王海玲 霍思宇 余洋 王一名 張凡 陳冬東 彭濤*

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 北京 100176；2.檢科院（北京）科學(xué)技術(shù)有限公司；3.中檢科（北京）測試認(rèn)證有限公司）

0 引言

我國是世界上鵪鶉蛋用量最大的國家之一，也是世界鵪鶉養(yǎng)殖大國。根據(jù)國家市場監(jiān)督管理總局政務(wù)服務(wù)平臺數(shù)據(jù)，自2014 年以來，共抽檢鵪鶉蛋產(chǎn)品5 248 次，其中不合格次數(shù)為167 次，絕大多數(shù)以獸藥殘留超標(biāo)為主，殘留藥物包括酰胺類、喹諾酮類、磺胺類、激素類、抗蟲藥類等[1-7]。

動物源性食品中多獸藥殘留的檢測主要包括樣品前處理和檢測分析兩大部分[8]。由于動物源性食品成分復(fù)雜、基質(zhì)影響較大，以及其中所含的獸藥殘留相對較低，故對于動物源性食品中多種獸藥殘留很難進(jìn)行分離與純化[9]。因此，樣品的前處理是獸藥殘留檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響獸藥殘留化合物分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[10]。禽蛋類獸藥殘留常用固相萃取柱凈化，最常用的為C18固相萃取柱，市場上生產(chǎn)C18固相萃取柱的廠家眾多，技術(shù)水平差異也較大，如何能夠有效評估不同廠家C18固相萃取柱對鵪鶉蛋中常檢獸藥之間凈化的差異，是擺在研究者面前的難題。

本研究通過測定鵪鶉蛋中大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、激素類、抗蟲藥類6 類代表性獸藥殘留，研究不同C18固相萃取柱對鵪鶉蛋中6類獸藥殘留測定的影響。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

鵪鶉蛋（北京農(nóng)貿(mào)市場）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、林可霉素、地塞米松、抗蚜威、四環(huán)素（檢科院（北京）科學(xué)技術(shù)有限公司）。

甲醇、乙腈、丙酮（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國賽默飛公司）；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司）。

固相萃取柱（規(guī)格：500 mg/6 mL，分別采購自6個(gè)廠家，分為A 柱、B 柱、C 柱、D 柱、E 柱、F 柱）。

1.1.2 儀器

GM300J 型刀式均質(zhì)器（美國通用公司）；LC20AD-8045MS/MS 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；NBL 223i 型分析天平（英國艾德姆公司）；MS205DU型分析天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q Integral 5型超純水（德國Merck 公司）；RQ-7000V 型超聲儀（昆山超聲儀器公司）；IKA MS3 型漩渦混合器（德國IKA 公司）；LG-25M 型高速離心機(jī)（四川蜀科公司）；移液器（5 mL、1 mL、200 μL，德國Eppendorf 公司）；濾膜（0.22 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)過程

1.2.1 試樣制備將采購的鵪鶉蛋去殼后于頂置均質(zhì)器中均質(zhì)混勻，將蛋液灌裝于PET 瓶中，密封后于-18℃保存。

1.2.2 樣品的提取

稱取5 g 試樣于50 mL 離心管中，加入20 mL 0.5%甲酸甲醇提取液，渦旋振蕩2 min，再加入提取鹽包（4 g Na2SO4，1 g NaCl），渦旋振蕩2 min，8 000 r/min離心5 min 后，取上清液10 mL 置于雞心瓶中，于128 psi、40℃的條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1 mL甲醇溶液充分溶解。

1.2.3 凈化

C18固相萃取柱需要活化，分2 次加入5 mL 甲醇活化，上樣前保持柱子濕潤；加入濃縮后的提取液，分次加入10 mL 甲醇洗脫；收集所有液體于雞心瓶中，于128 psi、40℃的條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干；加入1 mL 甲醇/水（1∶1 v/v）溶液充分溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后，用HPLC-MS/MS 分析。

1.2.4 儀器設(shè)定條件

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，粒徑1.8 μm）；柱溫：40℃；流動相：A 相為0.1%甲酸水溶液；B 相為甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。洗脫梯度：0 min，0.1%甲酸水溶液=97.0%；3 min，0.1%甲酸水溶液=0.0%；4.5 min，0.1%甲酸水溶液=0.0%；6 min，0.1%甲酸水溶液=97.0%。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；正離子模式；電噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：300℃；霧化氣：3 L/min；輔助加熱氣：10 L/min。

