郭思言 蔡翔宇 鄭文 景渝 何夢婷 程妮酈 李曉華郗存顯 李光滿 劉高峰 廖海霞

（1.重慶海關(guān)技術(shù)中心 重慶 400020；2.南寧海關(guān)技術(shù)中心；3.重慶海關(guān)；4.電子科技大學實驗中學）

0 引言

大麻可作為藥用植物使用，其主要活性成分是以四氫大麻酚（THC）為代表的包括大麻二酚（CBD）、大麻酚（CBN）等在內(nèi)的大麻素類物質(zhì)，具有成癮性[1-2]。合成大麻素則是2004 年以來，在大麻素替代品中發(fā)現(xiàn)與THC 結(jié)構(gòu)相似的一類化學物質(zhì)，屬于新精神活性物質(zhì)，是毒品市場上頻繁出現(xiàn)的被稱為“K2”“K3”“小樹枝”“莫合煙”“娜塔莎” 等毒品的主要成分[3]，是種類最多、濫用最嚴重的第三代毒品。近年來，國際上對大麻物質(zhì)合法化的呼聲越來越高，多國放松了對食品中添加使用大麻素的管制，2019—2020年，我國多個海關(guān)在口岸截獲了含有大麻素的蛋糕、巧克力等食品，其偽裝性極強。目前，關(guān)于天然大麻素及合成大麻素類物質(zhì)檢測的報道，以毒品違法犯罪案件、物證鑒定的方法應(yīng)用居多，主要集中于香料、血液、毛發(fā)等樣品中[4-9]，以食品為基體進行檢測的報道較少。其中，屬于新精神活性物質(zhì)的苯基異丙基酰胺系列的合成大麻素類物質(zhì)從2015 年起才逐漸開始流行[10]，出現(xiàn)時間較短，其分析方法的研究較少，氨甲酰基吲哚/吲唑酰胺類合成大麻素是近年來查獲數(shù)量較多的合成大麻素類[11]，大麻素的濫用帶來的成癮性及對健康造成的危害不容忽視，2021 年7 月1 日起，我國成為全球首個整類列管合成大麻素類物質(zhì)的國家[12]，因此對食品中合成大麻素類化合物也亟需建立檢測方法。

目前，檢測大麻素類化合物的常用方法包括液相色譜法[13-14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]等，但基質(zhì)多數(shù)集中于生物樣本中。近年來，已有研究者開始關(guān)注食品中的大麻素類物質(zhì)[17-19]，但食品中新型合成大麻素相關(guān)研究幾乎空白，已無法應(yīng)對當前國際上出現(xiàn)的含多種大麻素類食品的現(xiàn)狀。本研究建立了超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法同時測定餅干、蛋糕、飲料3 種食品基質(zhì)中6 種新型合成大麻素類化合物的方法，并且建立了基于高分辨質(zhì)譜的合成大麻素類物質(zhì)的特征二級碎片離子譜圖庫，同時研究了不同類別合成大麻素化合物的特征碎片來源，對識別含有新型合成大麻素類物質(zhì)的食品和口岸進出境食品安全監(jiān)測具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準溶液合成大麻素（ADBICA、AB-PINACA、ADBCHMINACA、CUMYL-THPINACA、CUMYL-4CNBINACA、CUMYL-5F-P7AICA）（純度均≥95%，上海原思標物科技有限公司）；乙腈（色譜純），甲酸（色譜純），乙酸銨（色譜純），乙酸鋅（分析純），亞鐵氰化鉀（分析純），HLB 固相萃取柱（OASIS，6 mL，300 mg）；中性氧化鋁（Alumina-N）固相萃取柱（CNW，500 mg，3 mL）；硅膠（Si）柱（CNW，500 mg，3 mL）。

餅干、蛋糕、飲料樣品來源于入境檢測樣品或通過跨境電商購買。

1.2 儀器設(shè)備

Thermo Scientific Q Exactive 高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；摩爾超純水器（重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司）；3-30K 離心機（德國Sigma 公司）；KQ500E 系列超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋混合器（美國Scilogex 公司）。

