李佳穎，劉乃新，韓廣源

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心，哈爾濱 150023）

0 引言

紅甜菜(BetavulgarisL.)別稱為紫菜頭，為莧科甜菜屬的一種變種蔬菜，其球根可以作為蔬菜食用。追溯其原產(chǎn)地是在歐洲，引入國內(nèi)后在江蘇、吉林、山東、河南等省份廣泛種植[1]。國內(nèi)外研究證明，紅甜菜根中除了含有人體所需的常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)外[2-3]，還含有多種有益于人體健康的生理活性物質(zhì)，如甜菜多糖、皂苷、甾醇、萜類、黃酮類及甜菜色素（包括甜菜紅素和甜菜黃素））等。食用紅甜菜根具有抗氧化[4-5]、降低血脂[6]、消炎和抑菌[7]、抗癌[8-9]、祛痰[10-11]、驅(qū)蟲[12]、鎮(zhèn)痛[13]等生物功效。

目前在植物中已經(jīng)鑒定出萜類物質(zhì)超過25000種，是一類以異戊二烯單元為基本骨架的天然烴類化合物，異戊二烯聚合物以及其所有的衍生物都隸屬于萜類化合物[14-15]。根據(jù)萜類物質(zhì)所含有的C原子個(gè)數(shù)，將萜類物質(zhì)分為了半萜、單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜和多萜。具體的存在形式有醇、醛、羧酸、酮等。此外，植物細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生多種內(nèi)源激素，有些激素的本質(zhì)是萜類，如赤霉素是一類屬于雙萜類化合物的植物激素；脫落酸是一種具有倍半萜結(jié)構(gòu)的植物激素[16]。萜類化合物中的信號(hào)物質(zhì)和化感物質(zhì)在植物防御系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用[17-18]。萜類物質(zhì)與人類健康關(guān)系密切，也是人類日常膳食的不可或缺的營養(yǎng)素，例如富含三萜類化合物的化學(xué)成分具有抗高血糖作用[19]，而且多種倍半萜類化合物對(duì)鐵死亡有抑制作用[20-21]。

為了比較不同品種紅甜菜根中萜類代謝物差異，本研究選取兩種東北地區(qū)主栽紅甜菜品種作為試驗(yàn)材料，采用超高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合代謝組學(xué)檢測技術(shù)，利用主成分分析法、聚類分析、正交偏最小二乘法等多種統(tǒng)計(jì)分析方法明確萜類差異代謝物，研究結(jié)果對(duì)開發(fā)利用紅甜菜塊根中萜類化合物，創(chuàng)制具有特殊萜類成分的紅甜菜種質(zhì)資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2個(gè)紅甜菜品種‘一品紅’和‘俄羅斯紅’均由哈爾濱工業(yè)大學(xué)程大友教授團(tuán)隊(duì)提供。2022年4月在哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田播種，9月28日收獲。2個(gè)品種的紅甜菜根用于萜類成分檢測。

1.2 試劑與儀器

試劑：甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，甲醇、乙腈品牌為Merck，甲酸品牌為Aladdin。儀器：研磨儀(MM 400)，德國Retsch 公司；超高效液相色譜(1290 UHPLC)，品牌Agilent；串聯(lián)色譜(Applied Biosystems 6500 QTRAP)，美國AB Sciex 公司；色譜柱(SB-C181.8μm，2.1 mm×100 mm)，品牌Agilent。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集和預(yù)處理選取同一生長環(huán)境下紅甜菜塊根作為試驗(yàn)材料，每個(gè)品種選取6 株長勢一致的甜菜根，處理備用。

斜45°取甜菜塊根1 cm 直徑的圓柱體，置于凍干機(jī)進(jìn)行真空冷凍干燥處理，再移至研磨儀30 Hz 條件下研磨1.5 min，至粉末狀；萬分之一天平稱取50 mg凍干粉末，將其溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每間隔30 min 渦旋一次，每次30 s，共進(jìn)行6 次渦旋；然后將樣品放置于離心機(jī)中，12 000 rpm 離心3 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾上清液，保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流速1 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量2 μL。流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈，梯度洗脫見表1。

表1 流動(dòng)項(xiàng)梯度洗脫

1.3.3 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)溫度500℃，離子噴霧電壓(IS)5500 V（正離子模式）/-4500V（負(fù)離子模式），離子源氣體I(GSI)，氣體II(GSII)和氣簾氣(CUR)分別設(shè)置為50、60和25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。QQQ 掃描使用MRM 模式，并將氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。通過進(jìn)一步去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)優(yōu)化，完成了各個(gè)MRM 離子對(duì)的DP 和CE。根據(jù)每個(gè)時(shí)期內(nèi)洗脫的代謝物，監(jiān)測一組特定的MRM離子對(duì)，以獲得檢測峰圖。

1.3.4 萜類化合物分析利用軟件Analyst 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，基于MWDB(metware database)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)混樣質(zhì)控樣本(Quality Control，QC)的總離子流圖及MRM代謝物檢測多峰圖，對(duì)樣品的代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性分析。利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式完成萜類物質(zhì)定量分析，分析方法為：計(jì)算一級(jí)質(zhì)譜中的提取離子色譜峰的峰面積，對(duì)所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對(duì)其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正，比較分析甜菜塊根萜類化合物的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 23.0(IBM Corporation，Armonk，NY，USA)及正交偏最小二乘法判別分析法(Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控