1.3 評價(jià)方法

1.3.1 凈化效果

取空白溶劑和過不同萃取柱的空白基質(zhì)溶液，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制被測化合物系列基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液和溶劑校準(zhǔn)溶液，濃度范圍：5～200 μg/L，按照“1.2.4”條件進(jìn)行測定，得到目標(biāo)物質(zhì)離子色譜圖，通過目視法比較不同樣液的色譜圖的差異情況，比較各色譜柱的凈化效果。同時(shí)以檢出峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/L）得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與相應(yīng)溶劑校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值，評估基質(zhì)效應(yīng)。

1.3.2 回收率和精密度

采用不同C18固相萃取柱，對鵪鶉蛋中6 類獸藥殘留進(jìn)行測定，比較低、中、高（5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg）3 個(gè)濃度水平固相萃取柱的加標(biāo)回收的平均回收率、精密度，評價(jià)其檢測效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

本研究分別比較了不同色譜柱對于這6 類獸藥的分離效果，選擇使用ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，粒徑1.8 μm）；柱溫：40℃。流動相中加入適量甲酸有利于化合物離子化，因此本實(shí)驗(yàn)采用0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%6 種不同含量的甲酸水作為流動相對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，對比目標(biāo)物質(zhì)的信號響應(yīng)強(qiáng)度、峰型。

測定結(jié)果表明，甲酸濃度過低會降低目標(biāo)物質(zhì)信號強(qiáng)度，濃度過高會影響峰型，易出現(xiàn)拖尾峰，最終選用0.1%甲酸水作為流動相無機(jī)流動相。采用甲醇、乙腈作為有機(jī)相對比發(fā)現(xiàn)，甲醇作為流動相時(shí)，色譜響應(yīng)優(yōu)于乙腈，故本實(shí)驗(yàn)選取甲醇作為有機(jī)相。對比0.1%甲酸-乙腈（2+8、7+3）等度洗脫和不同比例的梯度洗脫程序后發(fā)現(xiàn)，梯度洗脫程序優(yōu)于等度洗脫，能使目標(biāo)物與干擾物質(zhì)有效分離，優(yōu)化后的梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，ESI 正負(fù)離子掃描，優(yōu)化離子對，由低到高依次設(shè)定碰撞能量（CE），選取響應(yīng)最高值作為CE，并通過Q3 Prerod 偏差優(yōu)化選取最優(yōu)產(chǎn)物離子，從中選取響應(yīng)較高的作為定量離子。掃描結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物在正離子監(jiān)測模式時(shí)可形成豐度較高的[M+H]+，故采用正離子掃描模式。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2。

表2 保留時(shí)間和優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Retention time and optimized mass spectro metryconditions

2.2 提取條件的設(shè)計(jì)

本研究查閱了大量文獻(xiàn)，分析其中對于蛋液中獸藥殘留的提取方式，分別比較了不同的提取液和提取方法，通過添加回收的方式比較回收率，確定合適的前處理過程。提取液選擇甲醇、乙腈、0.5%甲酸甲醇、0.5%甲酸乙腈4 種，結(jié)果見表3。

表3 不同提取液對6 類獸藥的回收率的影響Table 3 Matrix effect of six veterinary drugs

提取方法選擇渦旋振蕩、超聲提取、渦旋振蕩+超聲提取3 種方案。結(jié)果顯示，渦旋振蕩提取6 類獸藥的回收率85.3%～97.3%，超聲提取的回收率61.3%～79.8%，渦旋振蕩+超聲提取的回收率81.9%～98.6%。表明超聲提取方式的效果相對較差，渦旋振蕩結(jié)合超聲與單獨(dú)渦旋振蕩相比并無明顯提升。最終確定0.5%甲酸甲醇作為提取液，渦旋振蕩作為提取方法。

2.3 凈化條件的設(shè)計(jì)

禽蛋樣品中主要存在的干擾雜物質(zhì)為脂質(zhì)、色素等，本研究使用C18吸附樣液中的雜質(zhì)，選擇使用通過性的方式凈化，盡可能保證非極性物質(zhì)被固相萃取柱吸附。具體操作過程參考國家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，通過5 mL 甲醇活化固相萃取柱，打開C18中的功能基團(tuán)，同時(shí)保障固相萃取柱保持濕潤，從而保證加入樣液之后的凈化效果。本研究在加入樣液后使用10 mL 甲醇進(jìn)行洗脫，一方面保證目標(biāo)物質(zhì)全部通過固相萃取柱，另一方面減少干擾物質(zhì)流出。

