濃度(0、1、10、100、1 000和10 000 μM,1 d)TUDCA干預。為明確TUDCA對TGF-β1誘導的CFs活化及ERS通路相關(guān)蛋白的影響,采用隨機數(shù)字表法將高糖培養(yǎng)下的CFs分為HG(25 mmol/L葡萄糖)組、TGF-β1(10 ng/ml)組,TGF-β1+TUDCA 100(100 μM)組、TGF-β1+TUDCA 1 000(1 000μM)組。為驗證Herpud1對CFs的敲除效率,采用隨機數(shù)字表法將CFs分為NC、siNC、siRNA1、siRNA2和siRNA3組。為了明確敲除Herpud1對CFs的激活、增殖和遷移的影響,選擇敲除效率最高的Herpud1 siRNA1進行下一步研究,采用隨機數(shù)字表法將CFs分為HG+siNC、TGF-β1+siNC、HG+siHerpud1、TGF-β1+siHerpud1組。為了驗證Herpud1在TUDCA抑制CFs纖維化中的作用,將高糖培養(yǎng)下的CFs分為TGF-β1、TUDCA(TGF-β1+TUDCA)、TUDCA+oeVec(TGF-β1+TUDCA+oeVec)、TUDCA+oeHerpud1(TGF-β1+TUDCA+oeHerpud1)組。

1.3 CFs和心肌細胞的分離培養(yǎng)

自行繁育的3～7 d SD乳鼠用體積分數(shù)為70%的乙醇消毒,腹腔麻醉后頸椎脫臼法處死,在無菌條件下剪開胸骨,立即取出心臟置于含有肝素鈉的冷D-Hank’s溶液中,顯微鏡下去除殘留的大血管和筋膜,緩沖液反復漂洗去除血液,用眼科剪剪成1.5～2.0 mm3的組織塊,用D-Hank’s液仔細漂洗。組織塊轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,加入3 g/L的Ⅱ型膠原酶6 ml,37℃下置于水平搖床上搖動90 min,取上清液立即加入6 ml含體積分數(shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止膠原酶反應(yīng),1 500 r/min離心5 min,再懸浮在含有10% FBS、100 IU/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的DMEM(高糖)中。然后,采用差速貼壁法分離CFs,在37℃培育90 min后,收集上清液,貼壁細胞就是小鼠心肌細胞(mCF),將上清液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中,同時加入5-Brdu(B5002,sigma)抑制CFs的生長,24 h后,顯微鏡下可見跳動的小鼠心肌細胞(mCM)。觀察細胞生長情況,細胞達80%～90%融合時傳代,即為原代培養(yǎng)的第一代,第二代至第三代CFs被用于實驗。

1.4 細胞免疫熒光法鑒定CFs

采用細胞免疫熒光法鑒定CFs的純度,鑒定標準為Vimentin(+)、α-SMA(-)和Cardiac Troponin T(-)符合三條即為CFs。將CFs均勻種于六孔板中,細胞融合到60%,棄去培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗3遍,用4%多聚甲醛處理20 min,用PBS清洗3次,每次5 min,加入體積分數(shù)0.2%的Triton X-100 15 min,用PBS清洗3次,每次5 min。用5%牛血清白蛋白在室溫下孵育30 min以阻斷非特異性結(jié)合,然后在4℃下用抗Anti-alpha smooth muscle Actin抗體(Abcam,ab7817,1∶400)和抗Vimentin抗體(Abcam,ab92547,1∶400),Cardiac Troponin T(Abcam,ab209813,1∶400)處理過夜。第二天,清洗細胞以去除游離抗體,然后用Alexa Fluor 486山羊抗兔抗體(Life Technologies)進行染色,并用1 μg/ml DAPI核染色(D9564;Sigma Aldrich)進行反染色。所有的熒光圖像都是用Nikon Eclipse Ti-U熒光顯微鏡獲得的。