1.3 樣品前處理

餅干、蛋糕樣品：準確稱取1g 樣品（精確至0.01 g）于50mL 離心管中，加入6mL 甲醇，使樣品充分濕潤混合；加入2 mL 220 g/L 乙酸鋅溶液和2 mL 106 g/L 亞鐵氰化鉀溶液，超聲15min，以3000r/min 離心3 min；準確移取5 mL 上層清液加入5 mL 水稀釋，過經(jīng)5 mL甲醇、5 mL 水活化后的HLB 柱，用5 mL 50%甲醇水溶液淋洗，5 mL 甲醇洗脫后40℃下氮吹至近干；加入甲醇1 mL 渦旋混勻，過0.22 μm 濾膜待測定。

飲料樣品：準確稱取1 g 樣品（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入1 g 氯化鈉，加入10 mL 甲醇渦旋混勻；準確移取5 mL 上層清液加入5 mL 水稀釋，過經(jīng)5 mL 甲醇、5 mL 水活化后的HLB 柱，用5 mL 50%甲醇水溶液淋洗，5 mL 甲醇洗脫后40℃下氮吹至近干；加入甲醇1 mL 渦旋混勻，過0.22 μm 濾膜待測定。

1.4 標準溶液的配制

取一定量固體標準品用甲醇溶解配制成1000 mg/L標準儲備溶液，置于-20℃冰箱內(nèi)避光保存。根據(jù)實際分析要求，用甲醇稀釋成不同濃度的標準系列工作液。分別稱取空白基體，按“1.3”樣品前處理進行操作至氮吹近干，加入標準系列工作液，混勻，配制成基質(zhì)系列工作溶液。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Waters C18色譜柱（200 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A 為甲醇，流動相B 為2 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～1.0 min，10%A；1.0～2.0 min，10%A～40%A；2.0～3.5 min，40%A；3.5～5.0 min，40%～80%A；5.0～8.0 min，80%A；8.0～8.5 min，80%～10%A；8.5～10.0 min，10%A；流速：0.30 mL/min；柱溫：40°C；進樣體積：5μL；分析時間：10 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（ESI）源：正離子模式；掃描方式：全掃描-自動觸發(fā)二級掃描模式（full MS-ddMS2）；毛細管溫度：500℃；噴霧電壓：3 kV；最大駐留時間（Maximum IT）：50 ms；掃描范圍：m/z 100～1 000；Top N：5；碰撞能量（步進值）：40 eV（50%）。新型合成大麻素信息參數(shù)見表1。

表1 新型合成大麻素名稱等其他信息參數(shù)Table 1 Compound name and other information parametersof new synthetic cannabinoids

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗研究的合成大麻素類化合物整體極性中等偏低，因此采用反相色譜柱進行分離，比較了C18（Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1 mm×100 mm，1.7μm）、HSS T3（Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱的分離效果及響應(yīng)，結(jié)果表明，C18色譜柱對各化合物的分離效果優(yōu)于T3柱，而不同色譜柱的品牌對分離效果并無顯著差異，因此，選擇C18作為分析柱。

本實驗考察了不同流動相體系對大麻素類化合物的分離效果及化合物響應(yīng)的影響，分別比較了甲醇、乙腈作為有機相，水、2 mmol/L 乙酸銨溶液、含0.1%甲酸的2 mmol/L 乙酸銨溶液作為水相時待測物的分析情況，結(jié)果表明，水相中加入2 mmol/L 乙酸銨溶液時，化合物峰型得到明顯改善，由于待測物的電離模式為正離子模式，加入適量甲酸有助于待測物的離子化，以增加響應(yīng)，因此選擇含0.1%甲酸的2 mmol/L 乙酸銨溶液作為水相。由于化合物極性的相似性，選擇乙腈作為有機相時，化合物出峰較快且峰形較差，為兼顧溶劑效應(yīng)和分離效果，本實驗選擇甲醇作為有機相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用流動注射的方式，將大麻素類化合物混合標準溶液注入質(zhì)譜儀，分別考察在正離子和負離子電離模式下大麻素類化合物的響應(yīng)，實驗表明，新型合成類大麻素在正離子模式下響應(yīng)較好，負離子模式響應(yīng)較低，因此采取正離子電離模式進行檢測，并在相應(yīng)的電離模式下優(yōu)化方法的噴霧電壓、碰撞氣流速和碰撞能量等，優(yōu)化好的參數(shù)下，各合成大麻素化合物的提取離子流圖見圖1。

圖1 各大麻素類化合物的提取離子流圖Fig.1 Chromatograms for ion extraction of various cannabinoid compounds

