范宏博 蔡永洪 李月玥 梁志堅(jiān) 張力玲 馬婷婷 胡松青 胡良勇*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣東廣州 510630；2.廣州計(jì)量檢測技術(shù)研究院）

0 引言

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）定級的I 類致癌物，被列為“12種最危險(xiǎn)的耐藥細(xì)菌” 之一，Hp 感染是全世界人民共同面對的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約90%的非賁門部胃癌與Hp 感染有關(guān)[1]。在我國，Hp感染率約為50%，且Hp 感染是導(dǎo)致胃癌的主要病因，根除Hp 可有效降低胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。

Hp 的致病性源于其分泌的多種毒力因子，其中毒力因子細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A（cagA）和細(xì)胞空泡毒素A（vacA）是Hp 存活和致病的最關(guān)鍵因素[3]。根據(jù)是否含cagA 基因進(jìn)行分類，Hp 可分為cagA 陽性（I型）和cagA 陰性（II 型）菌株。I 型菌株可比II 型菌株引起更嚴(yán)重的胃粘膜損傷和炎癥，以及更高的致癌概率[4]。中國、日本和韓國等東亞國家分離的菌株90%以上含cagA 基因[5]。vacA 基因編碼的空泡毒素能引起細(xì)胞空泡化變性，調(diào)控細(xì)胞的自噬、炎癥和凋亡，還能通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化使Hp 逃避免疫系統(tǒng)的清除[6]。

我國居民的Hp 感染率很高，但對于Hp 感染者是否都要接受治療仍存在爭議，這主要由于不恰當(dāng)?shù)闹委煏?huì)增加耐藥性[7]。而對感染者開展Hp cagA和vacA 基因檢測，測定是否含有毒力基因以及毒力基因含量高低，可作為治療的重要指導(dǎo)依據(jù)。目前，Hp分型和毒力基因含量檢測的方法主要為qPCR法，但qPCR 法無法檢測微量核酸DNA，不適于復(fù)雜樣品或低濃度感染檢驗(yàn)[8-9]。此外，qPCR 法屬于半定量法，需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行拷貝數(shù)定量分析，當(dāng)不同實(shí)驗(yàn)室間采用參考標(biāo)準(zhǔn)不一致時(shí)，qPCR 法檢測結(jié)果的可比性和互認(rèn)性較差。因此，qPCR 法在Hp 分型和毒力基因檢測診斷中存在一定局限[10]。

數(shù)字PCR 法（digital PCR，dPCR）是實(shí)現(xiàn)靶基因拷貝數(shù)絕對定量的第三代PCR 檢測方法，除了兼具普通PCR 法和qPCR 法的優(yōu)點(diǎn)外，還具有高重復(fù)性、高靈敏度和高PCR 抑制劑耐受性，可用微量樣品檢測極低濃度的細(xì)菌或病毒感染[11-12]。目前，已有學(xué)者探究dPCR 法在Hp 毒力基因cagA、vacA 檢測中的應(yīng)用，并證實(shí)dPCR 法比快速脲酶法和尿素呼氣法等傳統(tǒng)檢測方法更靈敏[13-15]。然而，dPCR 法在Hp 毒力基因檢測中的靈敏度、精密度和最適反應(yīng)條件等未見相關(guān)評估研究，不利于該方法的廣泛應(yīng)用和相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立。因此，本研究以Hp 標(biāo)準(zhǔn)菌株為材料，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，探究dPCR法檢測Hp 毒力基因的適用性，旨在為Hp 診療提供更可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

Hp 標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC43504）、金黃色葡萄球菌（ATC C6538）、嗜酸乳桿菌（ATCC4356）、大腸桿菌（ATCC25312）和唾液鏈球菌（ATCC7073）（寧波泰斯拓生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑和儀器

脫纖維羊血、幽門螺旋桿菌固體培養(yǎng)基、幽門螺旋桿菌抑菌劑（海博生物技術(shù)有限公司）；TaqPCR Mastermix、核酸染料、高保真PCR 預(yù)混液、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（YDP302）、DNA Marker DL2000（天根生化科技（北京）有限公司）；微滴發(fā)生卡、2×Supermix 預(yù)混液、可穿透熱封鋁箔、96 孔反應(yīng)板、微滴分析油、微滴發(fā)生卡密封墊、微滴生成儀、QX200 微滴讀取儀、T100 梯度PCR 儀和PX1 熱封儀（Bio-Rad 公司）。