1.5 CCK-8法檢測CFs活力

采用CCK-8比色法(C0037、碧云天),按生產(chǎn)廠家的方法測定TUDCA對CFs的毒性。培養(yǎng)條件:取第三代對數(shù)期CFs制成細胞懸液接種于96孔板,每孔加入細胞懸液100 μl(細胞數(shù)為每孔5×103個),在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)24 h,然后分別加入0、1、10、100和1 000 μM、10和100 mM的TUDCA培養(yǎng)24 h。處理后,細胞用PBS沖洗,每孔加入100 ml含有CCK-8的DMEM溶液(10 μl),然后在37℃孵育2 h,用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD)值。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

使用Transwell實驗評估CFs的遷移。CFs生長至70%～80%匯合時,血清饑餓過夜,加入藥物干預,之后用胰蛋白酶消化并對它們進行計數(shù),將0.15×106個細胞鋪在Transwell(8 μm孔徑)的頂部,該Transwell已用0.5% BSA的Hank’s平衡鹽溶液包被。底部腔室含有10%血清的培養(yǎng)基,用作化學引誘劑。5 h后,用PBS洗滌孔,用棉簽輕輕擦拭Transwell的頂面以除去非遷移細胞。在室溫下向孔中加入冰冷的甲醇10 min,用自來水洗滌孔5次。然后通過加入蘇木精對細胞進行染色,使其保持接觸3 min,最后在自來水中沖洗孔2次。在顯微鏡的×20物鏡下拍攝每個Transwell的照片,并為每個well拍攝6個隨機選擇的視野,避開外部邊緣。Image J用于量化每個膜上的細胞數(shù)量。

1.7 Western blot法檢測ERS通路相關(guān)蛋白和纖維化因子的表達

CFs進行相應(yīng)的干預后,用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液(Beyotime,中國)裂解,然后在冰上孵育30 min。細胞裂解產(chǎn)物在4℃下12 000 r/min離心10 min,用BCA蛋白分析試劑盒(Beyotime,P0012)測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣本是在5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加載緩沖液中稀釋,煮沸5 min。提取的蛋白質(zhì)用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF;MA)膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉60 min后加入Herpud1、GRP78、ATF6、α-SMA、Vimentin 、Cardiac Troponin T 和CollagenⅠ的多克隆抗體4℃孵育過夜。次日,用PBST洗滌后,加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗,在37℃下作用1 h,用ECL Western blotting底物(Pierce;Thermo Scientific)顯示W(wǎng)estern blot,并用Quantity One軟件進行分析。每組實驗獨立重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CFs的鑒定

將從健康SD乳鼠中分離的CFs進行鑒定,顯微鏡下觀察CFs呈現(xiàn)不規(guī)則的長梭形,且無搏動功能。用細胞免疫熒光法鑒定CFs的純度,見圖1。

CFs中波形蛋白(Vimentin)、心肌肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達

2.2 TGF-β1上調(diào)CFs中ERS相關(guān)伴侶蛋白和纖維化因子

心肌纖維化主要累及CFs。在此,我們從細胞水平研究了TGF-β1對ERS相關(guān)因子和纖維化因子表達的影響。用10 ng/ml TGF-β1刺激CFs 0、6、12和24 h,發(fā)現(xiàn)24 h后細胞纖維化標志物CollagenⅠ、Vimentin和α-SMA的表達均顯著高于Control組(均為P<0.05),ERS通路相關(guān)蛋白Herpud1、GRP78和ATF6的表達均升高(均為P<0.05),見圖2。

Herpud1:同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1;GRP78:葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;ATF6:轉(zhuǎn)錄激活因子6;Vimentin:波形蛋白;α-SMA:α-平滑肌肌動蛋白;CollagenⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;A:Western blot檢測TGF-β1在不同時間處理下ERS通路相關(guān)蛋白的表達,與Control組比較,aP<0.05;與6 h組比較,bP<0.05;與12 h組比較,cP<0.05(n=3);B:Western blot檢測TGF-β1在不同時間處理下纖維化相關(guān)因子的表達,與Control組比較,aP<0.05;與6 h組比較,bP<0.05;與12 h組比較,cP<0.05(n=3)