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

本實驗考察了甲醇、乙腈、50%甲醇水溶液和50%乙腈水溶液作為提取溶劑時，各大麻素類化合物在餅干、蛋糕中、飲料中的提取效率，在樣品中添加混合標準溶液，比較各化合物在不同提取溶劑下的回收率，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，由于合成大麻素類化合物在甲醇、乙腈有機溶劑中溶解度較好，絕大部分化合物用甲醇提取時響應(yīng)較好，加入沉淀劑可使餅干、蛋糕中的脂類和蛋白質(zhì)沉淀，去除干擾。由圖2 可知，各化合物在甲醇中的整體響應(yīng)均優(yōu)于甲醇水溶液，而在純水中的的響應(yīng)較差，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

圖2 大麻素類化合物在不同提取溶劑中的響應(yīng)Fig.2 Response of cannabinoids in different extraction solvents

2.4 凈化方式的選擇

由于食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，餅干、蛋糕等基質(zhì)油脂較多，部分樣品在被直接提取離心后，其提取液上層會出現(xiàn)油脂，提取液直接過膜后，濾液渾濁，影響測定，因此方法需要進行凈化。本文選擇了Si、HLB、Alumina-N 3 種固相萃取柱對樣品進行凈化，比較不同固相萃取柱的凈化效果，由圖3 可知，Si 柱對大部分化合物的回收率較低，僅為46.4%～70.5%，HLB 凈化時大部分化合物的回收率較高，優(yōu)于Alumina-N 柱，因此在前處理過程采用HLB 固相萃取柱進行凈化。

圖3 不同固相萃取柱對大麻素類化合物的回收率Fig.3 Recovery of cannabinoid compounds by different SPE columns

2.5 標準曲線和定量限

分別以各合成大麻素化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。以≥3 倍信噪比（S/N≥3）確定檢出限（LOD），以≥10 倍信噪比（S/N≥10）確定定量限（LOQ），餅干和蛋糕中大麻素類化合物的LOD 為3 μg/kg，LOQ 為10 μg/kg，飲料中大麻素類化合物的LOD 為0.6 μg/kg，LOQ 為2 μg/kg。各化合物在1～500 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.999，大麻素類化合物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)詳見表2。

表2 合成大麻素類化合物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient of cannabinoid compounds

2.6 回收率和精密度

在蛋糕、餅干空白食品基體中加入10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 的3 個濃度水平的標液，飲料中加入2 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg 的3 個濃度水平的標液，進行6 個平行測定，計算回收率和精密度。結(jié)果如表3 所示，合成大麻素類化合物在3 種不同食品基質(zhì)中的3 個添加濃度水平的平均回收率為75.1%～106.7%。相對標準偏差（RSD）為2.5%～10.3%（n=6），表明該方法準確性和精密度較好，能夠滿足實際檢測的需要。

表3 3 個添加水平下各化合物的平均回收率及精密度（n=6）Table 3 The average recovery and precision of each compound under 3 additive levels（n=6）

2.7 非定向篩查方法的建立

非定向篩查方法主要應(yīng)用于暫時無法利用獲取標準品或是對未知物種類數(shù)量無法確定的情況，可根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫來識別風險化合物，進行定性確證。本研究利用高分辨質(zhì)譜可自動觸發(fā)進行二級質(zhì)譜碎裂的特性，用建立的色譜質(zhì)譜條件對混合標準品溶液進樣分析，采用全掃描-自動觸發(fā)二級掃描模式采集待測化合物的質(zhì)譜信息，獲取分子離子、碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間等基礎(chǔ)參數(shù)，導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫中，完善化合物的名稱、分子式、掃描方式、化合物類別等信息，建立完整的化合物數(shù)據(jù)庫。同時將標準品在確定的質(zhì)譜條件下得到的二級質(zhì)譜圖導(dǎo)入譜圖儲存庫中，建立完整的化合物全息數(shù)據(jù)庫，利用Trace Finder 3.0 軟件進行篩查。