1.3 菌株復(fù)蘇及基因組DNA 提取

取凍存的Hp 菌種，解凍后吸取菌液滴加至配制的固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后在三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。用生理鹽水將培養(yǎng)的Hp 菌落沖洗下來，并吹打成懸浮液。采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取Hp 和大腸桿菌等細(xì)菌的基因組DNA。金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的菌液由直接采購獲得，經(jīng)37℃培養(yǎng)1 h 后，同樣采用試劑盒提取基因組DNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的基因序列，選擇Hp cagA（GQ161098.1）和vacA（AP017632.1）基因，采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)引物和探針。經(jīng)Blast 比對分析獲得最佳引物和探針，cagA引物序列為F-TGAGTGGCTCAAGCTCGTGA，R-CTTG GTGGAAAACTTGAACGAA，探針序列為FAM-CAGA ATAATCTTTCATATTCTT-MGB；vacA 引物序列為F-CAATTCAAAGAGCGCCTAGCC，R-TCATCAGTA TTTCGCACCACACA，探針序列為FAM-TATCCATGCGGTTATTGTTGT-MGB，引物和探針均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.5 檢測體系建立和優(yōu)化

Hp 毒力基因dPCR 檢測體系的反應(yīng)體積為20 μL，初始反應(yīng)體系為：2×Supermix 預(yù)混液10 μL，上游和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，探針0.4 μL，DNA模板1 μL，加滅菌超純水至20 μL；初始PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10 min；95℃30 s，60℃1 min，40 個(gè)循環(huán)；98℃10 min。為優(yōu)化反應(yīng)條件，依次設(shè)置8 個(gè)引物工作濃度和5 個(gè)退火溫度，篩選最佳檢測條件。

Hp dPCR 檢測操作步驟如下：將配置的20 μL反應(yīng)體系加入微滴發(fā)生卡的Sample 孔，將70 μL 微滴生成油加入Oil 孔，覆蓋密封墊并將微滴生成卡置于微滴生成儀中，儀器自動(dòng)制備微滴。將制備的微滴轉(zhuǎn)移至96 孔反應(yīng)板，使用可穿透熱封鋁箔在熱封儀中封膜。將封膜的96 孔反應(yīng)板放入PCR 儀，按設(shè)定條件進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將96 孔反應(yīng)板放入微滴讀取儀，在QuantaSoft 軟件中選擇反應(yīng)孔并填入對應(yīng)信息，測定和采集數(shù)據(jù)。

1.6 檢測特異性評估

以Hp 基因組DNA 為陽性對照，以超純水為空白對照，采用初始dPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，分別對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液鏈球菌的基因組DNA 進(jìn)行檢測，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行特異性評估。

1.7 檢測靈敏度評估

以提取的Hp DNA 為模板，根據(jù)質(zhì)量濃度稀釋至dPCR 法最佳檢測范圍內(nèi)，并采用梯度法進(jìn)一步稀釋。其中，vacA 基因的濃度梯度依次為4 980.0、1 102.0、228.0、18.5、7.3、2.0 和0.7 copies/μL，cagA 基因的濃度梯度依次為4 600.0、1 130.0、171.0、35.5、8.5 和2.2 copies/μL，采用dPCR 法進(jìn)行檢測，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行靈敏度評估。

1.8 檢測精密度評估

以Hp DNA 為模板，各設(shè)置3 個(gè)濃度。其中，vacA基因?yàn)?30.5、54.8 和8.5copies/μL，cagA 基因?yàn)?17.0、48.5 和10.0 copies/μL，采用dPCR 法進(jìn)行檢測（n=6）。根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV），以CV 值評估方法精密度和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針檢驗(yàn)