樣品經(jīng)HPLC-MS 分析，鑒定出的萜類化合物的保留時(shí)間、m/z、MS/MS 碎片離子等信息。結(jié)果顯示代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，即保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致，表明質(zhì)譜對(duì)同一樣品不同時(shí)間檢測時(shí)，信號(hào)穩(wěn)定性較好。儀器的高穩(wěn)定性為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供了重要的保障。從總離子流圖中可看出峰的純度高，達(dá)到試驗(yàn)數(shù)據(jù)后期的分析要求。正/負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1、圖2。

圖1 混樣樣品質(zhì)譜分析總離子（正離子）流圖

圖2 混樣樣品質(zhì)譜分析總離子（負(fù)離子）流圖

2.2 紅甜菜塊根中萜類物質(zhì)分析

基于廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)不同品種的紅甜菜塊根中的萜類成分進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明樣品中共含有48 種萜類化合物，其中二萜13 種，占比27.08%；三萜7種，占比14.58%；三萜皂苷7種，占比約14.58%；倍半萜7 種，占比約14.58%；倍半萜13 種，占比約27.08%；其他萜類1種，占比約2.08%。具體成分見表2。

表2 紅甜菜塊根中萜類成分

2.3 一品紅及俄羅斯紅甜菜中萜類差異代謝物分析

基于OPLS-DA 模型的結(jié)果，采取將fold change值、P-value 值、OPLS-DA 模型的VIP 值相結(jié)合的方法進(jìn)行篩選，得出以下8個(gè)顯著差異代謝物（圖3）。在48個(gè)萜類成分中，有39種成分在兩個(gè)品種間無顯著性差異，“俄羅斯”紅甜菜中有5種成分顯著高于“一品紅”，分別為桃葉珊瑚苷、苜蓿酸-3-O-葡萄糖醛酸苷-28-O-鼠李糖基(1,2)-阿拉伯糖苷、6′-O-芥子酰京尼平、筋骨草苷、原莪術(shù)醇，而6,9-二羥基-7-巨豆烯-3-酮等3種成分在“一品紅”中含量較高，見表3。

圖3 萜類差異代謝物火山圖

表3 “一品紅”和“俄羅斯”紅甜菜萜類差異代謝物

3 討論

莧科(Amaranthaceae)植物約有60 屬850 種，廣泛存在于自然界中。《中國植物志》收錄莧科植物13屬約40 種，其中7 屬20 種植物含有三萜化合物[21]。甜菜屬于莧科甜菜屬作物。萜類化合物是植物中比較重要的化合物之一，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多化合物是中國藥草的有效成分，同時(shí)它們也是一種重要的天然香料，是化妝品和食品工業(yè)不可缺少的重要原材料，其中一些萜類化合物還是重要的工業(yè)原料[22-23]。

現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，紅甜菜中發(fā)現(xiàn)11種三萜皂苷類化合物，但是其他萜類成分未見報(bào)道。本研究通過比較不同紅甜菜品種間根中萜類成分，確定在紅甜菜根中除了含有三萜類化合物外，還含有單萜、二萜、倍半萜及其他萜類成分。本研究表明不同品種紅甜菜根中萜類差異代謝物中，倍半萜化合物較多，其次還有三萜類化合物和單萜類化合物。倍半萜化合物的藥理作用是基于倍半萜類成分顯著的生物活性來實(shí)現(xiàn)的。通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，可發(fā)現(xiàn)倍半萜類成分具有神經(jīng)保護(hù)，免疫調(diào)節(jié)，治療糖尿病，抗腫瘤，改善急性腦缺血等作用[24]。如桃葉珊瑚苷，是植物的次生代謝產(chǎn)物，主要應(yīng)用在醫(yī)藥行業(yè)、日用化工用品行業(yè)和飼料等行業(yè)。其具有清濕熱、利小便、鎮(zhèn)痛、降壓、保肝護(hù)肝、抗腫瘤等作用。它還能促進(jìn)干細(xì)胞再生,明顯抑制乙型肝炎病毒DNA 的復(fù)制，其苷元及有效多聚體是一種抗菌素[25-26]。而紅甜菜根中萜類成分的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在“一品紅”和“俄羅斯紅”兩個(gè)紅甜菜根樣品中篩選出的差異代謝物8種，其中下調(diào)物質(zhì)5種，分別為桃葉珊瑚苷、苜蓿酸-3-O-葡萄糖醛酸苷-28-O-鼠李糖基(1,2)-阿拉伯糖苷、6′-O-芥子酰京尼平苷、筋骨草苷和原莪術(shù)醇；上調(diào)的物分別為Cis-guai-10-en-4α,11-diol、6′-O-葡萄糖桃葉珊瑚苷和6,9-二羥基-7-巨豆烯-3-酮。不同品種紅甜菜中存在顯著差異的萜類代謝物，可作為特征代謝物做進(jìn)一步分析。