雷美康 彭芳 陳瑤 許源 余琪 鄧徐霞 祝子銅*

（1.杭州海關(guān)技術(shù)中心 浙江杭州 310016；2.衢州海關(guān)綜合技術(shù)服務中心；3.溫州海關(guān)綜合技術(shù)服務中心）

0 引言

衢枳殼是蕓香科植物常山胡柚（citrus chang shan-huyou）的干燥未成熟果實，主產(chǎn)于浙江，2015版《浙江省中藥炮制規(guī)范》修訂后，將“常山胡柚片”收錄其中，并正式命名為“衢枳殼”[1-4]。衢枳殼味苦、辛、酸，性微寒，歸脾、胃經(jīng)，有理氣寬中、行滯消脹功效，可用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等癥[5-6]。目前，衢枳殼年產(chǎn)萬余噸，實現(xiàn)了胡柚“藥食同源”“一果三用”的全產(chǎn)業(yè)資源化利用，當?shù)胤N植戶增收2 億多元，“衢枳殼”也列入浙江省“新浙八味”中藥材培育品種[7-9]。衢枳殼樹為多年生植物，其生長的土壤、環(huán)境和氣候等條件的影響在一定程度上增加了外源污染物殘留的風險。

2019 年10 月，黨中央國務院《關(guān)于促進中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見》指出：分區(qū)域、分品種完善中藥材農(nóng)藥殘留、重金屬限量標準，建立最嚴謹標準。衢枳殼雖然被收錄于《浙江省中藥炮制規(guī)范》和新“浙八味”中藥材培育名單，但目前尚無衢枳殼中農(nóng)藥、真菌毒素和重金屬的檢驗標準及防霉儲藏方法，不利于生產(chǎn)經(jīng)營行為的規(guī)范及產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)管。近年來，隨著氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的推廣應用，對中藥材中數(shù)十種以上農(nóng)藥殘留同時檢測的技術(shù)成為研究熱點[9-16]。

本文以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）為檢測手段，以分散固相萃取凈化方法為基礎，并在衢枳殼上200 余種不同農(nóng)藥分析中的適用性，對衢枳殼品質(zhì)控制關(guān)鍵技術(shù)研究并推廣應用，推動衢枳殼產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展，為建設健康產(chǎn)業(yè)提供重要支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（GCMS-TQ8040，日本島津公司）；超純水裝置（Milli-Q Advantage A10，美國Millipore 公司）；漩渦混（MS 3 digital，德國IKA 公司）；氮吹儀（MD 200，杭州奧盛儀器公司）；超聲波清洗儀（KQ-500B，昆山市超聲儀器公司）；高速離心機（Multifuge X1R，美國Thermo Scientific 公司）；高速粉粹機（QE-200g，浙江屹立工貿(mào)有限公司）。

農(nóng)藥混合標準品：濃度為50 μg/mL（±3%，k=2），0～8℃避光保存，北京振翔科技有限公司；內(nèi)標物質(zhì)：環(huán)氧七氯，介質(zhì)為甲醇，濃度為100 μg/mL（±3%，k=2），0～8℃避光保存，北京振翔科技有限公司；內(nèi)吸磷-S（1 000 μg/mL，介質(zhì)為丙酮）、氟甲腈（1 000 μg/mL，介質(zhì)為丙酮）、o，p'-三氯殺螨醇（100 μg/mL，介質(zhì)為丙酮）、氟蟲腈砜（1 000 μg/mL，介質(zhì)為丙酮）、苯線磷（1 000 μg/mL，介質(zhì)為丙酮），上海安譜璀世標準技術(shù)服務有限公司；甲醇、乙酸乙酯：色譜純，美國fisher公司；分散固相萃取凈化管：無水硫酸鎂1 200 mg，N-丙基乙二胺400 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠400 mg，石墨化碳黑200 mg，上海安譜實驗科技股份有限公司；冰醋酸：優(yōu)級純，上海國藥集團；無水硫酸鎂、無水硫酸鈉，上海安譜實驗科技股份有限公司；試驗樣品：某衢枳殼生產(chǎn)加工企業(yè)提供，常溫保存。