圖1A 和圖1C 分別為vacA 和cagA 的dPCR檢測散點(diǎn)圖，藍(lán)色微滴為陽性，黑色微滴為陰性，陽性和陰性顯著分成2 簇，且中間彌散的微滴較少，說明擴(kuò)增效果好，且引物和探針特異性良好。圖1B 和圖1D 為特異性檢測的直方圖，左側(cè)低熒光強(qiáng)度的峰為陰性，右側(cè)較高熒光強(qiáng)度的峰為陽性，陰性峰和陽性峰顯著分開，說明引物和探針適用于Hp vacA和cagA 基因定量檢測。

圖1 Hp 毒力基因dPCR 檢測用引物和探針檢驗(yàn)Fig.1 Primers and probes for dPCR detection of Hp virulence genes

2.2 特異性檢驗(yàn)

以唾液鏈球菌、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌和大腸桿菌作為質(zhì)控菌，對Hp 毒力基因cagA 和vacA的dPCR 檢測法進(jìn)行特異性評估，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，以Hp DNA 樣品為模板，針對vacA（圖2A）和cagA（圖2B）的檢測結(jié)果均為陽性，而其他菌種的DNA 檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，該方法在檢測Hp vacA 和cagA 時(shí)不受其他常見菌種的干擾，可滿足特異性要求。

圖2 Hp vacA（A）和cagA（B）的dPCR 檢測特異性檢驗(yàn)Fig.2 Testing of the specificity of dPCR for Hp vacA（A）and cagA（B）

2.3 最佳引物濃度篩選

Hp 毒力基因vacA 和cagA 的dPCR 檢測最佳引物濃度優(yōu)化結(jié)果見圖3，圖中引物工作濃度從左至右依次為：50、150、250、350、450、550、650 和750 nmol/L。由圖3 可知，在引物濃度較高的情況下，陽性微滴和陰性微滴可顯著分開，且熒光強(qiáng)度之差隨引物濃度升高而增大。vacA 基因的熒光強(qiáng)度差在650nmol/L 時(shí)達(dá)到折點(diǎn)（圖3A），cagA 基因的熒光強(qiáng)度差在550 nmol/L時(shí)達(dá)到折點(diǎn)（圖3B），因此，分別選定650 nmol/L 和550 nmol/L 為2 種毒力基因的最佳引物工作濃度。

圖3 Hp 毒力基因dPCR 檢測引物濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization of primer concentration for dPCR detection of Hp virulence genes

2.4 最佳退火溫度篩選

Hp vacA（A）和cagA（B）的dPCR 檢測最佳退火溫度篩選結(jié)果見圖4。圖4A 中的溫度從左至右依次為：52.5℃、55.0℃、57.9℃、60.4℃和62.0℃，各溫度條件下，陽性微滴和陰性微滴均明顯分開，且熒光強(qiáng)度之差隨溫度升高而減小，在55.0℃時(shí)達(dá)到折點(diǎn)，因此選定55.0℃為vacA dPCR 檢測的最佳退火溫度。圖4B 中的溫度從左至右依次為：55.0℃、57.9℃、60.4℃、62.0℃和63.0℃，可知57.9℃為cagA dPCR檢測的最佳退火溫度。

圖4 Hp 毒力基因dPCR 檢測退火溫度優(yōu)化Fig.4 Optimization of annealing temperature for dPCR detection of Hp virulence genes

2.5 靈敏度檢驗(yàn)

檢測靈敏度分析結(jié)果見圖5，圖5A 和5B 為vacA檢驗(yàn)分析圖。線性分析顯示，其擬合度值為R2=0.999 1，線性范圍內(nèi)的相關(guān)性r=0.999，說明在此濃度范圍內(nèi)，該方法可準(zhǔn)確檢測vacA 基因。同理，圖5C 和5D 為cagA 檢驗(yàn)分析圖，線性分析顯示其擬合度值為R2=0.999 5，線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r=0.999，說明在此濃度范圍內(nèi)，該方法可準(zhǔn)確檢測cagA 基因。此外，以滅菌超純水為模板對檢測限進(jìn)行分析，證明該方法對毒力基因vacA、cagA 的檢測限分別為0.26 copies/μL和1.25 copies/μL，即每個(gè)反應(yīng)體系中（20 μL）最少可準(zhǔn)確檢測5.2 和25 個(gè)拷貝。