為保證化合物能在通過數(shù)據(jù)庫匹配的同時降低假陽性概率，優(yōu)化設(shè)置的母離子精確質(zhì)量數(shù)偏差為5 ppm，碎片離子精確質(zhì)量數(shù)偏差為10 ppm，同位素豐度相似度90%，保留時間偏差在±2.5%內(nèi)，譜圖相似度比設(shè)置不小于0.60。若采集的色譜圖滿足母離子精確質(zhì)量數(shù)偏差在5 ppm 內(nèi)，保留時間偏差在±2.5%內(nèi)（缺少標品可不考慮），可初步判定試樣中含有相關(guān)化合物。進一步對碎片離子個數(shù)、同位素豐度相似度、二級譜圖庫匹配程度進行匹配，若以上條件均滿足，可判定為陽性樣品。本實驗通過向空白樣品中添加檢出限水平的標液進行篩查分析，結(jié)果表明，加標樣品中均能篩查出待測物。

2.8 高分辨質(zhì)譜二級譜圖分析

將合成大麻素類化合物標液在優(yōu)化好的色譜條件下經(jīng)Q Exactive 高分辨質(zhì)譜儀分析，以全掃描-自動觸發(fā)二級掃描（full MS-ddMS2）監(jiān)測，采集不同類別大麻素的二級譜圖，導(dǎo)入譜圖庫。結(jié)合大麻素類化合物母核、采集的二級特征碎片離子信息，推測出裂解規(guī)律。氨甲?；胚?吲唑酰胺類和苯基異丙基-酰胺系列合成大麻素的母核化學結(jié)構(gòu)及二級碎片離子分別見圖4 和圖5，碎裂途徑推測見圖6。

圖4 合成大麻素類化合物二級碎片離子圖Fig.4 Secondary fragment ion diagram of synthetic cannabinoid compounds

圖5 結(jié)構(gòu)母核Fig.5 structure parent nuclei

圖6 碎裂途徑Fig.6 fragmentation pathway

由圖4 可知，苯基異丙基-酰胺系列合成大麻素（CUMYL-THPINACA、CUMYL-4CN-BINACA、CUM YL-5F-P7AICA）的裂解途徑大致分為2 種：一種是結(jié)構(gòu)式中的苯基異丙基與相連的酰胺鍵斷裂，形成苯基異丙基離子（m/z 119.085 5），進而形成卓鎓離子（m/z 91.054 2）；另一種是脫去苯基異丙基，形成吲哚酰胺離子，或是酰胺鍵斷裂，形成吲哚氧離子。氨甲?；胚?吲唑酰胺類合成大麻素（ADBICA、ABPINACA、ADB-CHMINACA）首先失去NH3，生成氨甲?；胚?吲唑酰陽離子，氨甲?；胚?吲唑酰陽離子進而發(fā)生酰胺鍵斷裂，生成R2取代的吲哚/吲唑酰陽離子，脫去R2生成吲哚/吲唑酰陽離子（m/z 144.044 4 或145.039 6），氨甲?；胚蝓ｊ栯x子還有可能脫去CO，形成五元環(huán)。其碎裂途徑推測見圖5。

2.9 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）是指樣品在化學分析過程中，其干擾組分對分析物的分析過程有顯著的增強或抑制效果，對結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響。其計算方式為：ME（%）=B/A×100%，是指待測物在基質(zhì)中的響應(yīng)值與在純?nèi)軇┲邢嗤看郎y物的響應(yīng)值之比。結(jié)果表明，在餅干、蛋糕、飲料樣品中均存在不同程度的基體效應(yīng)，通過對樣品進行稀釋和固相萃取的方式來降低基體效應(yīng)，各基體的基體效應(yīng)程度可降低至30%以下，處于中等強度或弱強度抑制范圍內(nèi)，能夠滿足檢測要求。

2.10 實際樣品的測定

用優(yōu)化好的前處理及色譜質(zhì)譜方法對來源于出入境檢測樣品及購買于跨境電商的餅干、蛋糕、飲料樣品進行檢測，結(jié)果表明，所有樣品均無合成大麻素類化合物檢出。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定餅干、蛋糕、飲料3 種食品基質(zhì)中多種大麻素類化合物的檢測方法，能夠同時測定多種合成大麻素類化合物。該方法采用基質(zhì)配標法有效降低基質(zhì)效應(yīng)，線性范圍廣，回收率和精密度較好，能夠滿足目前國際上對合成大麻素類化合物的檢測要求，為一線執(zhí)法人員提供技術(shù)保障。同時，通過建立不同母核類型的大麻素類化合物二級譜圖庫，分析主要特征二級碎片離子，為無標準品對照條件下鑒定合成大麻素類化合物提供有效技術(shù)手段。