1.2 標準儲備溶液配制

5 種農(nóng)藥混合標準品：單獨農(nóng)藥標準儲備溶液（1 000 mg/L）用乙腈逐級稀釋至50 μg/mL。

內(nèi)標溶液：內(nèi)標儲備溶液（100 μg/mL）用乙腈稀釋至5 μg/mL 為內(nèi)標溶液。

基質(zhì)混合標準工作溶液：空白基質(zhì)溶液氮氣吹干，加入20 μL 內(nèi)標溶液，加入1 mL 相應質(zhì)量濃度的混合標準溶液復溶，過微孔濾膜?；|(zhì)混合標準工作溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 標準工作曲線

精確吸取一定量的混合標準溶液，逐級用乙酸乙酯釋成質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.10 和0.50 mg/L的標準工作溶液?？瞻谆|(zhì)溶液氮氣吹干，加入20 μL內(nèi)標溶液，分別加入1 mL 上述標準工作溶液復溶，過微孔濾膜配制成系列基質(zhì)混合標準工作溶液，供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。以農(nóng)藥定量離子峰面積和內(nèi)標物定量離子峰面積的比值為縱坐標，農(nóng)藥標準溶液質(zhì)量濃度和內(nèi)標物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4 樣品制備

取適量樣品（約為容器的90%），置于粉粹機中1～2 min，粉末過三號篩，未過篩的大顆粒重新放入粉粹機再次粉碎。試樣放入密封袋中，干燥保存。

1.5 樣品前處理過程

稱取3 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL 離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min。精密加入乙腈10 mL，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩5 min。加入無水硫酸鎂6 g 與無水乙酸鈉1.5 g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩3 min，水浴冷卻至常溫，4 000 r/min 離心5 min，取上清液6 mL，置預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無水硫酸鎂1 200 mg，N-丙基乙二胺400 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠400 mg，石墨化碳黑200 mg）中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩5 min 使凈化完全，4 000 r/min 離心5 min，精密吸取上清液2 mL，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至近干。離心管均加入20 μL 內(nèi)標溶液（5 mg/L），再用乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋混勻，4 000 r/min 離心5 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.6 GC-MS/MS 條件

1.6.1 氣相色譜條件

色譜柱：（5%苯基）甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱（Rtx-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm）。柱溫箱升溫程序：初始溫度90℃，保持1 min，以30℃/min 的速率升至130℃，再以10℃/min 的速率升至300℃，保持10 min，總運行29.33 min。載氣：高純氦氣（He）；恒線速度模式，線速度55.0 cm/sec；進樣口溫度：250℃；進樣方式：高壓不分流進樣，進樣量：1 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：230℃；接口溫度：290℃。溶劑延遲時間：2.41 min；采用多反應監(jiān)測模式（MRM），每個農(nóng)藥選取2 個特征MRM反應，其中一個作為定量離子對，另一個作為定性離子對，具體見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters

1.7 實驗步驟和定量方法

將基質(zhì)混合標準工作溶液和試樣溶液依次注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，保留時間和定性離子定性，測得定量離子峰面積，待測樣液中農(nóng)藥的響應值應在儀器檢測的定量測定線性范圍之內(nèi)，超過線性范圍時應根據(jù)測定濃度進行適當倍數(shù)稀釋后再進行分析。內(nèi)標法進行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗選取適用于多農(nóng)殘分離的（5%苯基）甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱（Rtx-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm），通過優(yōu)化進樣方式、載氣流速、程序升溫等測定條件，獲得多種農(nóng)殘測定的氣相色譜分離條件。

在全掃描模式下，確定224 種測定農(nóng)藥目標物和內(nèi)標物的保留時間和主要母離子，然后對母離子進行碰撞解離，并掃描其碎片離子，得到母離子對應的碎片子離子；優(yōu)化碰撞能量、碰撞氣壓等參數(shù)，選擇豐度較強和干擾較少的離子對作為定量和定性離子對。優(yōu)化后農(nóng)藥目標物和內(nèi)標物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 基質(zhì)效應評價

基質(zhì)效應是痕量分析的常見現(xiàn)象。樣品基質(zhì)中的共提取干擾物影響待測化合物的儀器響應值，使得相同濃度的目標化合物在溶劑標準溶液與基質(zhì)標準溶液的響應值不一致，表現(xiàn)為基質(zhì)標準溶液的儀器響應發(fā)生增強或抑制。本文采用下式對目標化合物的基質(zhì)效應進行評價：基質(zhì)效應=（樣品基質(zhì)中農(nóng)藥的峰面積/純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的峰面積）－1，大于或小于1 分別表示基質(zhì)增強或基質(zhì)抑制[17-18]。選取濃度水平為0.05 mg/kg 的200 種農(nóng)藥（剔除易分解農(nóng)藥）進行基質(zhì)效應實驗，結(jié)果表明，綠谷隆和去草凈（特丁凈）基質(zhì)抑制，基質(zhì)效應分別為0.82 和0.86；45 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應介于1～2 之間；153 種農(nóng)藥基質(zhì)效應大于2，其中氟酰胺基質(zhì)效應最強，為3.01。為克服基質(zhì)效應的影響，采用基質(zhì)匹配內(nèi)標標準曲線法進行定量。