圖5 Hp 毒力基因dPCR 檢測的靈敏度檢驗(yàn)Fig.5 Sensitivity testing of dPCR detection for Hp virulence genes

2.6 精密度檢驗(yàn)

Hp 毒力基因vacA 和cagA dPCR 法檢測的精密度分析結(jié)果見表1。由表1 可知，在不同樣品濃度條件下，dPCR 檢測毒力基因的變異系數(shù)（CV）均小于10%，表明該方法具有較高的精密度。

表1 Hp 毒力基因dPCR 檢測的精密度檢驗(yàn)Table 1 Precision tests of dPCR detection for Hp virulence genes

3 討論

準(zhǔn)確診斷是防控Hp 感染及相關(guān)疾病的重要前提，目前，針對cagA 和vacA 檢測的方法主要有糞便抗原檢測法、血清抗體檢測法和PCR 法。糞便抗原檢測法需要Hp 達(dá)到一定密度才能檢出陽性，而在感染早期和干預(yù)治療后，Hp 密度較低，易出現(xiàn)假陰性。血清抗體檢測法要求抗體達(dá)到一定濃度，而人體感染Hp 數(shù)周后才產(chǎn)生抗體，且根除Hp 感染后血清抗體可維持6 個(gè)月以上，易造成假陽性[8]。PCR 法具備快速、經(jīng)濟(jì)和靈敏等優(yōu)勢，但RT-PCR 法和qPCR法定量時(shí)需與參考標(biāo)準(zhǔn)比較，目標(biāo)基因擴(kuò)增效率易受復(fù)雜體系影響，且無法檢測微量DNA[16]。dPCR 法是可實(shí)現(xiàn)痕量DNA 直接絕對定量的檢測方法，兼具RT-PCR 法和qPCR 法的優(yōu)點(diǎn)，更有高靈敏度、精準(zhǔn)度和抑制劑耐受性。dPCR 法已逐漸應(yīng)用于稀有病原體檢測、病毒載量檢測和轉(zhuǎn)基因成分分析等領(lǐng)域[17]。

基于dPCR 法的優(yōu)勢，本研究根據(jù)Hp vacA 和cagA 基因設(shè)計(jì)引物與探針，檢驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性微滴與陰性微滴均明顯分離（圖1），說明引物和探針的特異性好，滿足檢測需求。根據(jù)CNAS-GL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》的要求，本研究同時(shí)對dPCR 檢測法的靈敏度和精密度進(jìn)行分析，證明該方法可靈敏地檢測樣品中的Hp DNA，vacA 和cagA基因的檢測限分別低至0.26 copies/μL 和1.25 copies/μL（圖5），并保持較高的精密度（CV<10%）（表1）[18]。對檢測體系的優(yōu)化結(jié)果顯示，vacA 和cagA 基因的最佳引物工作濃度分別為650 nmol/L 和550 nmol/L（圖3），最佳Tm 分別為55.0℃和57.9℃（圖4），此時(shí)陽性微滴和陰性微滴最大分離。此外，dPCR 法在檢測基因載量時(shí)，可直接對樣品中靶標(biāo)基因進(jìn)行絕對計(jì)量，并溯源至國際基本單位摩爾，因而在開展室間質(zhì)控、結(jié)果比對時(shí)具有優(yōu)勢[19]。本研究建立的Hp 毒力基因檢測體系可滿足流行病學(xué)調(diào)查、感染早期和治療后期診斷、室間質(zhì)評、檢測規(guī)范制定和檢測質(zhì)量評估等眾多檢測需求。

4 結(jié)論

本研究建立的Hp 毒力基因vacA 和cagA dPCR檢測體系的靈敏性、特異性和精密性較好，可廣泛適用于Hp 毒力評估的常規(guī)檢測、結(jié)果互認(rèn)和標(biāo)準(zhǔn)制定。Hp 感染是全世界人民共同面對的重要公共衛(wèi)生問題，本檢測體系的建立可為Hp 防控提供一個(gè)更加精準(zhǔn)、可靠的技術(shù)參考。