Herpud1:同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1;CollagenⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;α-SMA:α-平滑肌肌動蛋白;Vimentin:波形蛋白;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長因子β1;HG:高糖;A:Herpud1的敲除效率,與NC組比較,aP<0.05;B:Western blot檢測敲除Herpud1后纖維化相關(guān)因子的表達,與HG+siNC組比較,aP<0.05;與TGF-β1+siHerpud1組比較,bP<0.05(n=3);C:Transwell實驗檢測CFs的遷移

2.3 下調(diào)Herpud1基因的表達可抑制TGF-β1所誘導的CFs纖維化

通過體外培養(yǎng)心臟組織中的原代細胞,我們發(fā)現(xiàn)Herpud1在CFs中的表達明顯高于心肌細胞,見圖3。Herpud1在CFs中的高表達是否意味著Herpud1具有調(diào)節(jié)CFs活化的作用?為了研究Herpud1是否與CFs活化及纖維化有直接關(guān)系,我們轉(zhuǎn)染siRNA-Herpud1以下調(diào)CFs中Herpud1基因的表達。與NC組相比,針對Herpud1的3個siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)顯著降低Herpud1的表達(均為P<0.05),見圖4A。在隨后的實驗中,我們選擇了產(chǎn)生最大效應(yīng)的小干擾RNA序列(siRNA1),并在有或無TGF-β1刺激的情況下瞬時轉(zhuǎn)染CFs。與siNC組相比,siRNA-Herpud1(Herpud1 siRNA)顯著降低CFs中Herpud1蛋白的水平,同時也降低了纖維化標志物CollagenⅠ、Vimentin和α-SMA的水平(均為P<0.05),見圖4B,表明下調(diào)Herpud1可抑制TGF-β1誘導的CFs纖維化。同時,Transwell實驗也驗證了下調(diào)Herpud1可抑制CFs的遷移,見圖4C。以上實驗表明,敲除Herpud1可抑制CFs中TGF-β1的促纖維化作用。

2.4 TUDCA對CFs的毒性

通過CCK-8測定,檢測不同濃度的TUDCA在24 h內(nèi)對CFs的毒性。鑒于10 mM TUDCA在24 h后即可引起細胞毒性,因此選擇100和1 000 μM TUDCA進行后續(xù)實驗,見圖5。

OD:吸光度;TUDCA:牛磺熊去氧膽酸;與0 μM TUDCA組比較,aP<0.05

2.5 TUDCA抑制TGF-β1誘導的CFs活化和ERS

首先,我們研究了TUDCA對ERS通路相關(guān)蛋白的影響。Western blot結(jié)果顯示,TGF-β1刺激的ATF6、GRP78和Herpud1蛋白水平高于HG組,然而,相較于TGF-β1干預組,TUDCA干預顯著降低了這些蛋白的水平,并且1 000 μM TUDCA產(chǎn)生的作用強于100 μM TUDCA(P<0.05),見圖6。免疫熒光染色結(jié)果顯示,TGF-β1刺激的α-SMA的表達顯著升高,TUDCA干預逆轉(zhuǎn)了TGF-β1對α-SMA的作用,見圖7A。Western blot結(jié)果顯示,TGF-β1刺激的CollagenⅠ、Vimentin和α-SMA蛋白水平高于對照組,然而,TUDCA干預逆轉(zhuǎn)了TGF-β1對這些蛋白的影響(P<0.05),見圖7B。進一步實驗表明,TUDCA干預可抑制TGF-β1誘導的CFs活化和ERS。

ATF6:轉(zhuǎn)錄激活因子6;Herpud1:同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1;GRP78:葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;HG:高糖;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長因子β1;TUDCA:?；切苋パ跄懰?Western blot檢測ERS通路信號因子的表達,與HG組比較,aP<0.05;與TGF-β1組比較,bP<0.05(n=3)

TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長因子β1;TUDCA:?；切苋パ跄懰?α-SMA:α-平滑肌肌動蛋白;Vimentin:波形蛋白;CollagenⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;HG:高糖;A:免疫熒光染色法檢測CFs纖維化因子的表達(×100);B:Western blot檢測TUDCA對纖維化相關(guān)因子的影響,與HG組比較,aP<0.05;與TGF-β1組比較,bP<0.05(n=3)

2.6 過表達Herpud1逆轉(zhuǎn)了TUDCA對TGF-β1誘導的CFs纖維化的抑制作用

最后,我們研究了TUDCA對TGF-β1誘導的CFs纖維化的抑制作用是否通過Herpud1介導。使用過表達的方法促進CFs中Herpud1蛋白的表達。

結(jié)果表明,TUDCA可抑制TGF-β1所誘導的Herpud1的水平,同時,TUDCA對TGF-β1誘導的CFs纖維化的抑制作用可被Herpud1過表達所抑制,但在TUDCA+oeVec處理的細胞中不能實現(xiàn)(P<0.05),見圖8。這些結(jié)果表明,Herpud1過表達可逆轉(zhuǎn)TUDCA對TGF-β1誘導的CFs纖維化的抑制作用。

Vimentin:波形蛋白;α-SMA:α-平滑肌肌動蛋白;CollagenⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;Herpud1:同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長因子β1;TUDCA:?；切苋パ跄懰?Western blot檢測過表達Herpud1后纖維相關(guān)因子的表達,與TGF-β1組比較,aP<0.05;與TUDCA+oeVec組比較,bP<0.05(n=3)

3 討論

近年來,糖尿病及其并發(fā)癥的患病率呈逐年上升趨勢,嚴重影響居民的健康生活,成為一個日益嚴重的公共健康風險[13]。DCM是發(fā)生在糖尿病患者身上的一種獨立于冠心病、心臟瓣膜病等心血管疾病的影響心臟結(jié)構(gòu)和功能的病變[14]。DCM的主要病理特征是心肌間質(zhì)纖維化、心臟重構(gòu)和舒張功能障礙,最終發(fā)展為收縮功能障礙的心力衰竭[15]。其發(fā)病機制非常復雜,但確切的機制目前未明。因此,在這里我們主要探索心肌纖維化的機制及阻斷或延緩其進展的藥物。CFs活化所導致的細胞外基質(zhì)的沉積被認為是心肌纖維化的基礎(chǔ)。其中,TGF-β被認為是心肌纖維化過程中的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在CFs活化中起著重要的調(diào)控作用[16]。DCM中,高糖可增加CFs中TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄和下游信號的激活,促進DCM心肌纖維化過程[17]。因此,抑制TGF-β1介導的CFs活化可有效預防和控制DCM。尋找潛在的抑制心肌纖維化、改善心臟功能的藥物對治療糖尿病具有十分重要的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中主要負責蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的細胞器。正確折疊和修飾的蛋白質(zhì)被運送到高爾基體,與胞膜融合,釋放到細胞外空間。糖尿病本身是一種錯誤折疊蛋白疾病,大量錯誤折疊或未折疊的蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔積聚,引起ERS并激活未折疊蛋白反應(yīng)[18]。目前研究認為ERS與DCM的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。許多藥物可通過抑制ERS來減少心肌細胞凋亡,改善心臟功能,延緩DCM的發(fā)生發(fā)展[8]。值得注意的是,ERS與TGF-β信號轉(zhuǎn)導、氧化應(yīng)激和蛋白尿密切相關(guān)[19]。Herpud1是錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白,其N端和C端均暴露于細胞質(zhì)中,是UPR的下游靶蛋白和ERAD的組成部分和調(diào)節(jié)者[20]。Herpud1蛋白的表達水平與ERS的程度呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),Herpud1基因的啟動子區(qū)存在ERS反應(yīng)原件,在ERS狀態(tài)下,多種特異的轉(zhuǎn)錄因子(如XBP-1、CHOP等)與ERS反應(yīng)原件結(jié)合以促進Herpud1基因的轉(zhuǎn)錄[20]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Herpud1參與動脈粥樣硬化的形成。通過轉(zhuǎn)染Herpud1 siRNA,我們發(fā)現(xiàn)沉默內(nèi)皮細胞中的Herpud1蛋白,可部分逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞損傷,改善內(nèi)皮功能[9, 21]。但是,Herpud1在DCM的中的表達和作用并不明確。目前有關(guān)糖尿病和細胞表型改變的研究中,Herpud1被報道可影響胰島素的分泌,參與骨骼肌的糖代謝[22-23]。Herpud1在成骨細胞分化過程中同樣發(fā)揮重要作用,Herpud1敲除可抑制前成骨細胞向成骨細胞分化,減少骨礦物質(zhì)的沉積[24]。我們的前期研究表明,敲除Herpud1能抑制血管平滑肌細胞由收縮型向合成型分化,減輕動脈粥樣硬化的形成[8]。然而,Herpud1在DCM發(fā)病和CFs活化中的作用和機制并不清楚。通過預實驗體外培養(yǎng)心臟組織中的各種細胞,我們發(fā)現(xiàn)Herpud1在CFs中的表達明顯高于心肌細胞。Herpud1在CFs中的高表達是否意味著Herpud1具有調(diào)節(jié)CFs活化的作用呢?通過體外培養(yǎng)CFs,我們發(fā)現(xiàn)沉默Herpud1基因可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的CFs活化。上述結(jié)果提示,Herpud1可能在DCM的CFs活化中起重要作用。