2.4 凈化效果

2.4.1 離子流圖

對比圖1 和圖2 可知，目標(biāo)物質(zhì)分離度好，目標(biāo)物質(zhì)保留時(shí)間出峰一致，干擾物質(zhì)響應(yīng)不明顯，對目標(biāo)物質(zhì)分析無影響。對比不同固相萃取柱凈化效果，目標(biāo)物質(zhì)峰形良好，凈化效果基本一致。

圖1 溶劑加標(biāo)的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of labeled pure solution

圖2 基質(zhì)空白加標(biāo)的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of matrix labeled solution

2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)

按實(shí)驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行處理，在空白基質(zhì)溶液中添加6 類獸藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度范圍：5～200 μg/L，以檢出峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/L）得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別計(jì)算與相應(yīng)溶劑校準(zhǔn)曲線斜率的比值，得到6 類獸藥的基質(zhì)效應(yīng)，詳見表4。

表4 6 類獸藥的基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Matrix effect of six veterinary drugs

結(jié)果如表4 所示，對于使用不同C18固相萃取柱的凈化效果，同一種化合物不同凈化樣液的基質(zhì)效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%；磺胺間二甲氧嘧啶、林可霉素、地塞米松、抗蚜威表現(xiàn)為基質(zhì)抑制，四環(huán)素等物質(zhì)表現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)。

2.5 回收率和精密度

按實(shí)驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行處理，分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液，每一組樣品做6 次平行，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中測定回收結(jié)果，計(jì)算平均回收率。

結(jié)果如表5 所示，5 μg/kg 濃度水平下，A 柱加標(biāo)回收的平均回收率為95%～119.1%，精密度為2.6%～13.7%；B 柱加標(biāo)回收的平均回收率為93.6%～103%，精密度為4.1%～8%；C 柱加標(biāo)回收的平均回收率為78.8%～112.2%，精密度為3.9%～14.6%；D 柱加標(biāo)回收的平均回收率為71.4%～105.6%，精密度為3%～10.3%；E 柱加標(biāo)回收的平均回收率為82%～116.1%，精密度為5.4%～15.5%；F 柱加標(biāo)回收的平均回收率為77.6%～104.1%，精密度為3.9%～10.3%。

表5 6 類化合物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）Table 5 Recovery rates and relative standard deviations of six veterinary drugs（n=7）

10 μg/kg 濃度水平下，A 柱加標(biāo)回收的平均回收率為87.7%～104.8%，精密度為0.7%～8.2%；B 柱加標(biāo)回收的平均回收率為87.9%～103.9%，精密度為2.6%～8.3%；C 柱加標(biāo)回收的平均回收率為84.7%～102.9%，精密度為2.3%～8.2%；D 柱加標(biāo)回收的平均回收率為86.5%～105.3%，精密度為0.8%～8.5%；E柱加標(biāo)回收的平均回收率為83.8%～106.3%，精密度為3%～7.9%；F 柱加標(biāo)回收的平均回收率為86.6%～107.7%，精密度為0.8%～5%。

50 μg/kg 濃度水平下，A 柱加標(biāo)回收的平均回收率為83.5%～106.5%，精密度為1.1%～5.9%；B 柱加標(biāo)回收的平均回收率為87.3%～104.9%，精密度為2.1%～6.9%；C 柱加標(biāo)回收的平均回收率為88.5%～100.5%，精密度為3.6%～9.5%；D 柱加標(biāo)回收的平均回收率為92.3%～101.2%，精密度為2.9%～7.8%；E柱加標(biāo)回收的平均回收率為93.7%～108.6%，精密度為4.1%～7.5%；F 柱加標(biāo)回收的平均回收率為92.6%～108.8%，精密度為1.2%～7%。

3 結(jié)論

本研究通過基質(zhì)效應(yīng)、回收率及精密度實(shí)驗(yàn)比較不同固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果顯示，不同萃取柱的凈化效果基本一致，表明不同C18固相萃取柱在鵪鶉蛋中獸藥殘留測定方法均具有一定的凈化效果，國產(chǎn)固相萃取柱可用于鵪鶉蛋中獸藥殘留的測定。針對無法消除基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)，建議使用質(zhì)控樣品或使用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)來校正測定結(jié)果。