2.3 線性關(guān)系和方法定量限

按照“1.2”方法配制基質(zhì)混合標準工作溶液，采用本方法進行前處理和測定。以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，進行回歸分析。結(jié)果表明，224 種農(nóng)藥均在0.01～0.5 mg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.99。由于待測農(nóng)藥數(shù)量多，難以逐一稀釋至每個農(nóng)藥的最低檢出濃度，因此在空白樣品中添加回收實驗，得到方法定量限（LOQ）為0.02～0.10 mg/kg。日常衢枳殼中多種農(nóng)藥殘留快速篩查，可采用單個濃度點定量。

2.4 添加回收試驗

將混合標準儲備溶液添加到衢枳殼空白樣品中，按“1.4”方法分別制得加標水平為0.02、0.05、0.10 mg/kg的樣品溶液，每個水平重復6 次。其中，0.10mg/kg 加標水平下的平均回收率和相對標準偏差（RSD）：224種農(nóng)藥的回收率為53.06%～100.56%，RSD 在5.03%～16.79%；0.05 mg/kg 加標水平下的平均回收率和相對標準偏差（RSD）：除禾草敵、二溴磷、脫乙基阿特拉津（脫乙基莠去津）、阿特拉通、綠谷隆、艾氏劑、對硫磷、環(huán)唑醇-1（環(huán)丙唑醇-1）、氟環(huán)唑-1、氟環(huán)唑-2、氟氯氰菊酯-2、氟氯氰菊酯-3 等12 種農(nóng)藥外，其余212 種農(nóng)藥的回收率為50.56%～104.44%，RSD 在3.90%～19.17%；0.02 mg/kg 加標水平下的平均回收率和相對標準偏差（RSD）：除敵敵畏、禾草敵、異丙威、二溴磷、脫乙基阿特拉津（脫乙基莠去津）、阿特拉通、內(nèi)吸磷-S、嘧霉胺、克百威、西瑪津、綠谷隆、炔苯酰草胺、艾氏劑、嗪草酮、氟甲腈、甲基對硫磷、對硫磷、敵稗、甲拌磷亞砜、苯硫威、2，4'-滴滴滴、苯線磷、異狄氏劑、抑霉唑、蟲螨磷-1、氟蟲腈砜、苯草醚、環(huán)唑醇-1（環(huán)丙唑醇-1）、丙環(huán)唑-1、丙環(huán)唑-2、三唑磷、氟環(huán)唑-1、氟環(huán)唑-2、環(huán)嗪酮、三氯殺螨砜、氯菊酯-1、氟氯氰菊酯-2、氟氯氰菊酯-3、氟氯氰菊酯-4、溴氰菊酯-2、o，p-三氯殺螨醇等41 種農(nóng)藥外，其余183 種農(nóng)藥的回收率為34.72%～112.50%，RSD在6.27%～26.70%。

對各加標水平下224 種農(nóng)藥的回收率進行分析。結(jié)果顯示，0.02 mg/kg 加標水平下有170 種農(nóng)藥的回收率為55%～120%，占農(nóng)藥總數(shù)的75.9%；0.05 mg/kg 加標水平下有211 種農(nóng)藥的回收率為55%～120%，占總數(shù)的94.2%；0.10 mg/kg 加標水平下有223種農(nóng)藥的回收率為55%～120%，占總數(shù)的99.6%。

3 結(jié)論

本文采用乙腈提取和分散固相萃取對樣品進行提取與凈化，建立了快速檢測枳殼中224 種農(nóng)藥殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。本方法樣品前處理簡便、快速，靈敏度與準確度滿足農(nóng)藥殘留檢測要求，可用于衢枳殼中農(nóng)藥多殘留的快速測定，為衢枳殼農(nóng)藥的合理規(guī)范使用提供了技術(shù)參考。