TUDCA是公認的ERS抑制劑。TUDCA的化學名稱為3α,7β二羥基膽烷酰-N-?；撬?是由?；撬峤Y(jié)合熊去氧膽酸,通過腸道菌群二次加工的產(chǎn)物。TUDCA目前主要用于治療膽囊膽固醇結(jié)石、原發(fā)硬化性膽管炎、原發(fā)膽汁性肝硬化等[10]。有研究發(fā)現(xiàn),TUDCA可減輕壓力負荷引起的心功能障礙[11],并通過抑制ERS減少糖尿病小鼠心肌缺血再灌注后巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤,從而減少心細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[12]。相關(guān)實驗證明,TUDCA通過抑制TSP-1/TGF-β1途徑減輕慢性間歇性低氧所誘導的肺纖維化[25]。并且作為ERS的抑制劑,TUDCA可通過減輕ERS來緩解壓力負荷所致的心肌重構(gòu)[26]。但截至目前,并未有研究探究TUDCA在DCM中的作用及其可能機制,以及ERS在DCM中的作用。本研究發(fā)現(xiàn),TUDCA通過下調(diào)Herpud1來調(diào)節(jié)ERS,進而延緩TGF-β1介導的心肌纖維化,過表達Herpud1后,則可緩解TUDCA對TGF-β1介導的心肌纖維化的抑制作用。提示TUDCA有可能成為治療DCM心肌纖維化的有效藥物。

本研究以Western blot為主要分析方法。然而,其只能用于定性鑒定蛋白質(zhì)或粗略地半定量蛋白質(zhì)水平。對于未來的研究,還需要更多的重復性實驗和成纖維細胞特異性敲除的動物模型來證實本研究的結(jié)論。此外,有研究表明,高糖等因素可活化TGF-β1,隨后與其Ⅱ型受體結(jié)合,繼而募集并結(jié)合TGF-β1 RI,然后引起受體Smads蛋白家族的胞漿蛋白磷酸化,促進CFs活化[6]。因此,仍需進一步的研究來明確ERS調(diào)節(jié)成纖維細胞活化的機制。

綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)TUDCA能通過ERS通路來抑制TGF-β1所誘導的CFs纖維化。本研究初步證實了TUDCA對心肌纖維化的抑制作用,為后續(xù)臨床開展相關(guān)研究探索TUDCA干預DCM患者提供了科學依據(jù),為拓展TUDCA的臨床適應(yīng)證提供了實驗基礎(chǔ)。進一步的實驗證明,Herpud1在DCM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用,調(diào)節(jié)CFs內(nèi)Herpud1水平有望成為干預DCM的新的研究方向。

利益沖突：無